Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado
7 de setembro de 2018
Um método de microscopia de elétron luz correlativo (CLEM) é aplicado às estruturas intracelulares induzida por vírus imagem através de microscopia eletrônica (EM) em células que são previamente selecionadas pela microscopia de luz (LM). LM e eme são combinados como uma abordagem de imagem híbrida para alcançar uma visão integrada das interações do vírus-anfitrião.
Este método ajuda a responder a questões-chave no campo da biologia sobre como as bioproteínas que estão nas membranas celulares criam ambientes que favorecem a bio-replicação e a montagem. Os dois pilares técnicos combinados aqui são: primeiro, a correlação entre imagens de células vivas e microscopia eletrônica e, segundo, congelamento de alta pressão. Embora esse método tenha sido projetado e utilizado com sucesso para lidar com interações de fontes de vírus, ele pode ser facilmente generalizado para uma variedade de aplicações em biologia celular. A demonstração visual deste método é crítica, pois há muitas etapas que exigem experiência prática com sucesso, especialmente a crioimobilização por congelamento de alta pressão e as etapas subsequentes. Comece colocando discos de safira padronizados com um padrão alfanumérico gravado em uma de suas superfícies em um tubo de centrifugação cônico de 15 mililitros e lavando bem os discos com etanol. Coloque os discos de safira lavados em uma placa de Petri forrada com papel de filtro para secar e use uma pinça longa e fina para transferir os discos de safira secos para lâminas de vidro. Usando um microscópio invertido com ampliação de 4x, confirme se o padrão de coordenadas em cada disco de safira é legível. Em seguida, esterilize os discos com um reticulador ultravioleta por cinco minutos. Em um armário de biossegurança, adicione metade do meio de cultura de células a uma placa de cultura de células e use uma pinça longa para transferir cuidadosamente os discos de safira para a placa. Em seguida, semeie 1x10
Visão Geral
Este artigo apresenta um método de microscopia correlativa de luz e elétrons (CLEM) para visualizar estruturas intracelulares induzidas por vírus. Ao integrar a microscopia de luz (LM) e a microscopia eletrônica (EM), os pesquisadores podem obter informações sobre as interações entre vírus e hospedeiro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Técnicas de Microscopia
- Interações Vírus-Hospedeiro
Antecedentes
- O método combina o imageamento de células vivas com microscopia eletrônica.
- O congelamento sob alta pressão é um componente crítico da técnica.
- Ele foi aplicado com sucesso para estudar interações virais.
- O método pode ser generalizado para diversas aplicações em biologia celular.
Objetivo do Estudo
- Visualizar estruturas induzidas por vírus em células.
- Aprimorar a compreensão das interações entre bio-proteínas em membranas celulares.
- Fornecer um guia prático para pesquisadores que utilizam este método.
Métodos Utilizados
- Preparação de discos de safira padronizados para imagem.
- Uso de microscopia invertida para confirmação do padrão.
- Sterilização dos discos utilizando cruzamento por luz ultravioleta.
- Técnicas de cultivo celular para semeadura de células em discos de safira.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de estruturas intracelulares induzidas por vírus.
- Demonstração da eficácia da microscopia correlativa de luz e elétrons (CLEM) no estudo das interações entre vírus e hospedeiro.
- Etapas práticas descritas para implementação do método.
- Aplicações potenciais em contextos mais amplos da biologia celular.
Conclusões
- O método CLEM fornece informações valiosas sobre a biologia viral.
- Ele preenche a lacuna entre microscopia óptica e microscopia eletrônica.
- Aplicações adicionais em biologia celular são incentivadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A Microscopia Correlativa de Luz e Elétrons (CLEM) aborda um gargalo crítico na pesquisa em virologia ao permitir a análise direcionada de populações raras de células transfectadas ou infectadas. Ao combinar a imagem de células vivas baseada em fluorescência com a preservação de ultraestrutura de alta resolução por meio do congelamento sob alta pressão, este método aumenta a confiança preditiva em estudos mecanicistas das interações vírus-hospedeiro. Ele apoia a validação precoce de alvos e o desenvolvimento de ensaios ao fornecer dados correlativos que conectam fenótipos funcionais à arquitetura subcelular, orientando decisões de avanço ou interrupção em pipelines de descoberta de antivirais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao associar a expressão de proteínas virais marcadas com fluorescência a alterações ultraestruturais em células criopreservadas.
- Valor Operacional: Aumenta a eficiência no estudo de eventos de transfeção ou infecção de baixa eficiência por meio de pré-visualização via microscopia de luz.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao visualizar alterações nas membranas induzidas por vírus e sítios de montagem relevantes para complexos de replicação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras correlacionadas de fluorescência e densidade eletrônica que permitem a avaliação quantitativa da localização de proteínas virais e de perturbações estruturais.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras utilizando discos de safira padronizados, facilitando a correlação reprodutível entre experimentos e usuários.
- Prontidão do Ensaio: Produz amostras com preservação ultraestrutural adequada para análises morfométricas e de imagem em campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém fidelidade estrutural da microscopia de imagem em células vivas à microscopia eletrônica, apoiando triagem fenotípica alinhada a biomarcadores em sistemas relevantes para doenças.
- Modelagem Pré-clínica: Permite a caracterização detalhada de efeitos citopáticos induzidos por vírus em estados quase nativos, aumentando a confiança na extrapolação translacional.
- Avanço Ajustado ao Risco: Fornece evidências ultraestruturais para apoiar ou refutar mecanismos de ação de candidatos antivirais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
CLME se insere no continuum de descoberta, desde a geração de hipóteses na virologia inicial até a validação mecanicista na otimização de compostos líderes, especialmente quando são necessárias correlações estruturais da função proteica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a visualização direta de estruturas associadas a proteínas virais em subpopulações celulares definidas.
- Triagem: Melhora a confiabilidade dos ensaios por meio da padronização da localização celular e da criopreservação, reduzindo a variabilidade nas leituras estruturais.
- Análises: Fornece conjuntos de dados correlacionados de microscopia de luz e eletrônica que permitem comparação quantitativa de condições com base na intensidade de fluorescência e nas características ultraestruturais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a imagem funcional com dados estruturais de alta resolução, apoiando a continuidade desde ensaios baseados em células até a validação mecanicista.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo de interações vírus-hospedeiro, aplicável a múltiplos alvos e famílias virais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer evidências correlativeis diretas da localização de proteínas virais e das alterações estruturais induzidas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio do uso padronizado de substratos padronizados e congelamento em alta pressão, minimizando artefatos decorrentes da fixação química.
- Valor Estratégico: Orienta decisões mais assertivas de avanço ou interrupção ao validar o engajamento do alvo no nível ultraestrutural, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos antivirais com base em efeitos confirmados sobre compartimentos de replicação viral ou sítios de montagem.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microscopia de fluorescência em células vivas, congelamento em alta pressão, substituição por congelação e microscopia eletrônica de transmissão.
- Depende do acesso a congeladores de alta pressão, ultramicrótomos e sistemas de imagem correlacionada de luz e elétrons.
- Necessita padronização de marcadores fiduciais (por exemplo, discos de safira com padrão definido) e protocolos de mapeamento de coordenadas entre equipes.
- A adaptação a diferentes tipos celulares ou sistemas virais pode exigir otimização da eficiência de transfeção, marcação por fluorescência e parâmetros de congelamento.
- As limitações práticas incluem baixa produtividade devido ao uso de equipamentos especializados e à necessidade de alinhamento por software correlacionado, conforme observado no material de origem.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
