Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

Nosso laboratório tem usado o método de miografia de fio para medir a contratilidade do músculo liso vascular por muitos anos. Usamos essa técnica para estudar o mecanismo de contração do músculo liso. Usamos esse método para explorar novos medicamentos para a terapia da hipertensão.

A principal vantagem dessa técnica é que o segmento do vaso sobrevive pelo menos quatro horas após a montagem e mantém a contratilidade induzida pelo potássio elevado por muitas vezes. O sistema multicanal oferece a oportunidade de triagem de alta terapia de novos medicamentos. Prenda o corpo do camundongo sacrificado com o abdômen voltado para cima e umedeça o abdômen com etanol 70%.

Então, depois de usar uma tesoura para cortar a pele ao longo da linha média ventral da virilha, faça incisões em cada perna desde o início da primeira incisão. Puxe a pele para trás em ambos os lados e, em seguida, faça incisões semelhantes para abrir o peritônio. Em seguida, use uma tesoura para cortar o esôfago, cólon e outros tecidos conjuntivos para isolar completamente o trato gastrointestinal com a vasculatura de alimentação do corpo.

Depois de enxaguar o sangue do trato gastrointestinal com HEPES-Tyrode, ou solução HT, transfira o segmento isolado para uma placa de Petri revestida para dissecção da artéria mesentérica à temperatura ambiente. Alise o estômago, jejuno, íleo e ceco no sentido horário e prenda o estômago e o ceco no lado esquerdo e direito, respectivamente. Ligue a fonte de luz de transmissão de um microscópio estereoscópico e fixe o intestino com pinos para expor as artérias mesentéricas dissecadas.

Em seguida, prenda os tecidos adiposos ao redor das artérias com uma pinça e isole cuidadosamente as artérias cortando todos os tecidos conjuntivos com uma tesoura de dissecação. Segure uma artéria em excesso com uma pinça e transfira e mergulhe a árvore da artéria mesentérica em uma solução HT fria sem íons de cálcio. Corte uma porção de 1,4 milímetro da artéria proximal à parede intestinal de uma arcada mesentérica e use duas pinças para abrir cuidadosamente os dois lados desse segmento arterial.

Prepare dois segmentos de fio de aço inoxidável de 2,5 centímetros de comprimento e coloque-os no mesmo prato. Use uma pinça para prender suavemente uma extremidade da artéria. Em seguida, use outra pinça para inserir cuidadosamente dois fios no lúmen da artéria, um por um.

Certifique-se de que os fios sejam mantidos retos e não toquem no endotélio. Usando duas pinças, prenda os dois fios fora do vaso rosqueado simultaneamente e transfira cuidadosamente o vaso da placa de Petri para uma câmara de miógrafo cheia de solução HT. Aparafuse as garras da câmara para abrir espaço para a montagem, depois segure os dois lados de um dos dois fios inseridos usando duas pinças e coloque o vaso na abertura da mandíbula.

Enrole os dois lados do fio clamped em torno dos parafusos da mandíbula conectados ao micrômetro. Fixe o parafuso do lado esquerdo girando no sentido horário. Em seguida, use uma pinça para endireitar o fio.

Em seguida, fixe o parafuso do lado direito girando no sentido horário. Certifique-se de que o vaso esteja sempre dentro da abertura da mandíbula, mas não toque na mandíbula para evitar danos. Feche as duas garras usando o micrômetro.

Certifique-se de que as duas garras estejam próximas o suficiente, mas que não se toquem e que o fio não fixado esteja em cima do fio fixo. Usando a pinça direita, dobre cuidadosamente o fio desparafusado no canto da mandíbula conectado ao transdutor de força e enrole-o no sentido horário ao redor do parafuso do lado direito. Em seguida, fixe o parafuso.

Repita o desdobramento e o enrolamento do lado esquerdo do fio e fixe o parafuso do lado esquerdo. Em seguida, afaste ligeiramente as mandíbulas sem esticar o vaso, girando cuidadosamente o micrômetro para que o espaço entre as duas mandíbulas possa acomodar apenas os dois fios. Em seguida, use uma pinça para mover o fio no lado do micrômetro para o plano horizontal do fio no lado do transdutor.

Depois de montar as artérias nas outras câmaras, conecte todas as câmaras ao equipamento e cubra as câmaras. Conecte o suprimento de oxigênio a 100% e uma sonda de temperatura e comece a aquecer a 37 graus Celsius. Abra o software de gráficos.

Pressione o botão Iniciar para iniciar a gravação. Selecione o canal de interesse no menu DMT para abrir a janela de normalização DMT para o canal correspondente. Insira os seguintes valores constantes na janela:Pontos finais de tecido a1, 0,1; Pontos finais do tecido a2, 4; Diâmetro do fio, 40.

A janela exibe o comprimento calculado do vaso como 1,40 milímetros. Leia o micrômetro da câmara de tecido apropriada. Insira o valor na caixa de leitura do micrômetro e clique no botão Adicionar ponto.

Este valor é o valor inicial de X.Após um atraso de 60 segundos, a janela exibe a força e a pressão efetiva correspondentes a este valor do micrômetro. Simultaneamente, a caixa de leitura do micrômetro fica ativa. Estique o vaso que está sendo normalizado girando o micrômetro no sentido anti-horário.

Insira o valor do micrômetro na caixa de leitura do micrômetro e clique no botão Adicionar ponto'botão. Aguarde novamente um tempo de atraso de 60 segundos. Continue a esticar o recipiente e adicione valores de micrômetro até que a janela exiba o valor do micrômetro X-one, que é a configuração de micrômetro calculada necessária para esticar o recipiente até seu IC-um.

Defina o micrômetro para o valor X-um. Após a normalização, equilibre o vaso na câmara por 15 a 20 minutos. Uma vez equilibrado, desafie o vaso com solução de alto teor de potássio, substituindo a solução de HT por 5 mililitros de solução de alto teor de potássio para induzir a contração por 10 minutos.

Depois de repetir a incubação de 10 minutos em solução fresca com alto teor de potássio, lave com cinco mililitros de solução HT três a quatro vezes. Novamente, desafie o vaso com cinco mililitros de solução com alto teor de potássio para induzir a contração. Após cinco minutos, adicione 0,5 microlitros da solução estoque de Neoliensinine na câmara para relaxar o vaso na concentração final de um micromolar Neoliensinina.

Quando a força estiver estável após vários minutos, adicione mais 0,5 microlitros de solução estoque de Neoliensinine para aumentar a concentração para dois micromolares. Adicionar um microlitro da solução-mãe de cada vez para aumentar a concentração para quatro, seis, oito e 10 micromolares para gerar a curva dose-resposta. Durante o procedimento de normalização, o vaso foi esticado várias vezes até atingir o valor de IC-100 e cada ciclo de alongamento incluiu uma contração robusta, relaxamento rápido e uma manutenção de força em 60 segundos.

A contração do músculo liso vascular induzida por solução de alto teor de potássio geralmente apresentava duas fases, uma fase robusta e uma fase sustentada. Descrevemos um método para medir a contratilidade isométrica da artéria mesentérica de camundongos usando um sistema de miografia multifios. Este método pode ser usado para avaliar as funções do músculo liso vascular e para rastrear relaxantes do músculo liso.

A principal diferença entre este método e outros está nas etapas de montagem. Esta etapa usada aqui é fácil de executar e não danifica o tecido ou o dispositivo. Após este procedimento, outros estimuladores como EP e Angiotensina II também podem ser usados para estimular a contração do músculo liso, a fim de encontrar alguns novos medicamentos sensíveis a este agonista.