Name: Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprenda a transferência adotiva estereotáxica de células imunes citotóxicas em modelos murinos de xenotransplantes ortotópicos de glioblastoma multiforme humano. Este método demonstra a viabilidade de imunoterapias celulares intracerebrais.

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Os autores agradecer o pessoal do Hospital Universitário animal instalação (UTE) de Nantes para pecuária e cuidados, o celular e tecidual de imagem facilidade do núcleo da Universidade de Nantes (MicroPICell) para a imagem latente e a facilidade de citometria (Cytocell) de Nantes para sua assistência técnica especializada. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO inter-regional 2017) e o consórcio europeu ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). A equipe é financiada pelo Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Este trabalho foi realizado no contexto do LabEX IGO e os programas IHU-Cesti, suportado pelo nacional investigação Agência Investissements d'Avenir através dos programas ANR-11-LABX-0016-01 e ANR-10-IBHU-005, respectivamente. O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Metropole e a região de Pays de la Loire. Os autores agradecer Chirine Rafia para fornecer ajuda em corrigir o manuscrito.

As procedimento envolvendo animais disciplinas foi realizada segundo as orientações institucionais (acordo #00186.02; Comitê de ética regional de Pays de la Loire [França]). Humano PBMC foram isolada a partir do sangue coletado de doadores saudáveis informados (Etablissement Français du Sang Nantes, França). Todas as etapas são executadas sob condições estéreis.
1. não-específica expansão de linfócitos citotóxicos Effector T
<ol><li>Preparar e irradiar as células alimentador em 35 Gy. Para a estimulação de 2 x 105 - células efetoras de 4 x 105 , prepare-se 10 x 106 PBMCs e 1 x 106 BLCLs de três doadores distintos, saudáveis.</li>
	<li>Resuspenda tanto células alimentador e células efetoras em 15 mL de RPMI suplementado com 10% inactivadas pelo calor FCS, 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (0,1 µ g/mL) e recombinantes IL-2 300 UI/mL.</li>
	<li>Adicionar PHA-L em uma concentração final de 1 µ g/mL, misture cuidadosamente e distribuir 150 µ l de suspensão de célula por bem em placas de 96 poços de fundo U.</li>
	<li>Incube a 37 ° C e com 5% CO2 em um ambiente umidificado.</li>
	<li>Verificar diariamente a placa até grandes células agrupa formulário dos poços de cultura (~ dia 7).</li>
	<li>Transferi as células em um frasco de cultura a 1 x 106 células/mL em meio de cultura fresco.</li>
	<li>Determinar o número total de células por contagem (2x por semana) e mantê-las em 1 x 106 células/mL em meio de cultura fresco. Nota: As células imunes efetoras devem estar prontas para a administração de terapêutica em um estado de repouso (geralmente 3 semanas após o estímulo inicial de amplificação). A pureza e a reatividade destas células efetoras devem ser verificados antes na vivo injeções (por exemplo, com ensaios em vitro ).</li>
</ol>2. preparação de células efetoras pré-operatório
<ol><li>Depois de verificar a contagem de células efetoras, colete as células efetoras em um tubo de 50 mL por centrifugação (300 x g por 5 min). Nota: Para compensar qualquer perda, prepare um excesso de células (por exemplo, 50 x 106).</li>
	<li>Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 15 mL de PBS estéril e centrifugar durante 5 min à 300 x g para executar a lavagem.</li>
	<li>Cuidadosa e completamente remover o sobrenadante e em seguida Ressuspender as células em 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Transferi as células ressuspensa em um microtubo de 1,5 mL por centrifugação a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Cuidadosa e completamente remova o sobrenadante pipetando lentamente.</li>
	<li>Ressuspender as células em 8 µ l de PBS estéril por rato. Nota: Este é um passo crítico.</li>
	<li>Medir o volume da suspensão celular usando uma micropipeta. Se necessário, adicionar PBS estéril (20 x 106 células em 15 µ l de PBS por dose) e misturar cuidadosamente.</li>
	<li>Verificar, por meio de uma micropipeta, que o volume final por rato é entre 15 e 20 μL (imperativamente < 20 µ l).</li>
	<li>Manter as células no gelo até injeção estereotáxica. Nota: mais de 3-h momentos não foram testados.</li>
</ol>3. estereotáxica injeção
<ol><li>
Instalação de equipamento
	<ol>
<li>Montar e calibrar um pequeno quadro estereotáxico animal de acordo com as instruções do fabricante para garantir a precisão das injeções intracranianas (por exemplo, tamanho da seringa, volume desejado e taxa de injeção). Nota: A taxa de infusão lenta é recomendada (ou seja, 2-3 µ l/min).</li>
		<li>Instale o material em um armário de segurança microbiana (MSC) para manter a esterilidade dos instrumentos e para proteger os ratos de infecções. Nota: lugar "blocos isotérmicos" em um banho-maria a 37 ° C. Este sistema limita a hipotermia de ratos durante a cirurgia. Radiante, que são necessárias para o cuidado pós-processual, deve ser usado durante a monitorização contínua da temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de animais pré-operatório
	<ol>
<li>Anestesia um rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (10 mg/mL) e xilazina (0,1 mg/mL) em 10 µ l/g de peso do corpo do mouse.</li>
		<li>Execute um teste do beliscão do dedo do pé para garantir a completa anestesia e analgesia do animal. Nota: Qualquer movimento é uma indicação de analgesia não de profundidade e, se isso ocorrer, mais alguns minutos são necessários antes de repetir a operação.</li>
		<li>Uma vez que o mouse é devidamente anestesiado, use a tesoura para remover a pele do local cirúrgico (entre as duas orelhas, até o nariz).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da pilha pré-operatória
	<ol>
<li>Cuidadosamente, Ressuspender as células com uma pipeta (várias vezes) antes de cada injecção para impedir que qualquer célula aglutinação.</li>
		<li>Desenhe cuidadosamente o volume de suspensão de células necessárias (15-20 µ l) para o microseringa 22-G para evitar a aspiração de bolhas. Nota: Este passo de carregamento de celular para o microseringa é importante para minimizar as variações no volume injetado. Recarrega pilhas para cada injeção individual entre procedimentos para impedir que qualquer célula aglutinação e garantir um número par de administração de células efetoras na coorte.</li>
		<li>Em seguida, coloque a seringa para a bomba de seringa adaptada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuidados processuais
	<ol>
<li>Desinfectar o local cirúrgico com cotonetes embebidos em solução de iodo-povidona 5% pelo menos 3 x.</li>
		<li>Coloque uma pomada oftálmica lubrificante nos olhos do rato, para evitar qualquer secagem de córneas.</li>
		<li>Posição do mouse anestesiado na armação estereotáxica, num bloco isotérmico quente coberto com um filme plástico estéril para manter a temperatura do rato durante a cirurgia e limitar a taxa de mortalidade. Nota: Do mouse nariz e dentes devem ser adequadamente posicionados acima da barra de dente, para assegurar o fluxo respiratório adequado durante o procedimento.</li>
		<li>Uma vez que o mouse está posicionado acima da barra de dente, aperte as barras de orelha firmemente sob as orelhas do rato para imobilizar a cabeça. Nota: Tenha cuidado para não danificar os tímpanos ou comprometer a respiração.</li>
		<li>Fazer uma incisão de 1-2 cm da pele sagital com tesoura estéril, ao longo da parte superior do crânio de anterior posterior para expor o crânio.</li>
		<li>Identifica a interseção das suturas coronais e sagitais (Bregma) para servir como pontos de referência para localização estereotáxica antes da injeção (mostrada na Figura 1).</li>
		<li>Lugar da micro-seringa acima deste ponto.</li>
		<li>Mova a micro-seringa lateral direita 2 mm e 0,5 mm anterior do Bregma.</li>
		<li>Usando um microdrill, faça um pequeno furo no crânio com uma broca estéril coordenadas pré-determinadas. Tenha cuidado para permanecer superficial para evitar qualquer lesão traumática do cérebro. Nota: No presente protocolo, as células imunes foram injetadas dentro um tumor estabelecido (uma semana após a injeção de células de tumor). A pele deve ser reaberto (scar) e a injeção é executada com as mesmas coordenadas usadas para a implantação de células de tumor (o furo geralmente ainda está presente acima de 2 semanas após a injeção). As coordenadas foram selecionadas para injetar células de tumor e efetoras no parênquima cerebral13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injeção de células imunes efetoras
	<ol>
<li>Cuidadosamente Introduza a micro-seringa o orifício perfurado e, movendo-se lentamente, encaminhar a agulha 3 mm para baixo na dura-máter e então para trás 0.5 mm até uma profundidade final de 2,5 mm antes de injetar as células efetoras.</li>
		<li>Executar a injeção de células efetoras em 2-3 µ l/min e monitorar os ratos ao longo do tempo de injeção.</li>
		<li>Uma vez concluída a injeção, retirar a agulha para apenas 1 mm e manter a micro-seringa no lugar por um minuto adicional antes lentamente retirando completamente o microseringa, para evitar qualquer vazamento do local da infusão. Nota: Após a remoção do animal do dispositivo estereotáxico, limpe imediatamente o equipamento de injeção para experiências futuras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuidados pós-operatórios e follow-up de rato
	<ol>
<li>Retire o animal do quadro estereotáxico e imediatamente aplicar solução de 5% de iodo-povidona no local da incisão e fechar a pele com uma sutura cirúrgica adequada.</li>
		<li>Aplicar o gel de lidocaína 2% diretamente sobre a ferida e administrar 0,15 µ g/g de buprenorfina por injeção subcutânea para analgesia pós-processual.</li>
		<li>Lugar de volta o mouse anestesiado para sua jaula sobre uma almofada de aquecimento definida a 37 ° C para manter uma temperatura de corpo do mouse apropriado e evitar qualquer hipotermia. Nota: Alojamento separado não é necessário.</li>
		<li>Monitorar o mouse até que ele está totalmente recuperado da anestesia e transferi-lo para um quarto de habitação. Nota: Até à data, este protocolo é bem suportado como poucas complicações imprevistas ocorreram (< 5% dos ratos injetados).</li>
		<li>Diariamente, monitorar os ratos e sacrificá-los quando qualquer declínio saúde são observados sinais (por exemplo, postura encurvada, mobilidade reduzida, prostração ou perda de peso significativa corpo [≥ 15%]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Uma transferência adotiva de selecionado nativo ou células efetoras imune engenharia representa uma abordagem promissora para tratar eficientemente a tumores, como câncer de cérebro infiltrativa, tendo o cuidado de limitar reatividades contra células não-transformadas15, 16,17,18. No entanto, o sistema nervoso central, que compreende o cérebro, tem um determinado status imune, nomeadamente dev...

GBM (quem grau astrocitoma IV), é o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos. Apesar de tratamentos agressivos que combinam radio-quimioterapia e cirurgia, GBM continua associada com um prognóstico extremamente pobre (sobrevida média de 14,6 meses e um ano-2-mortalidade > 73%)1. Isto evidencia que alguns avanços terapêuticos eficientes foram validados ao longo da última década2. Entre os candidatos para a concepção de estratégias terapêuticas mais eficazes3,4,5, imunoterapias6 são atualmente exploradas para controlar e eliminar altamente invasivo e rádio/quimioterapia-resistente do tumor células, suspeitadas por sua contribuição fundamental para a rápida e fatal tumor recaída7. Vários alvos imunológicos foram identificadas e propostas para imunoterapias, envolvendo natural ou αβ modificado ou linfócitos T de ϒδ como antígenos do tumor GBM específicos ou estresse induzido por moléculas8,9, 10. A possibilidade de administrar efetores de células imunes GBM-reativos selecionados representa uma oportunidade única para entregar quantidades elevadas de linfócitos efetores diretamente no site da malignidade residual. Para oferecer suporte a esta estratégia, nós recentemente demonstraram que modelos baseados em camundongos imunodeficientes carregando ortotópico primários xenografts humanos de GBM fielmente recapitular o desenvolvimento de tumores cerebrais em GBM pacientes9,11. Além disso, estes modelos foram usados para demonstrar a eficiência forte antitumoral de enviaram transferidos linfócitos humanos alogênico de Vϒ9Vδ2T.
Este protocolo descreve as etapas experimentais críticas para alcançar imunoterapias estereotáxica de tumores cerebrais, tais como GBM, com base na transferência adotiva de alogênico linfócitos T. O artigo mostra: (i) a amplificação de linfócitos terapêuticos alogénicos imunes efetoras T, tais como linfócitos humanos Vϒ9Vδ2T; (ii) a preparação destes linfócitos efetores T para injeção; (iii) o processo de administração estereotáxica dentro do cérebro, perto do tumor. Este artigo também fornece insights sobre o comportamento desses efetores celulares após a injeção estereotáxica.
A abordagem terapêutica aqui apresentada baseia-se a injeção de 20 x 106 efetoras células por dose para cada mouse imunodeficientes rolamento-tumor de cérebro. Uma etapa de expansão inicial em vitro é necessária para produzir grandes quantidades de células do sistema imunológico. Portanto, expansões de célula não-específicas são executadas usando a Fitohemaglutinina (PHA-L) e irradiados células alogénicas alimentador: células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis e célula B-lymphoblastoid Epstein Barr vírus EBV-transformado linhas (BLCLs), derivado de PBMC por infecção em vitro com cultura EBV-contendo sobrenadante da linha celular sagui B95-8, na presença de 1 µ g/mL ciclosporina-A.
Células imunes efetoras GBM-reativa são comparadas e selecionadas a partir de vitro ensaios9. Estas células efetoras são ativadas e amplificado usando protocolos padrão, de acordo com sua natureza (por exemplo, de linfócitos humanos Vγ9Vδ2 T9 ou humano anti-herpes vírus αβ T linfócitos12) com uma pureza mínima de > 80%, como rotineiramente verificada pela análise cytometric. O procedimento de expansão celular detalhado abaixo aplica-se a vários subconjuntos de linfócitos humanos.

<table><tbody><tr><td>PBMCs</td><td></td><td></td><td>de 3 doadores saudáveis diferentes</td></tr><tr><td>BLCLs</td><td></td><td></td><td>de 3 doadores diferentes</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>proleucina</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Stoelting Co.</td>Adaptador de mouse <td>51600</td><td></td></tr><tr><td>para quadro estereotáxico&nbsp; &nbsp;</td><td>Fornecedor:Stoelting Co.</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>Injetor de Bomba de Microsseringa&nbsp;</td>Seringa <td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos NSG</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave; ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td>Rompur 2%</td><td></td></tr> <tr><td>Tesoura</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115 / 230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico glioblastoma multiforme xenografts

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos, é geralmente associada com um prognóstico pobre e escassas eficientes terapias têm sido propostas ao longo da última década. Entre os candidatos promissores para a concepção de novas estratégias terapêuticas, imunoterapias celulares têm sido alvo para eliminar altamente invasivo e células tumorais de quimio-radioresistant, provavelmente envolveram em uma recaída rápida e fatal de câncer. Assim, organismos de alogênico GBM-reativa efetores célula imune, como linfócitos T Vϒ9Vδ2 humanos, nas proximidades do tumor que representa uma oportunidade única para entregar eficiente e altamente concentrado agentes terapêuticos diretamente para o site de malignidades do cérebro. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito pré-clínicos para a viabilidade e a eficácia antitumoral destes imunoterapias celulares que dependem de injeções estereotáxica de linfócitos humanos alogênico dentro camas de tumor intrabrain.

Este estudo descreve a estratégia de transferência adotiva de células efetoras imune celular dentro do cérebro de camundongos portadores de tumor, baseado em injeções estereotáxica realizadas diretamente dentro da cama do tumor.
Para minimizar qualquer risco de lesão cerebral associada com um volume grande de injeção, a suspensão de células efetoras precisa ser concentrado (20 x 106 células em 15-20 µ l de PBS). Para ...

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

O glioblastoma multiforme continua sendo o tumor cerebral primário mais frequente e agressivo em adultos. Apesar dos tratamentos agressivos baseados em cirurgia seguida de rádio e quimioterapia, o GBM está associado a um prognóstico extremamente ruim e uma sobrevida média inferior a 15 meses. Como poucos avanços terapêuticos foram feitos na última década, as imunoterapias celulares são atualmente exploradas para eliminar células GBM altamente invasivas e resistentes, provavelmente envolvidas na rápida recidiva do tumor.administrações de fatores imunotóxicos citotóxicos reativos ao GBM selecionados nas proximidades do tumor podem representar uma oportunidade única de administrar imunoterapia celular concentrada, diretamente no local da malignidade residual. Nosso grupo mostrou recentemente que camundongos NSG imunodeficientes portadores de xenoenxerto de GBM humano primário ortotópico recapitulam o GBM para mais desenvolvimento em pacientes. Esses modelos de GBM foram usados para avaliar a eficácia de efetores imunes citotóxicos em injeções intratumorais.Este protocolo descreve nosso processo terapêutico baseado primeiro no isolamento e amplificação de células efetoras imunes reativas ao GBM. Em segundo lugar, a propagação dessas células efetoras para injeção intercraniana. E terceiro, sua injeção estereotáxica no local do tumor dentro do cérebro do camundongo.O comportamento do efetor imune após a injeção ortotópica também foi investigado. Três semanas após a estimulação do feto PHA, as células efetoras, que formam aglomerados de células no fundo do frasco, devem ter retornado ao estado de repouso e estão prontas para serem usadas. Depois de verificar a contagem de células efetoras, ressuspenda e colete as células em tubo de 115 mililitros e centrifugue-as.Remova com cuidado e completamente um sobrenadante. E ressuspenda as células em PBS estéril e centrifugue para lavá-las. Tire o sobrenadante com cuidado e completamente.E então ressuspenda as células em um mililitro de PBS estéril. Transfira as células em um microtubo para centrifugação. Novamente, retire o sobrenadante com cuidado e completamente pipetando lentamente.O próximo passo é crítico, ressuspender as células na metade do volume final de PBS estéril e homogeneizar suave e cuidadosamente. Verifique o volume final com micropipeta, o volume final por camundongo deve estar entre 15 e 20 microlitros para 20 milhões de células. Certifique-se de que não excederá 20 microlitros por mouse.Mantenha as células no gelo até a injeção. Certifique-se de que o animal esteja adequadamente anestesiado por uma pitada no dedo do pé e, em seguida, remova o pelo do local da cirurgia, entre as duas orelhas e até o nariz. Ressuspenda as células lentamente para evitar a aglomeração de células e carregue a suspensão das células na seringa com muito cuidado para evitar a presença de bolhas.Em seguida, coloque a seringa na bomba de seringa adaptada. Desinfete o local da cirurgia com sal e solução de iodopovidona a 5% e coloque uma pomada oftálmica lubrificante nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento da córnea. Em seguida, posicione o mouse anestesiado no quadro estereotáxico em um bloco quente.Posicione adequadamente o nariz e os dentes do mouse acima da barra do dente. Aperte as barras auriculares firmemente nas orelhas do mouse para imobilizar a cabeça. Tenha cuidado para não danificar os tímpanos, comprometer a respiração e certifique-se de que a cabeça esteja bem imobilizada.Faça uma incisão na pele sagital da linha média com uma tesoura estéril ao longo da parte superior do crânio para expor o crânio. Identifique a interseção das estruturas sagital e coronal para servir como pontos de referência para a localização estereotáxica e coloque a seringa acima desse ponto. Mova a seringa em coordenadas predeterminadas.Dois milímetros lateral direito e 0,5 milímetro anterior do Usando uma microbroca, faça um pequeno orifício no crânio com broca estéril. Tenha cuidado para permanecer superficial para evitar lesões cerebrais. Insira a seringa cuidadosamente no orifício perfurado.Mova lentamente a agulha três milímetros para frente na dura-máter e, em seguida, para trás 0,5 milímetro até uma profundidade final de injeção de células de 2,5 milímetros. Execute a injeção de células a dois ou três microlitros por minuto e monitore os camundongos durante todo o tempo de injeção. Quando a injeção estiver concluída, retire a agulha por apenas um milímetro e mantenha a seringa no lugar por mais um minuto antes de retirar lentamente completamente a seringa para evitar qualquer vazamento do local da infusão.Remova cuidadosamente o animal do quadro estereotáxico. Feche a pele com sutura cirúrgica apropriada e aplique o gel de lidocaína a 2% diretamente na ferida. Transfira o camundongo anestesiado para sua respectiva gaiola acima da almofada de aquecimento ajustada para 37 graus Celsius para manter a temperatura corporal adequada do camundongo até a recuperação total da anestesia.Como a suspensão é muito concentrada, a viabilidade e a reatividade celular foram verificadas. As células efetoras foram carregadas em seringa para mimetizar a injeção in vivo. As células foram coletadas imediatamente ou 10 minutos depois e analisadas por citometria de fluxo para coloração com iodeto de propídio.Como você pode ver, o preparo e o carregamento não afetaram a viabilidade das células efetoras em 24 horas. A reatividade contra células tumorais de glioblastoma também foi verificada usando células não preparadas ou efetores preparados e permaneceu três horas nos olhos. A reatividade é monitorada pela coloração positiva do marcador de ativação CD107A.Esses resultados demonstram que a reatividade das células efetoras não foi afetada pela preparação. Sete dias após a injeção das células efetoras, os cérebros dos camundongos foram coletados, seccionados e corados para coloração hemática para permitir a identificação da estrutura tumoral. Em seguida, a coloração anti-CD3 humana permitiu a localização de células efetoras.Curiosamente, células efetoras foram encontradas ao redor do tumor e no núcleo do tumor, mas também no hemisfério contralateral. As células T efetoras humanas isoladas do cérebro de camundongo 48 horas após a injeção representam 2% das células cerebrais. Eles ainda foram capazes de proliferar na presença de PHA, alimentadores e estimulação de IL2, com 99% de pureza após a amplificação.Graças a este protocolo, as células efetoras humanas em repouso podem sobreviver e patrulhar com um parênquima cerebral de camundongo por vários dias após a injeção estereotáxica. Em conclusão, a transferência adotiva de células efetoras humanas por injeções estereotáxicas representa abordagens promissoras para tratar eficientemente tumores cerebrais malignos infiltrativos com efeitos deletérios limitados em células saudáveis. Essa via de administração aproveita que as células humanas são entregues próximas ao local do tumor, limitando sua diluição nos tecidos e no organismo.Aqui descrevemos o procedimento após a entrega de uma grande quantidade de células imunes dentro do tumor cerebral sem efeitos nocivos nas células efetoras e, mais importante, sem qualquer efeito deletério visível em camundongos. Além disso, as células imunes injetadas localmente no cérebro de camundongos não são apenas capazes de sobreviver e manter sua capacidade de serem ativadas e amplificadas ex vivo, mas também de eliminar células tumorais disseminadas no tecido cerebral circundante. Coletivamente, essas características são essenciais para permitir a eliminação de células tumorais infiltrativas fortes que caracterizam os tumores de GBM.Este protocolo abre uma nova oportunidade para o estabelecimento de procedimento de transferência adotiva em camundongos modelo de tumor cerebral. Etapa essencial antes de considerar a DC clínica.

stereotactic-adoptive-transfer-cytotoxic-immune-cells-murine-models

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um método integrado para a implantação, precisa estereotáxica de células de glioblastoma multiforme humano no cérebro de camundongos nude e série...

Implantação estereotáxica intracraniana e<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent de xenoenxertos de tumores em um Sistema Modelo de Rato Glioblastoma Multiforme

Este vídeo demonstra uma técnica de injeção estereotáxica para administrar linfócitos T efetores humanos em um modelo murino portador de um tumor cerebral humano. Ao posicionar um camundongo anestesiado com tumor em uma estrutura estereotáxica e criar um orifício de rebarba no local da injeção no crânio, os linfócitos T efetores são injetados no local do tumor.

Entrega de linfócitos T efetores em camundongos portadores de tumores cerebrais humanos

Gliomas malignos constituem um grupo heterogêneo de neoplasias gliais altamente infiltrativas com características clínicas e moleculares distintas. Xenograftos ortotópicos primários recapitulam as características histopatológicas e moleculares de subtipos de glioma malignos em modelos animais pré-clínicos.

Glioma Xenoenxertos Ortotópicos Primários Recapitulam crescimento infiltrativo e isocitar mutação desidrogenase I

Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.

Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

O cérebro é um local único, com qualidades que não são bem representados por análises in vitro ou ectópicas. Ortotópico modelos de mouse com localização e características de crescimento reprodutíveis podem ser criados de forma confiável com injeções intracranianas utilizando um instrumento de fixação estereotáxica e uma bomba de seringa de baixa pressão.

Criando anatomicamente precisos e reprodutíveis intracraniana Xenoenxertos de tumores cerebrais humanos

Os efeitos linfodepletivos e imunomoduladores do padrão de tratamento da quimioterapia e radiação podem ser aproveitados para aumentar a eficácia antitumoral da imunoterapia com células T. Descrevemos um método para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas do EGFRvIII e administrá-las no contexto do tratamento padrão de glioblastoma.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

Tumor-buscando terapêuticas tronco células mesenquimais (MSCs) mostram a promessa como um tratamento para glioblastoma invasiva. Transplante de ideal envolve entrega de MSCs na cavidade de ressecção do tumor em andaimes. Aqui, pré-clínicos técnicas para estudar o tratamento de MSC do glioblastoma são fornecidas incluindo: ressecção de tumor guiada por imagem; implantação do MSC-semeado andaimes; e terapia pós-operatória de rastreamento.

Ressecção guiada por imagem de Glioblastoma e intracraniana implantação de andaimes terapêuticos de células-tronco-semeado

Aqui, descrevemos um modelo ortotópico pré-clínico em camundongos para GBM, estabelecido por injeção intracraniana de células derivadas de tumores modelo de camundongos geneticamente modificados. Este modelo exibe as características da doença do GBM humano. Para estudos translacionais, o tumor cerebral de camundongo é rastreado por ressonância magnética in vivo e histopatologia.

Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme

O desenvolvimento de modelos ortotópicos de tumores cerebrais pediátricos requer precisão meticulosa, usando um dispositivo estereotáxico para implantar células cancerígenas com precisão. A metodologia apresentada aqui descreve as etapas envolvidas na preparação de células tumorais cerebrais, na realização de injeções intracranianas e na implementação de um sistema de monitoramento pós-operatório para avaliar o enxerto de tumor cerebral.

Estabelecimento de modelos ortotópicos de xenoenxerto derivados de pacientes para tumores cerebrais usando um dispositivo estereotáxico

O glioblastoma é uma forma devastadora de câncer cerebral primário, e a terapia térmica intersticial a laser está emergindo como uma alternativa promissora à ressecção cirúrgica convencional para glioblastoma inoperável. Este protocolo descreve um modelo de camundongo pré-clínico otimizado que pode ser usado para estudar os efeitos do tratamento ou tratamentos adjuvantes e combinatórios.

Um modelo murino imunocompetente para terapia térmica intersticial a laser de glioblastoma

O objetivo desse protocolo é fornecer aos pesquisadores uma técnica altamente reprodutível para implantações intracranianas.

Implantação intracraniana estereotáxica de linhagens celulares de xenoenxerto derivadas de Glioblastoma em Pacientes

Aprenda a transferência adotiva estereotáxica de células imunes citotóxicas em modelos murinos de xenotransplantes ortotópicos de glioblastoma multiforme humano. Este método demonstra a viabilidade de imunoterapias celulares intracerebrais.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts (Vídeo) | JoVE Journal

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

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