Name: Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a usar microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM) para visualizar estruturas intracelulares induzidas por vírus em células imobilizadas por criofixação. Este método integra imagens de células vivas com microscopia eletrônica.

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Nós somos muito gratos aos membros do pessoal da microscopia eletrônica núcleo instalações (FECOM) no EMBL (Heidelberg) e na Universidade de Heidelberg. Também gostaríamos de agradecer a Ulrike Herian, Stephanie Kallis e Andrea Hellwig (Universidade de Heidelberg), bem como Eberhardt Schmidt e Renate Kunz (Universidade de Ulm) para assistência técnica especializada. Trabalho de R.B. e sua equipe (transacciona e R.I.-b) foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TRR83, TP13 e TP11.

Os autores não têm nada para divulgar.

A metodologia de CLEM apresentada aqui para estudar o impacto de uma expressão de proteínas virais na membrana celular tem sido usada com sucesso antes elucidar o VHC associada a replicação de estruturas, principalmente membrana dupla vesículas (DMVs)21, bem como para Determine os blocos de construção críticos necessários para formar essas estruturas induzida pelo HCV23. Observe que, no nosso primeiro trabalho usando CLEM para estudo de replicação do HCV21, aplicou-se uma versão ligeiramente modificada do protocolo descrito aqui. Nesse estudo, grossa e safira discos convencionais de 0,05 mm, sem alfanumérico padrão, foram utilizadas, em que um padrão de referência foi criado por carbono, revestindo-os com uma grade de localizador no topo (ver Tabela de materiais). Esta versão do protocolo atual pode ser eventualmente aplicada, com a vantagem de que a "A" transportadora para HPF pode ser usada diretamente, sem a necessidade de cortá-la como na Figura 3. Alternativamente, como mencionado no protocolo, um mais grosso "Por" portador pode ser utilizado (ver Tabela de materiais) com discos safira estampados, sem a necessidade de uma operadora "B".
Curiosamente, este protocolo pode ser aplicado não só para estudar amostras de BSL-1, tais como células transfectadas com proteínas virais como descrito aqui e alhures19,23, mas também para estudar células infectadas por vírus. Apesar de trabalhar com patógenos humanos é geralmente restrito aos laboratórios BSL-2 e BSL-3, em alguns países é ainda possível realizar cryo-imobilização nestas condições de biossegurança. Nessas BSL-2 e BSL-3 laboratórios onde vitrificação não é possível, devido os regulamentos locais ou a ausência de uma máquina de HPF, células infectadas por vírus podem ser ainda preparadas usando este método se fixação química com aldeídos é efectuada antecipadamente, ou seja, antes deixando as instalações BSL-2 ou BSL-3. Além disso, aldeídos precisam ser saciada imediatamente após a fixação, para manter a fluorescência, enquanto o resto do protocolo é idêntico ao descrito aqui. Esta técnica pode ser considerada redundante porque as células são fixadas duas vezes, quimicamente e através de vitrificação. No entanto, este protocolo duplo fixação leva realmente a uma preservação muito melhor das DMVs induzida pelo VHC em comparação com as DMVs encontradas nas células submetidas a fixação química sozinho21.
Para maiores modificações e solução de problemas o leitor são referidos as notas em toda a parte do protocolo deste manuscrito. Estas notas descrevem armadilhas a evitar, bem como alternativas para superar dificuldades putativos que possam surgir ao realizar este método.
O principal requisito para a aplicação desta técnica é uma máquina de HPF. Quando crio-imobilizando as células através de HPF não é viável (devido à ausência de uma máquina de HPF) ou não é necessário (quando a preservação da membrana não precisa ser o ideal), as células podem ser quimicamente fixa e posteriormente preparado e analisado por EM8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Esta opção não requer o uso de discos safira, mas pratos de cultura celular com padrões em grade para relocação de células ou aglomerados de células. A principal vantagem da utilização desses pratos é seu maior diâmetro em comparação com discos safira, permitindo a seleção de áreas de superfície maiores. Assim, a aplicação do presente protocolo CLEM tem foi aplicada com sucesso para estudar o efeito de um composto de antiviral contra o HCV15 ou visualizar os rearranjos de membrana induzidos por proteínas não-estruturais de norovírus19. Outra questão que pode limitar o desempenho deste método é a ausência de um dispositivo comercial de FS. Neste caso, sistemas básicos de FS caseiros podem ser utilizados em vez disso. Apesar de dispositivos automáticos de FS podem reduzir a manipulação de percalços, dispositivos caseiros são usados com sucesso por exemplo no30 de Kent McDonald e laboratórios de Paul Walther.
No que diz respeito a fixação química, o protocolo descrito aqui garante uma óptima preservação das estruturas intracelulares20. Portanto, no caso dos dispositivos acima mencionados, HPF e FS disponíveis, vitrificante as células de interesse seria preferido.
Alternativas futuras para esta abordagem de CLEM incluem a possibilidade de utilizar este método não só para adquirir informações 2D ao nível ultraestrutural, mas também para ganhar 3D informações sobre a arquitetura de membrana e organela alterações causadas por vírus. Os métodos EM 3D-, incluindo tomografia de elétrons (ET) e microscopia eletrônica varredura de feixe de íon focalizado (FIB-SEM) (extensivamente descrito em29), poderiam ser também aplicados às células que foram preparadas seguindo este protocolo atual21, 31. Além disso, 3D poderiam ser igualmente obtidas informações a nível de LM, quando usando um microscópio confocal, que permite a aquisição de z-pilhas. Na verdade, esta opção é altamente recomendada quando uma correlação precisa entre LM e EM conjuntos de dados desejada (veja por exemplo17). As informações incluídas na aids z-pilhas 3D para melhorar a correlação com as imagens 2D de temperatura. Assim, em tal cenário, a melhor montagem LM e EM imagens pode ser seleccionada e em seguida submetida a um dos softwares disponíveis, como o plugin CE-CLEM do gelado (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 ou o plugin de Marco as correspondências de correlação Imagem J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), resultando na geração de sobreposição de imagens LM-EM.
Quando são necessárias informações temporais para entender a cinética de um determinado evento, imagem de lapso de tempo pode ser usada para monitorar a dinâmica das células vivas, em combinação com EM. Durante o evento de interesse, as células são fixadas imediatamente, gerando um instantâneo"congelado" que pode ser posteriormente analisado através EM, fornecendo informações ultraestrutural detalhadas sobre aquele momento particular no momento da imobilização. Para obter esse "congelado instantâneo", após a observação em tempo real, as células podem ser quimicamente fixos33 ou cryo-imobilizado6. Como muitos processos celulares ocorrem mais rapidamente do que os processos de difusão de fixação química, se possível, congelação ultra rápida deve ser executada. No entanto, é importante ter em conta que as máquinas HPF diferem em seu tempo eficaz resolução34.
Além disso, embora este protocolo foi projetado para a incorporação de células em uma resina epóxi, células podem ser incorporadas também em resinas de baixa viscosidade, tais como Lowicryls, LR ouro branco ou LR. A utilização destes meios de incorporação permite preservar a antigenicidade35,36, bem como a fluorescência37,38 e, portanto, são utilizados principalmente para pós-incorporação na seção immunolabeling39 , 40 e na seção CLEM41,42,,43,44, onde a LM é feito após a incorporação. Ambas as abordagens (imuno-EM e na seção de CLEM) devem ser cruciais para os experimentos em que estruturas não-característica podem ser facilmente encontradas através de temperatura e/ou como um controle contra miscorrelation entre LM e EM sinais. Da mesma forma, etiquetando com anticorpos que podem ser visualizados por ambas as modalidades de imagem (LM e eme) pode ser realizado45 para, por exemplo, identificar células transfectadas em LM (pré-incorporação de palco) e alcançar uma localização muito mais precisa do Sinal de GFP via sua rotulagem específica por imuno-EM (fase pós-incorporação). Deve ser levado em conta, no entanto, esse permeabilização seja efectuada antes do LM para permitir o acesso dos anticorpos para o espaço intracelular, o que pode resultar em uma sub-óptima preservação da arquitetura celular a nível EM. Curiosamente, este protocolo também é bem adequado para multi cor de experiências que podem ser obtidos com o uso de outras marcas fluorescentes, além de GFP (como mostrado aqui). Em conclusão, há muitas possibilidades putativos de adaptar este protocolo, tanto sobre o LM e/ou dos lados do EM, dependendo as perguntas que estão sendo abordadas. Para obter uma descrição abrangente dos outros protocolos alternativos, o leitor é referido5,46. Independentemente de como as modalidades de microscopia são combinadas, juntos o resultado é um ganho de informações, permitindo-na compreender melhor como os vírus e suas proteínas interagem com seus anfitriões na vida real.
O passo mais crítico dentro deste método é a coleção de seções seriais das células de interesse. Como destacado na seção resultados representativos, isto requer pessoal especializado, bem como muita paciência. Importante, esta etapa é essencial para encontrar as células volta ao nível EM por duas razões. Em primeiro lugar, neste tipo de protocolo de CLEM usando pré-incorporação LM, as coordenadas são somente visíveis a nível de LM e na face do bloco de resina após a incorporação. No entanto, eles não serão visíveis nas seções pela TEM. Portanto, aparando alvejado na face do bloco para baixo para as regiões de interesse (ROIs) deve ser realizado cuidadosamente com uma lâmina de barbear para garantir que as seções que são posteriormente obtidas contêm as células expressando um determinado FP. Em segundo lugar, "digitalização" várias seções é necessário encontrar a melhor sobreposição entre a LM e as aquisições EM. Em contraste com os métodos onde LM é realizada na fase pós-incorporação, neste caso a sobreposição EM LM-não é tão precisa. A precisão baixa sobreposição é devido a diferenças na resolução axial entre LM e EM, encolhimento durante o processamento da amostra de travessão e compressão durante o corte de42. No entanto, métodos eficientes de rastreamento, tais como o uso de Marcos, ajudam a encontrar as células de volta. Isso inclui a posição de uma célula para outra, bem como a forma das células e seu núcleo. A este respeito, conforme explicado no protocolo, o DIC imagens fornecem informações "anatômicos" das células que são críticos para melhorar a correlação. Alternativamente, os núcleos ou outros organelos celulares bem reconhecível (tais como mitocôndrias ou lipídicos gotículas) podem ser manchadas antes LM e usados como pontos de referência.
Finalmente, é digno de nota para mencionar que, embora este manuscrito é focado sobre a utilização desta técnica para estudos de virologia, o escopo deste projeto experimental pode ser expandido para abordar questões biológicas mais gerais.

A ideia de combinar duas modalidades de microscopia para obter uma melhor imagem de um processo biológico específico é muito antiga. Assim, o primeiro estudo sobre vírus usando "microscopia correlativa" foi publicado em 1960 como duas publicações separadas1,2. Nesse estudo, os autores analisaram as alterações na morfologia do núcleo induzido por adenovírus, por meio de duas técnicas de microscopia. Na primeira publicação, observações de microscopia de elétron (EM) descrevendo os detalhes morfológicos associados com infecção por adenovírus foram relatados1. Em uma segunda publicação, as diferentes estruturas observadas por EM foram correlacionadas com imagens de microscopia de luz (LM) de padrões de coloração histoquímicos, para definir a natureza das estruturas anteriormente observado por EM2.
Nesses primeiros estudos, no entanto, as suas observações foram realizadas usando diferentes células infectadas preparadas como experimentos independentes. A "correlação", na verdade, era como a combinação de informações provenientes de duas modalidades de imagem para compreender um determinado fenômeno, comparando todos os resultados que foram obtidos com ensaios diferentes a fim de compreender um dado biológico processo.
Hoje em dia, a termo correlativo a microscopia, também conhecido como correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM), é aplicada a um número crescente de métodos (revisto em referências3,4,5), com as características comuns que ambas as técnicas de imagem (LM e eme) são realizadas na mesma amostra. A combinação de ambos os métodos resulta, desse modo, em uma análise multimodal, multi-escala e multi-dimensional de que amostra3. As vantagens são que a LM pode fornecer uma visão ampla de muitas células diferentes, permitindo a identificação de subpopulações de células expressando uma proteína ou as proteínas de interesse dentro de uma população celular heterogênea. EM supera o limite de resolução de LM, proporcionando uma maior resolução de imagem de um determinado evento intracelular. Além disso, EM permite a visualização do contexto não-fluorescente subcellular, incluindo todas as organelas de membrana acoplada, grandes complexos macromoleculares (por exemplo, ribossomos, centríolos, etc) e elementos do citoesqueleto, desse modo fornecendo informações espaciais adicionais, o chamado "espaço de referência"6e dando o contexto para o spot fluorescente detectado pelo LM.
Durante os últimos anos, CLEM tornou-se uma ferramenta poderosa, não só para a célula biólogos5, mas também para virologistas (revistas em referência7) dispostos a entender as interações vírus-célula complexas que levam a uma propagação de vírus de sucesso. Assim, compreender como vírus modificam as membranas celulares e organelas para benefício próprio é essencial para desenvolver medicamentos antivirais para erradicar o vírus patogénicos.
Aqui, um método de CLEM é descrito que permite a detecção por LM de celulas que expressam proteínas virais fundidas a uma proteína fluorescente (FP). Estas células são posteriormente cryo-imobilizado e mais preparado para análise ultraestrutural através de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para ganhar novos insights sobre como a expressão destas proteínas rearranjar as membranas intracelulares (Figura 1). CLEM tem sido realizado com células quimicamente fixas na maioria dos estudos de virologia publicadas a data8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Isto é principalmente devido à necessidade de inactivar material infeccioso por razões de segurança biológica em nível de biossegurança-2 e -3 laboratórios (BSL-2 e BSL-3), onde crio-imobilização de células geralmente não é possível. Para aquelas perguntas que exigem uma óptima preservação das membranas celulares, vitrificação através de alta pressão a frio (HPF) é, no entanto, altamente recomendada20. Nesses casos, o protocolo de CLEM descrito aqui pode ser aplicado. Curiosamente, especialmente quando se trabalha com amostras infecciosas, HPF pode ser realizada em amostras que foram anteriormente quimicamente inativadas, por exemplo em laboratórios BSL-2 e BSL-3. A combinação de fixação química, seguida por HPF é uma possibilidade para lucrar pelo menos parcialmente, com as vantagens de crio-preservação métodos21,22.
<img alt="Diagrama do processo de microscopia de luz para microscopia eletrônica de transmissão; preparação e seccionamento celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1 : Representação esquemática do fluxo de trabalho para a análise das células através de CLEM. As células crescem em discos safira estampados primeiro são analisadas por LM para localizar células expressando FPs antes da sua transformação para EM. Uma vez localizado, as células são imediatamente fixadas pelo HPF e FS para posteriormente ser incorporado em resina. Após a polimerização da resina, o suporte onde células estavam crescendo (= discos safira) deve ser retirado do bloco de resina. O bloco contendo as células incorporadas é cortado para um pequeno trapézio do qual as células restantes, expressando FPs, são seccionadas com uma faca de diamante. Seções ultra-finas são recolhidas em grades de slot e analisadas pela TEM para obter informação ultraestrutural dessas células. Esta figura é adaptada e modificada com autorização de referência29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Reticulador UV</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Stratalinker 1800, 230 Vac, equipado com lâmpadas UV de 254 nm, 8 Watts/cada.</td></tr><tr><td>Discos de safira padronizados</td><td>Escritório de Engenharia M. Wohlwend, Sennwald, Suíça</td><td>627</td><td>Eles têm um diâmetro de 0,3 mm e 0,16 mm de espessura, bem como um padrão alfanumérico gravado para permitir a realocação das células. Eles só podem ser encomendados por e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Pinças finas e longas</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>72919-SS</td> <td>"Style SS", para o manuseamento de discos de safira.</td></tr><tr><td>Meio de cultura celular</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>41965-062</td><td>Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 2 mM de L-glutamina, aminoácidos não essenciais, 100 unidades de penicilina por ml, 100 &micro; g de estreptomicina por ml e 10% de soro fetal de bezerro (DMEM completo, veja abaixo). Embalagem contendo 10 frascos de 500 mL/cada.</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>25030-123</td><td>Embalagem contendo 20 frascos de 100 mL/cada.</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11140-068</td><td>Embalagem contendo 20 frascos de 100 mL/cada.</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15140-163</td><td>Embalagem contendo 20 frascos de 100 mL/cada.</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MI, EUA</td><td>F7524</td><td>Frasco de 50 mL</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus Deutschland, Hamburgo, Alemanha</td><td>CKX41</td><td>É um microscópio invertido com opções de cabeça trinocular e capacidade de atualização de fluorescência.</td></tr><tr><td>Células Huh7-Lunet expressando de forma estável a RNA-polimerase T7</td><td>Disponível no laboratório do Prof. Dr. Ralf Bartenschlager</td><td>Não disponível</td><td>Entre em contato com o Prof. Bartenschlager em: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção Mirus TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio LLC, Madison, EUA</td><td>MIR 2304</td><td>Reagente de transfecção de DNA de amplo espectro, baixa toxicidade. Frasco de 0,4 mL</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência de campo amplo invertido</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Alemanha</td><td>Zeiss Observer.Z1</td><td>Microscópio de fluorescência invertida para experimentos envolvendo culturas de células vivas.</td></tr><tr><td>1-hexadeceno</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>8220640100</td><td>Frasco de suportes de alumínio de 100 mL</td></tr><tr><td>"A para frezing de alta pressão (HPF)</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Suíça</td><td>241</td><td>Este é o suporte que foi usado para este protocolo e tem 2 profundidades diferentes de 0,1 e 0,2 mm. Só pode ser encomendado por e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Suportes de alumínio "B" para HPF</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Suíça</td><td>242</td><td>Este é o suporte que foi usado para este protocolo. Tem 0,3 mm de espessura. Eles só podem ser encomendados por e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Suporte de alumínio "A" para HPF (especial para trabalhar com discos de safira estampados)</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Suíça</td><td>737</td><td>Este é o suporte que pode ser usado sozinho com o disco de safira padronizado (como alternativa ao protocolo atual), sem a necessidade de um suporte "B" ou a edição do suporte "A". Tem 0,84 mm de espessura. Só pode ser encomendado por e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td></tr><tr><td>Discos de safira</td><td>Escritório de Engenharia M. Wohlwend, Sennwald, Suíça</td><td>405</td><td>Esses discos de safira são os "convencionais", com 0,3 mm de diâmetro e espessura de 0,05 mm . Eles também podem ser usados para CLEM como uma alternativa em vez de discos de safira padronizados.</td></tr><tr><td>Grades de busca</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Filadélfia, EUA</td><td>LF135-</td><td>Estas grelhas de malha 135 são utilizadas para criar um padrão alfanumérico em discos de safira "convencionais" (descritos acima) através de revestimento de carbono, para que possam ser utilizadas para CLEM. 100 grelhas/frasco.</td></tr><tr><td>Máquina HPF</td><td>ABRA Fluid AG, Widnau, Suíça</td><td>HPM 010</td><td>Esta máquina HPF foi usada para este protocolo.</td></tr><tr><td>Máquina HPF</td><td>Leica Microsystems, Viena, Áustria</td><td>EMPACT 2</td><td>"EMPACT 2", como alternativa ao uso da máquina HPM que foi utilizada neste protocolo (descrito acima).</td></tr><tr><td>Tubos criogênicos</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>Z763667-500EA</td><td>Para armazenamento a longo prazo de amostras crio-imobilizadas em nitrogênio líquido. Pacote contendo 500 criogeniais.</td></tr><tr><td>Dewar de nitrogênio líquido</td><td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Alemanha</td><td>GZ-05094-60</td><td>Para armazenamento a longo prazo de amostras crio-imobilizadas em nitrogênio líquido, equipadas com crio-racks com capacidade para 1600 tubos criogênicos.</td></tr><tr><td>Máquina de substituição automática por congelamento (AFS)</td><td>Leica Microsystems, Viena, Áustria</td><td>EM AFS2</td><td>Esta máquina executa técnicas de substituição por congelamento e redução progressiva de temperatura (PLT) e permite a incorporação e polimerização de resinas em baixa temperatura.</td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio (OsO4)</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA</td><td>19150</td><td>Solução aquosa a 4%, uma caixa contendo 10 ampolas de 2 ml.</td></tr><tr><td>Acetato de uranila (UA)</td><td>Serva, Heidelberg, Alemanha</td><td>77879.01</td><td>Frasco contendo 25 grs de (UA)-2 H2O.</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin Electronic, Berlim, Alemanha</td><td>329</td> <td>"Sonorex Super RK 31" é um banho de limpeza ultrassônico de alta potência para solução de limpeza aquosa que é usado neste protocolo para misturar OsO4 e Ua ao preparar o meio FS.</td></tr><tr><td>Acetona destilada em vidro</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>10015</td><td>Frasco de 100 mL</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica Microsystems, Viena, Áustria</td><td>Leica M80</td><td>Estereomicroscópio de rotina para inspeções diárias, equipado com uma câmara para captura de imagens.</td></tr><tr><td>Resina epóxi</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>14120</td><td>Embed 812 é um kit que contém vários componentes que devem ser misturados nas proporções dadas pelos fabricantes.</td></tr><tr><td>Fluxo através de anéis</td><td>Leica Microsystems, Viena, Áustria</td><td>16707157</td><td>Pacote contendo 100 peças.</td></tr><tr><td>Banhos de reagentes</td><td>Leica Microsystems, Viena, Áustria</td><td>16707154</td><td>Pacote contendo 100 peças.</td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Microsystems, Viena, Áustria</td><td>Leica EM UC7</td><td>Ultramicrótomo para preparação de seções semifinas e ultrafinas à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Faca de diamante Ultra 35 &deg;</td><td>Diatome Ltd., Nidau Suíça</td><td>AGG339-735</td><td>Esta faca tem um comprimento de borda de 3 mm.</td></tr><tr><td>Pinças ultrafinas</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA</td><td>E78318</td><td>"Style 3X", para manusear grelhas EM.</td></tr><tr><td>Grades de slot EM</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, EUA</td><td>G2010-</td><td>100 grades/frasco.</td></tr><tr><td>Caixa de armazenamento de grade EM</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>71155</td><td>Tem capacidade para 100 grades.</td></tr></tbody></table>

correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (clem) para rastreamento e imaging proteína viral associado estruturas nas células cryo-imobilizado

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Devido a sua alta resolução, microscopia de elétron (EM) é uma ferramenta indispensável para virologistas. No entanto, uma das principais dificuldades ao analisar as células infectadas por vírus ou transfectadas através EM são a baixa eficiência de infecção ou de transfeccao, dificultando o exame dessas células. Para superar esta dificuldade, microscopia de luz (LM) pode ser realizada primeiramente para alocar a subpopulação de células transfectadas ou infectadas. Assim, aproveitando-se do uso de proteínas fluorescentes (FPs) fundiu a proteínas virais, LM é usado aqui para gravar as posições das células "positivo-transfectadas", expressando uma FP e crescendo num suporte com um alfanumérico padrão. Posteriormente, as células são transformadas posteriormente para EM através de pressão alta (HPF) de congelamento, congelar a substituição (FS) e a incorporação de resina. A etapa de congela ultra-rápida garante preservação excelente da membrana das células selecionadas que pode ser analisado a nível ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Aqui, é fornecido um fluxo de trabalho passo a passo correlativo luz microscopia de elétron (CLEM), descrevendo a preparação da amostra, imagiologia e correlação em detalhe. O delineamento experimental também pode ser aplicado para resolver muitas questões de biologia celular.

Usando o procedimento aqui apresentado (Figura 1), células Huh7-Lunet estàvel expressando o T7-RNA polimerase foram semeadas em discos safiras estampados e posteriormente transfected com um plasmídeo expressando dois domínios do vírus da hepatite C (HCV) proteínas não-estruturais NS5A, marcados com GFP (GFP-D1-pTM_AH) (Figura 4). No dia seguinte, os discos safira padronizados, onde as células estavam crescendo, foram retirados os pratos de cultura celular e fotografados por meio de LM (Figura 4, Figura 2). Essas células expressando o AH-D1-GFP foram identificadas pela presença de fluorescência verde no citosol e gravadas para salvar suas posições dentro do padrão de coordenada dos discos safira (figuras 5A, 5B). Imediatamente após o seu exame de LM, os safira discos contendo as células de interesse foram montadas entre duas operadoras de alumínio (Figura 3) e submetidos a cryo-imobilização HPF. As células foram então congelar substituídos e posteriormente incorporado em uma resina epóxi.
Após a remoção dos discos safira de blocos de resina polimerizada, a impressão do alfanumérico padrão era visível na face do bloco, que permitiu recuperar as áreas onde se localizavam as células de interesse. O resto do bloco de resina foi aparado fora para gerar um pequeno trapézio abrigando as células de interesse. Seções ultra-finas seriais foram obtidas a partir deste trapézio, coletadas nas grades de slot EM e mais analisadas pela TEM (Figura 5-C). Nota que obter manualmente seriais seções consecutivas, embora viável28 é de trabalho intensivo e exige pessoal bem treinado e qualificado. Também é importante que as células têm uma confluência de baixa quando submetido a este protocolo de CLEM (Figura 5A) a fim de garantir um rápido reconhecimento da mesma célula anteriormente identificado por LM. Caso contrário, ter maior confluência de célula pode dramàtica abrandar a localização bem-sucedida de células ao nível EM.
Análise de temperatura de várias seções ultra-finas da célula de interesse (figuras 5, 5E), expressando o AH-D1-GFP, revelaram a presença em seu espaço intracelular de grandes acumulações de vesículas de morfologia variável, delimitada a partir da cercando o citosol por uma único lipídica (Figura 5E).
<img alt="Diagrama experimental de replicação do RNA do HCV: resultado da transfecção celular e da microscopia de fluorescência." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4 : Representação esquemática do fluxo de trabalho seguido para executar o exemplo de CLEM retratado em Figura 5 . Células Huh7-Lunet estàvel expressando o T7-RNA polimerase foram transfectadas com um plasmídeo de DNA codificação a hélice anfipática (AH) e o domínio 1 (D1) de proteína de HCV NS5A, marcados no seu C-terminal com GFP (pTM_AH-D1-GFP). A expressão desta parte da proteína NS5A é controlada transcricionalmente por um promotor T7 (T7 Pm) e translationally por um elemento de IRES (local de entrada do Ribossoma interno) de virus, (EMCV) encefalomiocardite, indicada por uma estrutura secundária. Células de transfeccao pós (24 hpt) 24 h crescendo padronizado discos safira e expressando o AH-D1-GFP foram detectados pelo LM e imediatamente submetido ao HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise da estrutura celular; cortes de núcleo; diagrama de microscopia; Imagens celulares 3D; estudo de ultraestrutura." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5 : Exemplo de um procedimento de CLEM. (A) Huh7-Lunet células estàvel expressando o polymerase T7 analisado por microscopia de fluorescência para alocar células GFP-positivo cultivadas em discos safira estampados, 24h depois do transfection com o plasmídeo pTM_AH-D1-GFP. (B) imagem de ampliação mais elevada de uma única célula selecionada dentro do retângulo tracejado branco para ser analisado por CLEM. Imagem de temperatura (C) de uma seção ultrafino da mesma célula após HPF, FS e incorporação de resina. (D) representação esquemática de seções ultra-finas de série 70-nm em uma grade de slot EM que contém a célula de interesse. (E) à esquerda: súmulas TEM duas seções da célula de interesse. À direita: imagens de temperatura alta ampliação das áreas intracelulares selecionadas em retângulos amarelos à esquerda, revelando o elevado número de vesículas delimitadas do citosol através de uma membrana única. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um método de microscopia de elétron luz correlativo (CLEM) é aplicado às estruturas intracelulares induzida por vírus imagem através de microscopia eletrônica (EM) em células que são previamente selecionadas pela microscopia de luz (LM). LM e eme são combinados como uma abordagem de imagem híbrida para alcançar uma visão integrada das interações do vírus-anfitrião.

Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Este método ajuda a responder a questões-chave no campo da biologia sobre como as bioproteínas que estão nas membranas celulares criam ambientes que favorecem a bio-replicação e a montagem. Os dois pilares técnicos combinados aqui são: primeiro, a correlação entre imagens de células vivas e microscopia eletrônica e, segundo, congelamento de alta pressão. Embora esse método tenha sido projetado e utilizado com sucesso para lidar com interações de fontes de vírus, ele pode ser facilmente generalizado para uma variedade de aplicações em biologia celular. A demonstração visual deste método é crítica, pois há muitas etapas que exigem experiência prática com sucesso, especialmente a crioimobilização por congelamento de alta pressão e as etapas subsequentes. Comece colocando discos de safira padronizados com um padrão alfanumérico gravado em uma de suas superfícies em um tubo de centrifugação cônico de 15 mililitros e lavando bem os discos com etanol. Coloque os discos de safira lavados em uma placa de Petri forrada com papel de filtro para secar e use uma pinça longa e fina para transferir os discos de safira secos para lâminas de vidro. Usando um microscópio invertido com ampliação de 4x, confirme se o padrão de coordenadas em cada disco de safira é legível. Em seguida, esterilize os discos com um reticulador ultravioleta por cinco minutos. Em um armário de biossegurança, adicione metade do meio de cultura de células a uma placa de cultura de células e use uma pinça longa para transferir cuidadosamente os discos de safira para a placa. Em seguida, semeie 1x10

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Bioengineering

Bioengenharia

Nós demonstramos a fabricação de um estágio de baixo custo criogênicos projetados para caber mais microscópios de luz refletida. Nesta fase de laboratório construído criogênicos permite eficiente e confiável imagem correlativa entre crio-luz e crio-microscopia eletrônica.

Low-Cost Cryo-Light Fabricação Stage Microscopia de Luz Correlacionados / Microscopia Eletrônica

A técnica CLEM foi adaptado para analisar a morfologia ultraestrutural de membranas, organitos e estruturas subcelulares afectados por moléculas microinjectados. Este método combina as técnicas poderosas de micromanipulação / microinjeção, microscopia confocal, fluorescentes e microscopia eletrônica para permitir milímetros de multi-resolução nanométrica. Esta técnica é susceptível a uma grande variedade de aplicações.

Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Este artigo descreve a metodologia de microscopia crioeletrônica, que é usada para obter imagens microscópicas de alta qualidade de macromoléculas em seu estado quase nativo. O método produz imagens adequadas para processamento computadorizado adicional usando a abordagem de partícula única, concebida para gerar a reconstrução 3D de uma macromolécula.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

Um método é descrito pelo qual nanopartículas de pontos quânticos (QD) podem ser usadas para estudos imunocitoquímicos correlativos de tecido de patologia humana embebido em epóxi. Empregamos QDs conjugados com fragmentos de anticorpos comerciais que são visualizados por microscopia de luz de fluorescência de campo amplo e microscopia eletrônica de transmissão.

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

Nós desenvolvemos uma nova técnica de microscopia electrónica, de "flash-e-congelamento", que permite a visualização da dinâmica da membrana com ms resolução temporal. Esta técnica combina a estimulação optogenetic de neurónios com congelamento de alta pressão. Aqui, demonstramos os procedimentos e descrever os protocolos em detalhe.

Flash-e-Freeze: uma nova técnica para capturar Membrane Dynamics com Electron Microscopy

Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

Apresentamos um protocolo detalhado para microscopia eletrônica e de luz correlativa pós-incorporação de Epon usando uma proteína fluorescente chamada mScarlet. Este método pode manter a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Esta técnica é passível de uma ampla variedade de aplicações biológicas.

Epon Post Embedding Correlative Light e Microscopia Eletrônica

Este protocolo descreve um mecanismo para usar microscopia de luz e eletrônica correlativa para visualizar a interação de mitocôndrias e lisossomos marcados com mEosEM e APEX2, respectivamente.

Microscopia Eletrônica e de Luz Correlativa de Duas Cores para a Visualização de Interações entre Mitocôndrias e Lisossomos

Esse fluxo de trabalho permite a produção de lamelas direcionadas a estruturas biológicas marcadas com fluorescência que são pequenas (&lt;1 μm de extensão axial) e raras (1 cópia por célula) usando uma plataforma de imagem tricoincidente criogênica. Esta plataforma integra microscopia de fluorescência, fresagem de feixe de íons focalizada e microscopia eletrônica de varredura em uma única posição focal e permite microscopia de fluorescência simultânea durante a fresagem.

Fluxo de trabalho usando um microscópio de fluorescência coincidente criogênica, elétron e feixe de íons para moagem direcionada de células

Aprenda a usar microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM) para visualizar estruturas intracelulares induzidas por vírus em células imobilizadas por criofixação. Este método integra imagens de células vivas com microscopia eletrônica.

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Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado

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