Name: Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a medir a contratilidade isométrica da artéria mesentérica de camundongo usando miografia de fio. Este método permite avaliar a função do músculo liso vascular e triar novos relaxantes para tratamento da hipertensão.

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Agradecemos He de Qi de Wei de Dr. (Universidade de Soochow, Suzhou, China) e Dr. Yan Ning Qiao (Shaanxi Normal University, Xi ' an, China) pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant, 31272311, 81373295 e 81473420) e o projeto financiado pela prioridade acadêmica programa desenvolvimento de Jiangsu instituições de ensino superior (Grant no. ysxk-2016).

Manipulações de animais foram aprovadas pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade modelo Animal Research Center de Nanjing.
1. preparação da solução
<ol><li>Preparar a solução de Tyrode-HEPES (H-T) usando 137,0 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glicose e 10 mM HEPES, pH 7.3-7.4.</li>
	<li>Preparar a solução de Tyrode HEPES sem cálcio (Ca2 +-livre H-T) usando 140,6 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2∙6H2O, 5,6 mM D-glicose e 10 mM HEPES, pH 7.3-7.4.</li>
	<li>Preparar a solução de Tyrode HEPES usando 124 mM KCl (alta K+) usando 15,7 mM NaCl, 124,0 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2∙6H2O, pH de 5,6 mM D-glicose e 10 mM HEPES, 7.3-7.4.</li>
</ol>2. preparação do experimento
<ol><li>Pré-aqueça o H-T e High-K+ soluções usando banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>Ligue o sistema de myograph, o hardware de aquisição de dados e o computador.</li>
	<li>Com cuidado, encha todas as câmaras de myograph com 5 mL de solução de H-T cada.</li>
	<li>Preencher dois pratos de Petri com 20 mL de 4 ° C H-T e Ca2 +-livre soluções H-T, respectivamente e armazenar no gelo.</li>
	<li>Encha um prato de Petri 10 cm revestido com 20 mL de solução de H-T e mantê-lo em temperatura ambiente.</li>
</ol>3. Mouse dissecação de artéria mesentérica
<ol><li>Eutanásia em um 8-12-week-old C57BL/6J masculino ou feminino do mouse por deslocamento cervical. Segure o mouse com o abdômen voltado para cima.</li>
	<li>Umedeça o abdômen com etanol a 70%. Em seguida, cortar a pele com a tesoura ao longo da linha mediana ventral da virilha e fazer incisões desde o início da primeira incisão para baixo para as pernas em ambos os lados. Puxamos a pele para trás em ambos os lados; Faça incisões semelhantes para abrir o peritônio.</li>
	<li>Com uma tesoura, corte o esófago, cólon e outros tecidos conectivos para isolar completamente o trato gastrointestinal com alimentação vasculatura do corpo.</li>
	<li>Com fórceps, mova o segmento isolado na cápsula contendo o frio H-T preparado no passo 2.4 e delicadamente, lave o tecido na solução H-T várias vezes para lavar o sangue.</li>
	<li>Transferir o segmento isolado para o prato de Petri revestida, preparado na etapa 2.5 e faz dissecação da artéria mesentérica em temperatura ambiente.</li>
	<li>Suavizar o estômago, jejuno, íleo e ceco no sentido horário, e fixar o estômago e o ceco no lado esquerdo e direito, respectivamente.</li>
	<li>Esticar a cama da vasculatura mesentérica e corrigir o intestino com pinos para expor as artérias mesentéricas dissecadas. Nota: Nestas condições, as artérias estão no topo das veias.</li>
	<li>Ligue a fonte de transmissão de luz de um microscópio estereoscópico e dissecar as artérias sob o microscópio. Certifique-se de que o tecido inteiro está imerso na solução.</li>
	<li>Prenda os tecidos adiposo em torno das artérias com fórceps e isolar as artérias cortando todos os tecidos conjuntivos com tesoura de dissecação. Evite ferir as artérias.</li>
</ol>4. arterial montagem
<ol><li>Transferência e imergir a árvore de artéria mesentérica o frio Ca2 +-livre solução do H-T (preparada na etapa 2.4), fixando as artérias em excesso com a pinça.</li>
	<li>Corte uma parte de 1,4 mm da artéria proximal à parede intestinal de uma arcada mesentérica e usar duas pinças para abrir ambos os lados deste segmento de artéria cuidadosamente.</li>
	<li>Prepare-se dois segmentos de 2,5 cm de comprimento de fio de aço inoxidável e colocá-los no mesmo prato.</li>
	<li>Delicadamente, prenda uma extremidade da artéria usando fórceps e Introduza cuidadosamente os dois fios no lúmen da artéria um por um com a ajuda de outra pinça. Certifique-se que os fios são mantidos em linha reta e não toque o endotélio.</li>
	<li>Usando duas pinças, prenda os dois fios de aço fora do navio roscado simultaneamente e transferir cuidadosamente o navio do prato de Petri a uma câmara de myograph anteriormente preenchida com solução de H-T (passo 2.3).</li>
	<li>Que se lixe os mordentes separados para fazer espaço para montagem. Prenda os dois lados de um dos dois fios inseridos usando duas pinças e coloque o recipiente na abertura mandíbula (figura 1A).</li>
	<li>Envolva ambos os lados do fio preso por parafusos da mandíbula conectado para o micrômetro (figura 1B).</li>
	<li>Fixe o parafuso esquerdo girando no sentido horário. Endireitar o fio usando fórceps da direita e, em seguida, fixar o parafuso da direita girando no sentido horário (Figura 1). Certifique-se de que o navio está sempre dentro da abertura da mandíbula, mas não toque no queixo para evitar danos.</li>
	<li>Feche as duas mandíbulas usando o micrômetro (Figura 1). Certifique-se que as duas garras estão perto o suficiente, mas que não tocam uns aos outros e que o fio não fixado na parte superior do fio fixo.</li>
	<li>Usando a pinça direita, cuidadosamente dobre o fio retirado no canto da mandíbula conectado para forçar o transdutor e envolvê-la no sentido horário em torno do parafuso do lado direito (Figura 1E). Em seguida, fixe o parafuso. Repita essa etapa no lado esquerdo do fio e fixar o parafuso do lado esquerdo (Figura 1F).</li>
	<li>Mova a mandíbula ligeiramente afastada girando cuidadosamente o micrômetro (Figura 1). Evite esticar o navio. Use a pinça para mover o fio no lado de micrômetro para o plano horizontal do fio ao lado do transdutor. Gire o micrômetro cuidadosamente para que a lacuna entre as duas garras só pode acomodar os dois fios.</li>
	<li>Repita as etapas 4.2 – 4.11 para montar as artérias para as outras câmaras. Conecte todas as câmaras para o equipamento, cobrir as câmaras, anexar o fornecimento de oxigênio a 100% e uma sonda de temperatura e começar aquecendo-se a 37 ° C. Abra o software de gráfico e pressione o botão Iniciar na janela de Visualização de gráfico para iniciar a gravação.</li>
	<li>Equilibrar-se por cerca de 20 min.</li>
</ol>5. normalização
Nota: A fim de padronizar as condições experimentais e obter a capacidade de resposta fisiológica confiável dos navios, um processo de normalização é necessário15. De acordo com a relação entre a força activa e a circunferência interna do navio, o sistema de myograph do fio tem um programa de normalização de padrão para avaliar a circunferência interna (IC) do navio montado5,8, 9. Brevemente, calcular IC (µm), ler o micrômetro e o valor de entrada como o valor de X e o transdutor de saída de força, ou seja, descansando a tensão parede (mN/mm), como o valor de Y. O programa irá retornar uma curva equipada de (X, Y) e calcular o IC correspondente à pressão transmural de 100 mmHg (IC100). A embarcação é definida como a circunferência interna normalizada (IC1) quando a capacidade de resposta ativa é máxima.
<ol><li>Conjunto de forças para zero para todos os canais no dispositivo e equilibrar por mais 1-2 minutos.</li>
	<li>Selecione configurações de normalização do "menu DMTe configurar os parâmetros da seguinte forma: Calibração de ocular (mm/div): 0,36; Alvo de pressão (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; On-line com média de tempo (segundos): 2; Atraso de tempo (segundos): 60. Clique no botão para fechar a janela de Configurações de normalização de DMT Okey .</li>
	<li>Selecione o canal de interesse do menu de DMT para abrir uma janela de normalização de DMT para o canal correspondente. Inserir os valores constantes na janela da seguinte forma: a1 de pontos de extremidade de tecido: 0.1; A2 de pontos de extremidade de tecido: 4; Diâmetro de fio (µm): 40. A janela exibe o comprimento do navio calculado como 1,40 mm.</li>
	<li>Leia o micrômetro da câmara de tecido apropriado. Digite o valor na caixa de leitura do micrômetro e clique o botão Adicionar ponto . Esse valor é o valor inicial de X (X0). Depois de um tempo de atraso 60 s, a janela exibe a força e a pressão eficaz (ERTP) correspondente a esse valor de micrômetro. Simultaneamente, a caixa de leitura micrômetro se torna ativa.</li>
	<li>Estica o navio sendo normalizado girando o micrômetro no sentido anti-horário. Digite o valor de micrômetro na caixa de leitura do micrômetro e clique o botão Adicionar ponto . Esperar por um tempo de atraso de 60 s novamente.</li>
	<li>Repita a etapa 5.5, continuar a esticar o navio e adicionar valores de micrômetro até a janela exibe o valor de "micrômetro X1", que é a configuração de micrômetro calculado necessária para esticar a embarcação para sua IC1.</li>
	<li>Defina o micrômetro para X o valor1 . Nota: A tensão normalizada é geralmente 1-2 mN.</li>
</ol>6. artéria contração gravação
Nota: Todas as soluções, incluindo o H-T e High-K+ solução usado nesta seção, foram preparadas na etapa 2.1.
<ol><li>Após a normalização, equilibrar o navio na câmara para 15-20 min. Nota: Estas é nenhuma necessidade de mudar a solução nesta etapa.</li>
	<li>Desafie o recipiente com solução High-K+ duas vezes.<ol>
<li>Para desafiar o navio, substitua a solução H-T com 5 mL de solução de High-K+ para induzir a contração por 10 min, seguido por lavagem com 5 mL de solução de H-T 3 - 4 vezes. Nota: Contração típica tem uma força máxima sobre 3 mN e uma força constante e sustentada em torno de 2,5 mN12. Se o primeiro desafio gera uma força máxima abaixo de 2,5 mN ou a força sustentada diminui com o tempo ou o segundo desafio gera uma força muito menor do que a dose pela primeira vez, o navio é Descartado e não será usado para investigação futura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desafie o vaso com 5 mL de solução de High-K+ para induzir a contração. Depois de 5 min, adicione 0,5 µ l de solução-mãe (10mm em DMSO) neoliensinine14 na câmara para relaxar o navio em uma concentração final de 1 µM de neoliensinine.</li>
	<li>Quando a força é estável (isto geralmente leva vários minutos), adicionar outra 0,5 μL de solução-mãe de neoliensinine na câmara para aumentar a concentração de µ l 2 µM. adicionar 1 da solução-mãe cada vez para aumentar a concentração de 4, 6, 8 e 10 µM para gerar t curva de dose-resposta. Nota: O estoque e as concentrações de trabalho variam entre drogas.</li>
</ol>

<ol><li>Bevan, J. A., Osher, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+method+for+recording+tension+changes+in+the+wall+of+small+blood+vessels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+and+Actions%22%5BJournal%5D)">A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro.</a> Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).</li>
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<li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+Properties+of+Small+Arterial+Resistance+Vessels+in+Spontaneously+Hypertensive+and+Normotensive+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats.</a> Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).</li>
<li>Mulvany, M. J., Nyborg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increased+calcium+sensitivity+of+mesenteric+resistance+vessels+in+young+and+adult+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats.</a> British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).</li>
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<li>Crowley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+the+kidney+and+systemic+tissues+in+blood+pressure+regulation+by+the+renin-angiotensin+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).</li>
<li>Qiao, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+phosphatase+target+subunit+1+%28MYPT1%29+regulates+the+contraction+and+relaxation+of+vascular+smooth+muscle+and+maintains+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+myosin+light+chain+kinase+in+regulation+of+basal+blood+pressure+and+maintenance+of+salt-induced+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).</li>
<li>Yang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+a+tribenzylisoquinoline+alkaloid+from+Nelumbo+nucifera+Gaertn%2C+a+novel+potential+smooth+muscle+relaxant%5BTitle%5D)+AND+%22Fitoterapia%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant.</a> Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).</li>
<li>Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Normalization+Factor+for+Wire+Myography+of+Rat+Femoral+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery.</a> Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).</li>
<li>Kearney, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+hypertension%3A+analysis+of+worldwide+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of hypertension: analysis of worldwide data.</a> The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).</li>
<li>Good, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Ion+Buffers+for+Biological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Ion Buffers for Biological Research.</a> Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Hipertensão é um desafio da saúde pública generalizada devido a suas complicações graves, incluindo cardiovascular e renal doenças16. Compreender a patogênese da hipertensão e explorar mais anti-hipertensivos drogas tornou-se uma tarefa urgente neste campo. Pressão arterial é gerado e mantido pela resistência periférica da circulação. De acordo com a lei de Poiseuille, as relativamente pequenas artérias geram uma grande proporção de resistência circulatória e servem como o produtor dominante de pr...

O sistema de myograph de pequeno vaso usado aqui foi para medir a contração isométrica dos vasos de resistência pequena com diâmetro interno que variam de 100 a 400 µm. isolados pequenos vasos (cerca de 2 mm de comprimento) foram inseridos por dois fios de diâmetro de 40 µm e foram então montado sobre as garras do micrômetro-lado e lado do transdutor sequencialmente. Esta técnica de myograph foi sugerida primeiramente em 19721 e então desenvolvida principalmente por Mulvany e seus colegas2,3,4,5,6. Agora é uma técnica madura com equipamento estável, desempenho fácil e um padrão de normalização procedimento7,8,9. Utilizamos este método com algumas modificações para medições na artéria mesentérica de rato.
Músculo liso vascular as linhas das paredes de quase todos os vasos sanguíneos. Sua função fundamental é gerar forças através da contração em resposta a vários estímulos. A contratilidade normal do músculo liso vascular é essencial para a regulação da pressão de sangue e nutrição complementar10. Regulamento anormal da pressão arterial resulta em uma variedade de doenças, incluindo hipertensão, insuficiência cardíaca e isquemia. Vários estudos têm sugerido que a pressão anormal de sangue sempre é associada com disfuncional músculo liso vascular contratilidade7,11,12,13. O método myograph permite investigação da contratilidade isométrica dos navios de rato induzida por vários estímulos, incluindo vasoconstritores, inibidores e drogas. Medições bem sucedidas de contração nos ajudará a compreender os mecanismos de manutenção da pressão arterial e a patogênese de doenças associadas a músculo liso vasculares e explorar novas abordagens terapêuticas.
Muitas ervas chinesas têm sido amplamente utilizadas para tratamento clínico de doenças vasculares; no entanto, seus ingredientes eficazes geralmente permanecem desconhecidos. Assim, o isolamento e identificação dos componentes eficazes é muito importante para o desenvolvimento de novos medicamentos. Tecnologia multi fio myograph oferece uma abordagem simples para a seleção de componentes ativos em ervas. Nós temos relatado vários estudos utilizando o sistema de myograph de pequeno vaso para investigar a contração de artéria mesentérica de rato e identificados compostos naturais com atividade anti-hipertensão12,13,14. Aqui, descrevemos o detalhada do protocolo para o método de myograph e avaliar o efeito relaxante do neoliensinine isolada de embriões de sementes de Lótus (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14.

<table><tbody><tr><td>Sistema de miógrafo multifios</td><td>DMT</td><td>610-M</td><td></td></tr><tr><td>Fio de aço inoxidável</td><td>DMT</td><td>400447</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecção Geuder</td><td>DMT</td><td>400431</td><td></td></tr><tr><td>pinça Dumont</td><td>DMT</td><td>300413</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab/8SP</td><td>ADInstruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>ADInstruments</td><td>LabChart 5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>SigmaAldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>D-Glicose</td><td>SigmaAldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100511-0250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SigmaAldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica mouse usando fio miografia

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

A técnica de myograph do fio é usada para avaliar a contratilidade da musculatura de Lisa vascular em resposta à despolarização, GPCR agonistas/inibidores e drogas. É amplamente utilizado em muitos estudos sobre as funções fisiológicas do músculo liso vascular, a patogênese de doenças vasculares, como hipertensão e desenvolvimento de fármacos relaxante músculo liso. O rato é um animal modelo amplamente utilizado com uma grande piscina de doença modelos e variedades geneticamente modificadas. Nós introduzimos esse método para medir a contração isométrica de artéria mesentérica de rato em detalhe. Um segmento de 1,4 mm da artéria mesentérica resistência de rato foi isolado e montado em uma câmara de myograph, passando dois fios de aço por meio de seu lúmen. Após etapas de equilíbrio e normalização, o segmento de navio foi potencializado por uma solução de alta-K+ duas vezes antes do ensaio de contração. Como um exemplo da aplicação desse método no desenvolvimento de drogas, Nós medimos o efeito relaxante de uma substância natural romance, neoliensinine, isolado de uma erva chinesa, embriões da semente de Lótus (Nelumbo nucifera Gaertn.) no mouse mesentérico artérias. Os segmentos de embarcação montados na câmara de myograph foram estimulados com uma solução de alta-K+ . Quando a força de tensão atingiu uma fase estável e sustentada, doses cumulativas de neoliensinine foram adicionadas para a câmara. Encontramos que essa neoliensinine teve um efeito relaxante dose-dependente na contração do músculo liso, sugerindo assim, que tem atividade potencial contra a hipertensão. Além disso, como o segmento de navio pode sobreviver pelo menos 4 horas após a montagem e manter a contratilidade induzida pela solução high-K+ por muitas vezes, sugerimos que o sistema de myograph do fio pode ser utilizado para o moroso processo de despistagem de drogas.

Podemos medir a contratilidade isométrica de artéria mesentérica de rato usando um sistema multi fio myograph e avaliou o efeito relaxante da neoliensinine purificado a partir de embriões de sementes de Lótus (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14. a artéria mesentérica resistência do rato foi isolada, limpo dos tecidos conjuntivos e cortada em segmentos de 1,4 mm. O segmento de artéria foi inserido por dois fios de aço em Ca2 +-livre solução H-T em uma ...

A técnica de myograph do fio é usada para investigar as funções do músculo liso vascular e tela novas drogas. Nós relatamos um protocolo detalhado para medir a contratilidade isométrica da artéria mesentérica de rato e para a seleção de novos relaxantes do músculo liso vascular.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Nosso laboratório tem usado o método de miografia de fio para medir a contratilidade do músculo liso vascular por muitos anos. Usamos essa técnica para estudar o mecanismo de contração do músculo liso. Usamos esse método para explorar novos medicamentos para a terapia da hipertensão.A principal vantagem dessa técnica é que o segmento do vaso sobrevive pelo menos quatro horas após a montagem e mantém a contratilidade induzida pelo potássio elevado por muitas vezes. O sistema multicanal oferece a oportunidade de triagem de alta terapia de novos medicamentos. Prenda o corpo do camundongo sacrificado com o abdômen voltado para cima e umedeça o abdômen com etanol 70%.Então, depois de usar uma tesoura para cortar a pele ao longo da linha média ventral da virilha, faça incisões em cada perna desde o início da primeira incisão. Puxe a pele para trás em ambos os lados e, em seguida, faça incisões semelhantes para abrir o peritônio. Em seguida, use uma tesoura para cortar o esôfago, cólon e outros tecidos conjuntivos para isolar completamente o trato gastrointestinal com a vasculatura de alimentação do corpo.Depois de enxaguar o sangue do trato gastrointestinal com HEPES-Tyrode, ou solução HT, transfira o segmento isolado para uma placa de Petri revestida para dissecção da artéria mesentérica à temperatura ambiente. Alise o estômago, jejuno, íleo e ceco no sentido horário e prenda o estômago e o ceco no lado esquerdo e direito, respectivamente. Ligue a fonte de luz de transmissão de um microscópio estereoscópico e fixe o intestino com pinos para expor as artérias mesentéricas dissecadas.Em seguida, prenda os tecidos adiposos ao redor das artérias com uma pinça e isole cuidadosamente as artérias cortando todos os tecidos conjuntivos com uma tesoura de dissecação. Segure uma artéria em excesso com uma pinça e transfira e mergulhe a árvore da artéria mesentérica em uma solução HT fria sem íons de cálcio. Corte uma porção de 1,4 milímetro da artéria proximal à parede intestinal de uma arcada mesentérica e use duas pinças para abrir cuidadosamente os dois lados desse segmento arterial.Prepare dois segmentos de fio de aço inoxidável de 2,5 centímetros de comprimento e coloque-os no mesmo prato. Use uma pinça para prender suavemente uma extremidade da artéria. Em seguida, use outra pinça para inserir cuidadosamente dois fios no lúmen da artéria, um por um.Certifique-se de que os fios sejam mantidos retos e não toquem no endotélio. Usando duas pinças, prenda os dois fios fora do vaso rosqueado simultaneamente e transfira cuidadosamente o vaso da placa de Petri para uma câmara de miógrafo cheia de solução HT. Aparafuse as garras da câmara para abrir espaço para a montagem, depois segure os dois lados de um dos dois fios inseridos usando duas pinças e coloque o vaso na abertura da mandíbula.Enrole os dois lados do fio clamped em torno dos parafusos da mandíbula conectados ao micrômetro. Fixe o parafuso do lado esquerdo girando no sentido horário. Em seguida, use uma pinça para endireitar o fio.Em seguida, fixe o parafuso do lado direito girando no sentido horário. Certifique-se de que o vaso esteja sempre dentro da abertura da mandíbula, mas não toque na mandíbula para evitar danos. Feche as duas garras usando o micrômetro.Certifique-se de que as duas garras estejam próximas o suficiente, mas que não se toquem e que o fio não fixado esteja em cima do fio fixo. Usando a pinça direita, dobre cuidadosamente o fio desparafusado no canto da mandíbula conectado ao transdutor de força e enrole-o no sentido horário ao redor do parafuso do lado direito. Em seguida, fixe o parafuso.Repita o desdobramento e o enrolamento do lado esquerdo do fio e fixe o parafuso do lado esquerdo. Em seguida, afaste ligeiramente as mandíbulas sem esticar o vaso, girando cuidadosamente o micrômetro para que o espaço entre as duas mandíbulas possa acomodar apenas os dois fios. Em seguida, use uma pinça para mover o fio no lado do micrômetro para o plano horizontal do fio no lado do transdutor.Depois de montar as artérias nas outras câmaras, conecte todas as câmaras ao equipamento e cubra as câmaras. Conecte o suprimento de oxigênio a 100% e uma sonda de temperatura e comece a aquecer a 37 graus Celsius. Abra o software de gráficos.Pressione o botão Iniciar para iniciar a gravação. Selecione o canal de interesse no menu DMT para abrir a janela de normalização DMT para o canal correspondente. Insira os seguintes valores constantes na janela:Pontos finais de tecido a1, 0,1; Pontos finais do tecido a2, 4; Diâmetro do fio, 40.A janela exibe o comprimento calculado do vaso como 1,40 milímetros. Leia o micrômetro da câmara de tecido apropriada. Insira o valor na caixa de leitura do micrômetro e clique no botão Adicionar ponto.Este valor é o valor inicial de X.Após um atraso de 60 segundos, a janela exibe a força e a pressão efetiva correspondentes a este valor do micrômetro. Simultaneamente, a caixa de leitura do micrômetro fica ativa. Estique o vaso que está sendo normalizado girando o micrômetro no sentido anti-horário.Insira o valor do micrômetro na caixa de leitura do micrômetro e clique no botão Adicionar ponto'botão. Aguarde novamente um tempo de atraso de 60 segundos. Continue a esticar o recipiente e adicione valores de micrômetro até que a janela exiba o valor do micrômetro X-one, que é a configuração de micrômetro calculada necessária para esticar o recipiente até seu IC-um.Defina o micrômetro para o valor X-um. Após a normalização, equilibre o vaso na câmara por 15 a 20 minutos. Uma vez equilibrado, desafie o vaso com solução de alto teor de potássio, substituindo a solução de HT por 5 mililitros de solução de alto teor de potássio para induzir a contração por 10 minutos.Depois de repetir a incubação de 10 minutos em solução fresca com alto teor de potássio, lave com cinco mililitros de solução HT três a quatro vezes. Novamente, desafie o vaso com cinco mililitros de solução com alto teor de potássio para induzir a contração. Após cinco minutos, adicione 0,5 microlitros da solução estoque de Neoliensinine na câmara para relaxar o vaso na concentração final de um micromolar Neoliensinina.Quando a força estiver estável após vários minutos, adicione mais 0,5 microlitros de solução estoque de Neoliensinine para aumentar a concentração para dois micromolares. Adicionar um microlitro da solução-mãe de cada vez para aumentar a concentração para quatro, seis, oito e 10 micromolares para gerar a curva dose-resposta. Durante o procedimento de normalização, o vaso foi esticado várias vezes até atingir o valor de IC-100 e cada ciclo de alongamento incluiu uma contração robusta, relaxamento rápido e uma manutenção de força em 60 segundos.A contração do músculo liso vascular induzida por solução de alto teor de potássio geralmente apresentava duas fases, uma fase robusta e uma fase sustentada. Descrevemos um método para medir a contratilidade isométrica da artéria mesentérica de camundongos usando um sistema de miografia multifios. Este método pode ser usado para avaliar as funções do músculo liso vascular e para rastrear relaxantes do músculo liso.A principal diferença entre este método e outros está nas etapas de montagem. Esta etapa usada aqui é fácil de executar e não danifica o tecido ou o dispositivo. Após este procedimento, outros estimuladores como EP e Angiotensina II também podem ser usados para estimular a contração do músculo liso, a fim de encontrar alguns novos medicamentos sensíveis a este agonista.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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