Name: Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprenda a gravar potenciais de ação em cardiomiócitos ventriculares derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando sensores de voltagem codificados geneticamente e imagem óptica de alta resolução.

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Este trabalho foi financiado por doações da Fundação alemã de pesquisa (Si 1747/1-1), a outra Kröner-Fresenius-Stiftung e a Deutsche Stiftung für Herzforschung.

1. preparação dos Cardiomyocytes iPSC-derivado para a imagem latente
Nota: Métodos de diferenciação de cultura e cardíaca de iPSC foram publicados antes de12,13,14 e não serão discutidos aqui em detalhes. A purificação de iPSC-CMs microdissection manual, separação magnética celular ou seleção de lactato é recomendada, dependendo do protocolo de diferenciação utilizado. Para o seguinte protocolo, microdissected explantes de bater áreas, geradas usando uma monocamada diferenciação protocolo13, foram tiradas no dia 15 de uma diferenciação cardíaca e cultivadas até o dia 30 de placas revestidas de fibronectina, conforme descrito antes das10.
<ol><li>Levar a célula pratos de cultura fora da incubadora e coletar manualmente os explantes cardíacas em tubos microcentrifuga usando uma pipeta de 200 µ l. Depois da sedimentação, aspirar a sobrenadante de cultura celular e delicadamente lavar os explantes 2x com Hank está equilibrado sal solução (HBSS).</li>
	<li>Dissociar o iPSC-CMs por adicionar colagenase tipo II (430 U/mL em HBSS) e incube-os a 37 ° C por 30 min.</li>
	<li>Após a sedimentação da célula grande restante agrupa, recolher o sobrenadante que contém o único dissociado iPSC-CMs e adicione isto ao meio de manutenção CM fresco contendo uma concentração alta de soro fetal bovino (FBS) (DMEM-F12, 20% FBS, 2mm L-Glutamine, 1: 100 MEM não aminoácidos essenciais, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina e β-Mercaptoetanol de 0,1 mM).</li>
	<li>Repita a dissociação se permanecem aglomerados de células grandes. Colete único iPSC-CMs por centrifugação e Resuspenda os meio de CM, contendo uma baixa concentração de FBS (2% FBS).</li>
	<li>Re-sementes iPSC-CMs único em uma densidade permitindo que as imagens subsequentes de células individuais em um 3,5 cm vidro-fundo microdish de cultura celular que foi revestida com fibronectina (2 µ g/cm2). Otimize a densidade de semeadura antes de engajar-se em experiências de alta produtividade. Geralmente, 5 – 10 explantes cardíacas por prato de 3,5 cm são suficientes; no entanto, esta fortemente depende do tamanho do explante e pureza.</li>
	<li>Cultura do único iPSC-CMs após sua dissociação em meio de manutenção CM contendo 2% FBS pelo menos 48 h para garantir uma recuperação suficiente. Nota: Nas próximas etapas, o iPSC-CMs é transfectado com um lentivirus GEVI VSFP-CR sob o controle de um intensificador de MLC2v 10 para alcançar uma expressão de GEVI ventricular específica de codificação. Alternativamente, construções de Lentivirus que permite expressar a GEVI especificamente em nodal ou atrial-células, ou uma construção inespecíficas, abrigando o promotor PGK ubiquitously-expresso, pode ser usado10. Particulas de Lentivirus plasmídeos estão disponíveis mediante pedido. Cuidado: Ao trabalhar com particulas de Lentivirus, certifique-se de que o ambiente de trabalho tem o nível de biossegurança adequadas, respeitar as instruções de segurança para trabalhar com agentes potencialmente infecciosos e tome as precauções de segurança necessárias.</li>
	<li>Preparar o meio de infecção misturando o lentivirus10-contendo cultura de pilha sobrenadante, que tem sido produzida em células HEK293 conforme descrito antes de15, com meio de manutenção de CMs (consulte a etapa 1.3) em uma proporção de 1:1.</li>
	<li>Adicione brometo de hexadimethrine em uma concentração final de 8 µ g/mL para melhorar a eficiência da infecção. Nota: Devido à infecção de alta eficiência de iPSC-CMs concentração prévia de lentivirus através de ultracentrifugação geralmente não é necessária.</li>
	<li>Aspire o meio de manutenção de CM do único iPSC-CMs e substituí-lo por meio de infecção preparado durante as etapas 1.7 e 1.8. Cultura do iPSC-CMs único infectado no meio de infecção por 12 horas a 37 ° C. Em seguida, Aspire o meio e substituí-lo novamente por meio de manutenção do CM. Nota: Um sinal de fluorescência da GEVI aparece 48 h após a infecção. Uma imagem das gravações de potencial de membrana é recomendada, 72 h após a infecção, na melhor das hipóteses, para assegurar uma força de sinal adequada. Único infectados iPSC-CMs podem ser cultivadas pelo menos 3 semanas e cuja imagem sequencialmente. Se extensa fotobranqueamento ocorre durante uma sessão de imagens, o sinal de fluorescência se recupera ao longo do tempo.</li>
	<li>Antes de imagem, trocar o meio de cultura celular pela solução de Tyrode suplementada com Ca2 + (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, glicose 10 mM, 1.8 mM CaCl2e 10 mM HEPES; pH 7,35).</li>
</ol>2. óptica membrana potencial gravações
<ol><li>Coloque a câmara de imagens contendo o iPSC-CMs no palco de um microscópio de epifluorescência invertido equipado com um divisor de imagem, os conjuntos de filtro apropriado e uma câmera (por exemplo, uma câmera sCMOS) capaz de imagem de alta velocidade em alta sensibilidade. Nota: por exemplo, uso uma excitação de passa-banda 480/40 nm filtro combinado com 500 nm passe longo dicroicas espelho no microscópio, e um espelho dicroico passe longo de 568 nm combinado com 28/520 nm e filtros de emissão de passa-banda 630/75 nm no separador imagem. Para a imagem latente de célula única, um objectivo de imersão de óleo de alta ampliação, alta--abertura numérica fornece a melhor relação sinal-ruído.</li>
	<li>Se a estimulação elétrica é necessário, instalar os eletrodos de estimulação na câmara de imagens e conectá-los a um gerador de estímulo. Nota: Usamos um ritmo baixo-relevo que continha dois eléctrodos de platina e equipado para os pratos de cultura 3,5 cm vidro-fundo celular. As células localizadas entre os eletrodos foram fotografadas. Parâmetros de estimulação típicos são pulsos retangulares de 5 ms de duração, com uma amplitude de 10 V/cm de distância de eletrodo.</li>
	<li>Opcionalmente, use um palco de microscópio aquecida para garantir uma temperatura estável de iPSC-CMs durante a geração de imagens, ou mesmo uma configuração de câmara de incubação microscópio se destina-se a longo prazo imagem.</li>
	<li>Traga as células para se concentrar e coloque uma célula expressando a GEVI no centro do campo de visão. Nota: Isto é feito mais convenientemente usando as oculares do microscópio usando uma proteína verde fluorescente (GFP) ou um vermelho proteína fluorescente (RFP) filtro definido para identificar células expressando a GEVI.</li>
	<li>Defina o caminho óptico, para que a luz emitida é roteada para o divisor de imagem. Alternar o cubo do filtro no microscópio para esse para ser combinado com os filtros no separador imagem (consulte a Tabela de materiais).</li>
	<li>No software controlar a câmera, defina as configurações de aquisição para que a imagem latente de alta velocidade (por exemplo, 100 frames por segundo, com um tempo de exposição de 10 ms por quadro) é possível. Nota: Normalmente, isso envolve o binning de pixels da câmera (por exemplo, 8x8 pixels do chip câmera são guardados para gerar um pixel no filme lapso de tempo).</li>
	<li>Configure o divisor de imagem de acordo com as instruções do fabricante. As duas imagens que representam as duas bandas de comprimento de onda de emissão diferentes devem ser adjacentes uns aos outros, cada um ocupando metade da imagem. Nota: Este passo tem de ser realizada somente 1 x no início de cada sessão de imagens.</li>
	<li>Verificar e, se necessário, ajustar o foco da imagem produzida pela câmera.</li>
	<li>Ajustar o brilho da luz iluminação é evitar qualquer saturação dos pixels; Isto pode ser feito facilmente usando uma paleta de cores na qual pixels saturados são representados por uma cor única. Nota: Durante todos estes preparativos antes da imagem latente, limitar a exposição da amostra à excitação leve a quantidade necessária (ou seja, não deixe a luz acesa por longos períodos de tempo) para evitar o fotobranqueamento da GEVI.</li>
	<li>Configurar a aquisição da série de tempo (por exemplo, 5.000 imagens em 100 frames por segundo durante uma série de 50 s). Dim a luz no quarto (incluindo monitores de computador) para evitar a luz influencia a medição. Se o obturador de luz de excitação não é controlado pelo software da imagem latente, abri-lo pouco antes de iniciar a aquisição.</li>
	<li>Inicie a aquisição da série imagem. Se a estimulação elétrica é desejada, inicie a sequência de estimulação no ponto de tempo apropriado, a menos que é iniciado automaticamente pelo software da imagem latente. Se a aplicação de um agente farmacológico é procurada, fazer isto manualmente (por exemplo, por pipetagem 100 µ l do agente em uma concentração final dez vezes para a câmara de gravação contendo 900 µ l de tampão e delicadamente, misturando-o com a pipeta) ou usando um sistema de fluxo constante de perfusão.</li>
	<li>Quando a aquisição for concluída, feche o obturador de luz de excitação, se necessário. Salve a gravação para o disco rígido.</li>
	<li>Deixando as configurações de gravação (ou seja, tempo de exposição, taxa de quadros e intensidade da luz) inalteradas, realizar uma gravação da fluorescência fundo (como na etapa 2.11) sobre uma região da lamela não contendo células ou sobre outra lamela sobre o qual não as células têm sido semeadas. Nota: Se as medições sequenciais são executadas sem alterar as configurações de aquisição, apenas uma gravação de fluorescência de fundo é necessária para todas as medições.</li>
	<li>Se desejado, realizar experiências adicionais (etapas 2.4 – 2.13) em diferentes iPSC-CMs localizados na mesma lamela. Esteja ciente de que todos os CMs na lamela serão afetados no caso de uma droga foi aplicada.</li>
</ol>3. análise
> Nota: Dependendo do software de imagem usado (que geralmente é um pacote de software proprietário fornecido pelo fabricante da câmera ou a fluorescência de toda sistema de imagem), pode ser possível realizar a análise das imagens adquiridas em parte ou mesmo inteiramente dentro deste pacote de software. No entanto, aqui um fluxo de trabalho de análise de imagem que pode ser executada com o software de código aberto (ou seja, a plataforma de análise de imagem ImageJ)16, que pode ser convenientemente instalado usando uma distribuição como Fiji17e o pacote de dados R computação estatística18 são descritos. Resumidamente, as regiões de interesse (ROIs), que representa células ou plano de fundo são desenhadas no ImageJ e média fluorescência nestes ROIs ao longo do tempo é exportada para um arquivo para ser, então, mais analisados em R ou, alternativamente, com software de planilha.
<ol><li>No software de imagens, salvar ou exportar a série de tempo imagem adquirida (a gravação contendo as células e a gravação de fundo correspondente) para um formato (por exemplo, TIF) que pode ser lido pelo ImageJ. Como alternativa, use o plugin BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), que fornece rotinas permitindo ImageJ ler formatos de arquivo proprietários de diferentes marcas de fabricantes de sistema de imagem. Observação: As etapas a seguir assumem que os intervalos de imagens são as mesmas em toda a gravação. Se isso não for o caso, pode ser necessário exportar as informações de tempo a partir do software da imagem latente e incluí-lo na uma análise mais aprofundada.</li>
	<li>Abra a pilha TIF que contém as células no ImageJ.</li>
	<li>Use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar um ROI mais um casos fluorescente no canal vermelho. Certifique-se de que o ROI é grande o suficiente para que a célula não se move fora do ROI enquanto contratantes.</li>
	<li>Abra o plugin Gerenciador de ROI ('Analyze | Ferramentas | Gerente de ROI') e pressione o botão 'Adicionar [t]' para adicionar este ROI como ROI1.</li>
	<li>Arraste o ROI sobre a mesma célula em canal verde e adicionar este ROI como ROI2.</li>
	<li>No ' analisar | Conjunto de medições menu, desmarque todas as opções exceto 'Quer dizer cinza valor'. Nota: Isto tem que ser feito apenas 1x em uma sessão do ImageJ.</li>
	<li>No Gerenciador de ROI, pressione a ' mais | Medida de multi' botão. Selecione as opções 'Medir todas as fatias' e 'Uma linha por fatia' e pressione 'Okey'. Abre uma janela contendo uma planilha com três linhas (o número de fatias e a fluorescência média no dois ROIs que representa a célula no vermelho e no canal da mancha verde, respectivamente).</li>
	<li>Uso ' arquivo | Salvar como para salvar a planilha em um arquivo de valores separados por vírgula (CSV).</li>
	<li>Feche a janela com a pilha de imagem e a janela de planilha sem fechar a janela do Gerenciador de ROI. Abra a pilha TIF que contém a medida de fundo.</li>
	<li>No Gerenciador de ROI, pressione a ' mais | Medida de multi' botão. Selecione as opções 'Medir todas as fatias' e 'Uma linha por fatia' e pressione 'Okey'.</li>
	<li>Uso ' arquivo | Salvar como de salvar a planilha com os dados de fundo em outro arquivo CSV. Nota: Os cálculos a seguintes podem ser feitos com o software de planilha eletrônica. Usamos o software de R18. Um exemplo simples de script que lê os dados de célula e plano de fundo dos arquivos "cell.csv" e "background.csv" executa os cálculos e traça o curso do tempo do sinal do potencial de membrana é fornecido como complementar 1 arquivo de código.</li>
	<li>Desde a gravação de fundo, calcule a intensidade média no vermelho e no canal da mancha verde. Subtraia este sinal de fundo de sinais que representa a célula no canal vermelho e verde para calcular RFP de correção de fundo e sinais GFP, respectivamente.</li>
	<li>Como um substituto para o potencial de membrana, calcule a relação RFP/GFP. Nota: Esta relação é adimensional. Alternativamente, ele pode ser normalizado para o seu valor inicial (ou seja, ΔR/R0). Importante, útil informações estão contidas as mudanças temporais e não em valores absolutos desta relação. Devido à desigual fotobranqueamento a GFP e RFP, pode ocorrer uma deriva de base este rácio. Se necessário, tal deriva de uma linha de base pode ser corrigida por construir uma curva de base e isso subtraindo o RFP/GFP relação10.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método descrito aqui permite que uma gravação óptica de APs de um subtipo específico (ou seja, células ventriculares) de CMs gerado a partir de iPSCs humana. IPSC-CMs humanos são uma ferramenta emergente para resolver uma enorme variedade de problemas biológicos e médicos, e a diferenciação de diferentes subtipos de CM é uma importante fonte de variabilidade experimental. Usando elementos específicos do promotor, a expressão de um GEVI especificamente é alcançada em CMs que representa o subtipo de interesse, q...

Cardiomyocytes (CMs) derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma ferramenta emergente para dissecar os mecanismos moleculares da doença de coração, para investigar novas terapias e a tela para drogas cardíacos adversos efeitos1,2 ,3. Desde o início, arrhythmogenic doenças como canalopatias têm sido um importante foco desta área de investigação4. Consequentemente, métodos para investigar fenótipos elétricos do CMs, como arritmias ou alterações em morfologias do potencial de ação (AP), são o cerne desta tecnologia.
Uma consideração importante na aplicação de iPSC-CMs é que protocolos de diferenciação cardíaca atual não resulta em uma população homogênea de células. Em vez disso, eles são uma mistura de células, assemelhando-se a nó sinusal, atrial e CMs ventriculares em diferentes níveis de maturação5,6,7,8. Esta heterogeneidade pode ser uma fonte relevante de variabilidade experimental, especialmente se são investigados parâmetros como duração de AP (APD), que intrinsecamente diferem entre os subtipos CM (por exemplo, a APD é menor no atrial do que em CMs ventriculares). A abordagem convencional para resolver este problema é para investigar único iPSC-CMs usando o método de braçadeira do remendo e classificar cada célula como nodal-, atrial-, ou como ventricular, com base na sua morfologia AP9. Qualquer análise subsequente pode ser restringido em seguida para as células que representa o subtipo CM de interesse. A grande desvantagem dessa estratégia é seu throughput limitado e a falta de escalabilidade. Além disso, a natureza invasiva da eletrofisiologia de braçadeira do remendo não permite a imagem das mesmas células sequencialmente durante períodos de tempo prolongado.
Aqui, nós fornecemos detalhes experimentais em um método10 desenvolvido para imagem opticamente APs em subtipos específicos de iPSC-CMs. Isso supera o problema da heterogeneidade do subtipo e aumenta drasticamente o throughput em comparação com os métodos convencionais, permitindo a rápida fenotipagem de iPSC-CMs carregando variantes genéticas ou sendo agentes expostos a farmacológica.
Visão geral da abordagem de imagem óptica subtipo específico
Um indicador de tensão geneticamente codificado (GEVI), cujas propriedades de fluorescência mudam após a despolarização e repolarização da membrana celular, é usado para imagem opticamente alterações do potencial de membrana da CMs. O GEVI aplicado aqui é a proteína fluorescente sensor de voltagem VSFP-CR11, que consiste em um domínio transmembrana sensor de tensão, fundido a um par de um verde (trevo) e uma proteína fluorescente vermelha (mRuby2) (figura 1A). Devido a grande proximidade dos dois fluorophores, a excitação da proteína verde fluorescente resulta em uma fração da energia da excitação sendo transferida para a proteína fluorescente vermelha através de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET). Portanto, a excitação da proteína verde fluorescente resulta em uma emissão de ambos o verde e as proteínas fluorescentes vermelhas (figura 1A, painel superior). Quando a célula depolarizes, um rearranjo estrutural do sensor de tensão ocorre que se traduz em uma reorientação das duas proteínas fluorescentes, aumentando a eficiência do FRET. Assim, ainda mais a energia de excitação é transferida de verde para a proteína fluorescente vermelha (figura 1A, painel inferior). Como resultado, em uma célula despolarizada, a emissão de fluorescência verde é redutor, e a emissão de fluorescência vermelha é mais brilhante do que em uma célula no potencial de membrana (figura 1B) a descansar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig1.jpg"> Figura 1: imagem ótica da membrana potencial com CR. VSFP (A), A diagrama esquemático mostrando a ação da proteína fluorescente sensível à tensão QUE VSFP-CR é mostrado. Após a despolarização da membrana celular, um rearranjo estrutural no domínio transmembranar do sensor de tensão se traduz em uma reorientação do verde (GFP) e vermelha (RFP) fluorescente da proteína, aumentando a eficiência da intramolecular Förster transferência de energia de ressonância (FRET). Espectros (B) a emissão de um VSFP em cima da excitação da GFP em células com o potencial de membrana de repouso (painel superior) e em células despolarizadas (painel inferior) são retratados. A mudança espectral após a despolarização é exagerada para maior clareza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As mudanças na eficiência FRET espelhando as flutuações do potencial de membrana são fotografadas usando um microscópio de fluorescência, equipado com um divisor de imagem, que separa a emissão de fluorescência vermelha e verde e projeta-los sobre duas áreas adjacentes de o chip de uma câmera de sCMOS (Figura 2). Com esta configuração, a emissão de fluorescência em duas bandas de comprimento de onda diferente pode ser gravada simultaneamente, que permite o cálculo de um rácio de fluorescência verde-vermelho-para refletir o potencial em cada imagem de uma lapso de tempo série de membrana.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig2.jpg"> Figura 2: configuração do sistema de geração de imagens. Os principais componentes do sistema de imagem usados para imagem as mudanças espectrais da proteína fluorescente tensão sensível as alterações de potencial de membrana em uma alta resolução temporal de espelhamento são retratadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A expressão de VSFP-CR em CMs é conseguida Lentivirus transdução. Para direcionar a expressão para o subtipo CM de interesse, o lentivirus contém um elemento de promotor (o MLC2v enhancer) que especificamente drives transcrição em ventricular como iPSC-CMs10. Quando o iPSC-CMs que representam uma mistura de células semelhantes a atrial, nodal, como e ventricular, como é transfectado com este lentivirus, VSFP-CR é expresso apenas nas células como ventricular. Uma vez que a imagem latente ótica potencial de ação depende deste sensor fluorescente, os potenciais de ação gravados exclusivamente representam o subtipo CM de interesse (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58134/58134fig3.jpg"> Figura 3: expressão de VSFP orientada por promotor para a imagem latente de potencial de membrana do subtipo específico. (um) este esquema mostra como gravações de potencial de ação óptico subtipo específico de casos são atingidas. (b) iPSC-CMs infectados com um VSFP sob o controle do atrapalha-MLC2v ventricular específicas são mostrados. A expressão do sensor de tensão é observada somente em CMs ventricular, como no canal de GFP (painel esquerdo). O contraste de fase (painel central) e a imagem de superposição (painel direito) também são fornecidos. Linhas brancas pontilhadas marcam limites da célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58134/58134fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>-Mercaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 Médio</td><td>Invitrogen</td><td>21331046</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Soro Fetal Bovino)</td><td>Invitrogen</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I Suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>L-Glutamina alternativa</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina plasma bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo II</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de hexadimetrina (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>aumentando a infecção lentiviral</td></tr><tr><td>Microplacas com fundo de vidro de 3,5 cm</td><td>MatTek corporation, Ashland, MA, EUA</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para microscópio</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva de microscópio</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha</td><td>HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Câmera sCMOS de óleo</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor Technology, Belfast, Reino Unido</td><td>Zyla V</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro de microscópio: filtro de excitação</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, EUA</td><td>ET480/40X</td><td>passa-banda 480/40</td></tr><tr><td>Cubo de filtro de microscópio: espelho dicróico</td><td>Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, EUA</td><td>T505lpxr</td><td>longpass 505 nm</td></tr><tr><td>Divisor de imagem</td><td>&nbsp; Cairn Research, Faversham, Reino Unido</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro divisor de imagem: espelho dicróico</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, Alemanha</td><td>568LPXR</td><td>longpass 568 nm</td></tr><tr><td>Cubo de filtro divisor de imagem: filtro de emissão 1 (emissão GFP)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, Alemanha</td><td>520/28 BrightLine HC</td><td>passa-banda 520/28 nm</td></tr><tr><td>Cubo de filtro divisor de imagem: filtro de emissão 2 (emissão RFP)</td><td>AHF Analysentechnik GmbH, T&uuml; bigen, Alemanha</td><td>630/75 ET Passagem</td> de <td>banda passa-banda 630/75 nm</td></tr><tr><td>Inserção de estimulação</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, EUA</td><td>RC-37FS</td><td></td></tr></tbody></table>

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Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Cardiomyocytes gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC-CMs) são uma ferramenta emergente em pesquisa cardiovascular. Ao invés de ser uma população homogênea de células, o iPSC-CMs gerado pelos protocolos de diferenciação atual representam uma mistura de células com ventricular-, atrial-e nodal, como fenótipos, que dificulta a análise fenotípica. Aqui, um método para opticamente registro de potenciais de ação, especificamente do tipo ventricular iPSC-CMs é apresentado. Isto é conseguido pelo Lentivirus transdução com uma construção em que um indicador de tensão geneticamente codificado está sob o controle de um elemento promotor específico ventricular. Quando iPSC-CMs são transfectadas com essa construção, o sensor de tensão é expressa exclusivamente em ventricular células, permitindo gravações de potencial de membrana óptico subtipo específico usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo.

Na figura 4a, um único representante iPSC-CM é retratado com as linhas pontilhadas brancas marcando o ROI desenhado durante a análise de imagem na RFP (lado esquerdo) e o canal GFP (lado direito). O sinal do canal RFP mostra um aumento periódico em intensidade fluorescente durante cada potencial de ação (figura 4b, painel superior). Conforme descrito na introdução, este é devido a uma crescente FRET causado por alterações do pote...

Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Cardiomiócitos gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou células IPS são cada vez mais usados para responder a uma variedade de questões biológicas no campo da eletrofisiologia cardíaca. As principais vantagens desta tecnologia são que ela permite um aumento dramático no throughput, bem como gravações potenciais de ação específicas do subtipo em miócitos ventriculares, usando um elemento promotor específico ventricular. A introdução de sensores de tensão geneticamente codificados através da transdução lentiviral permite a imagem óptica de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem potenciais de ação cardiomiócitos derivados de células-tronco.Comece misturando a cultura celular contendo lentivírus com meio de manutenção de cardiomiócitos, em uma proporção de um para um. Adicione brometo de hexadimetherine a uma concentração final de 8 microgramas por mililitro, para aumentar a eficiência da infecção. E substitua o meio de manutenção de cardiomiócitos no prato de cultura de cardiomiócitos derivados de células IPS, com o meio de infecção.Cultue os cardiomiócitos infectados por 12 horas a 37 graus Celsius, e substitua o meio de infecção por meio de manutenção

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Biology

Biologia

O conhecimento atual sobre a base celular de doenças cardíacas se baseia principalmente em estudos em modelos animais. Aqui nós descrevemos e validar um novo método para obter simples cardiomiócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. Miócitos ventriculares humanos podem ser usados ​​para estudos eletrofisiológicos e testes de drogas.

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

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Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

Aqui, descrevemos a preparação de fatias ventriculares viáveis ​​de camundongos adultos e seu uso para gravações de potencial de ação de eletrodos afiados. Essas preparações multicelulares proporcionam uma estrutura de tecido in vivo preservada, o que os torna um modelo valioso para estudos eletrofisiológicos e farmacológicos in vitro .

Faixas de coração ventricular de eixo curto murino para estudos eletrofisiológicos

Este artigo contem um jogo dos protocolos para o desenvolvimento de redes pluripotentes induzidas humanas do cardiomiócito (hipsc-cm) cultivadas em placas de de mea para electroporate reversivelmente a membrana de pilha para medidas do potencial da ação. Gravações de alta taxa de transferência são obtidas dos mesmos sites de célula repetidamente ao longo dos dias.

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

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Triagem de cardiotoxicidade de alto rendimento usando monocamadas de cardiomiócitos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos maduros

Aqui, um método estabelecido é descrito para realizar medidas de contratilidade e cálcio em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos usando uma plataforma óptica. Esta plataforma permite aos investigadores estudar o efeito das mutações e a resposta a vários estímulos de forma rápida e reprodutível.

Medidas em Tempo Real de Parâmetros de Cálcio e Contratilidade em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos Humanos

Aprenda a gravar potenciais de ação em cardiomiócitos ventriculares derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando sensores de voltagem codificados geneticamente e imagem óptica de alta resolução.

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Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

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