Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Cardiomiócitos gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou células IPS são cada vez mais usados para responder a uma variedade de questões biológicas no campo da eletrofisiologia cardíaca. As principais vantagens desta tecnologia são que ela permite um aumento dramático no throughput, bem como gravações potenciais de ação específicas do subtipo em miócitos ventriculares, usando um elemento promotor específico ventricular. A introdução de sensores de tensão geneticamente codificados através da transdução lentiviral permite a imagem óptica de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem potenciais de ação cardiomiócitos derivados de células-tronco.

Comece misturando a cultura celular contendo lentivírus com meio de manutenção de cardiomiócitos, em uma proporção de um para um. Adicione brometo de hexadimetherine a uma concentração final de 8 microgramas por mililitro, para aumentar a eficiência da infecção. E substitua o meio de manutenção de cardiomiócitos no prato de cultura de cardiomiócitos derivados de células IPS, com o meio de infecção.

Cultue os cardiomiócitos infectados por 12 horas a 37 graus Celsius, e substitua o meio de infecção por meio de manutenção de cardiomiócitos frescos. Antes da imagem, troque o meio de cultura celular com a solução de Tyrode, suplementada com cálcio. Em seguida, coloque os cardiomiócitos em uma câmara de imagem no palco de um microscópio de epifluorescência invertido equipado com um divisor de imagens.

Se for necessário ritmo elétrico, instale eletrodos de ritmo na câmara de imagem e conecte os eletrodos a um gerador de estímulo. Leve as células ao foco e localize uma célula expressando o indicador de tensão geneticamente codificado no centro do campo de visão. Defina o caminho óptico para que a luz emitida seja roteada para o divisor de imagens e mude o cubo do filtro no microscópio para aquele a ser combinado com os filtros no divisor de imagens.

No software que controla a câmera, defina a configuração de aquisição para que a imagem de alta velocidade seja possível e configure o divisor de imagens de acordo com as instruções do fabricante. As duas imagens que representam as duas diferentes faixas de comprimento de onda de emissão devem ser adjacentes uma à outra, cada uma ocupando metade da imagem. Verifique e ajuste o foco da imagem produzida pela câmera conforme necessário.

E ajuste o brilho da luz de iluminação para que a saturação dos pixels seja evitada. Defina a aquisição da série temporal e diminua a luz na sala para evitar que a luz perdida influencie a medição. Em seguida, abra o obturador de luz de excitação e comece a aquisição da série de imagens, iniciando o ritmo elétrico no ponto de tempo apropriado, conforme experimentalmente apropriado.

Quando a aquisição estiver concluída, feche o obturador de luz de excitação conforme necessário e salve a gravação no disco rígido. Em seguida, deixando a configuração de gravação inalterada, registo o fundo sobre uma região do deslizamento sem células. Para análise das gravações potenciais da membrana óptica, abra a pilha de tiff contendo as células no ImageJ, e use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar uma região de interesse sobre um cardiomiócito fluorescente, no canal vermelho, tomando cuidado para que a área seja grande o suficiente para que a célula não saia da região durante a contração.

Em seguida, selecione Analisar, Ferramentas, Gerente de Região de Interesse e selecione Adicionar T, para adicionar a região como Região de Interesse 1. Arraste a região de interesse sobre a mesma célula no canal verde, e adicione essa região como Região de Interesse 2. Nos menus Analisar e Definir Medidas, desmarque todas as opções, exceto o valor cinza Médio.

No Gerenciador de Região de Interesse, clique em Mais e Multi Medida para selecionar as opções Medir todas as fatias e uma linha por fatia e clique em OK. Uma janela será aberta contendo uma planilha com as três linhas. Use Arquivo e Salvar Para salvar a planilha em um arquivo de valor separado por círia. Feche a janela com a pilha de imagens e a janela da planilha sem fechar a janela Region of Interest Manager e abra a pilha de tiff contendo a medição de fundo.

No Gerenciador de Região de Interesse, clique na Medida Mais e Multi para selecionar as opções Medir todas as fatias e uma linha por fatia e clique em OK. Em seguida, salve os dados de fundo em um arquivo csv separado. Aqui, um cardiomiócito derivado de células IPS representativo é representado com as linhas pontilhadas brancas marcando as regiões de interesse, desenhadas durante a análise de imagem nos canais RFP e GFP. O sinal do canal RFP demonstra um aumento periódico da intensidade fluorescente durante cada potencial de ação devido a uma crescente transferência de energia forçada ou ressonância causada por mudanças no potencial da membrana.

Concordantemente, o sinal GFP apresenta uma diminuição periódica na intensidade fluorescente. A razão RFP/GFP é o sinal biológico utilizado em análises a jusante, como a duração potencial de ação 50 e 90 medições. Por exemplo, usando este método, ventricular de 30 dias de idade como cardiomiócitos derivados de células IPS colocados a 0,5 Hertz, mostrou uma duração potencial de ação média 50 de 439 milissegundos, e uma duração potencial de ação média 90 de 520 milissegundos.

A estimulação elétrica dos cardiomiócitos derivados de células IPS a aumentar as taxas de estimulação a cada cinco batidas, demonstrou um encurtamento progressivo dos potenciais de ação à medida que a taxa de espancamento aumentava. Além disso, o tratamento dos cardiomiócitos derivados de células IPS espontaneamente com isoproternol, um agonista receptor beta adreno não seletivo, levou a um aumento imediato na taxa de espancamento, que poderia ser aumentado ainda mais com doses crescentes do agonista. Embora este método forneça um rendimento superior em comparação com as medidas eletrofisiológicas clássicas, deve-se estar ciente de suas limitações, incluindo uma resolução temporal limitada pelas propriedades cinéticas intrínsecas do sensor de tensão fluorescente.