Name: Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a quantificar homo-oligomerização de proteínas in vitro usando espectroscopia de flutuação de fluorescência sem calibração. Este método acessível auxilia no desenvolvimento de medicamentos anticâncer e inibidores de fusão.

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Este trabalho tem sido apoiado pela Wellcome Trust conceder 105278/Z/14/2 ao R.N. Centro Wellcome Trust de genética humana é financiado pelo Wellcome Trust núcleo prêmio 203852/Z/16/2. Trabalho no grupo C.S. é suportado pelo Cancer Research UK (C20724/A14414) e o Conselho Europeu de investigação no âmbito da União Europeia Horizonte 2020 investigação e inovação programa Grant 647278.

1. FKBP12 F36V mVenus - purificação
<ol><li>Transforme (DE3) pLysS células com pET22b vetor contendo monomerized humana FKBP12F36V12 e N-terminal His6 e mVenus tags (vetor disponível a pedido). Células de placa para LB ágar suplementado com 50 µ g/mL ampicilina e cloranfenicol de 34 µ g/mL.</li>
	<li>Transferir colônias transformadas em cultura 100ml LB e crescer por 16-20 horas a 37 ° C, com agitação.</li>
	<li>Diluir a cultura starter densa (OD600 > 1) a 1: 100 em meio LB (lotes de 2 x 500 mL) e crescer durante 2-3 horas para OD600 = 0.6 - 0.8 (37 ° C, 200 rpm).</li>
	<li>Culturas fresca no gelo. Induzir com 250 µM IPTG e crescer por 16-20 horas a 21 ° C, 200 rpm.</li>
	<li>Recolher as células por centrifugação a 2.000 x g por 20 minutos.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 40 mL de tampão IMAC (20 mM de fosfato de sódio pH 7,5, 500 mM de NaCl, imidazol de 3 mM, 1 mM β-Mercaptoetanol) suplementado com EDTA livre de inibidores de protease (1 comprimido por centrifugado).</li>
	<li>Proceda à sonicação células (amplitude de 500 Watts, 20kHz, 40%, 9 s em, 11 s fora por 15 min) em gelo e colheita de material solúvel por centrifugação a 20.000 g x.</li>
	<li>Transferência solúvel lisado para um Erlenmeyer e adicionar 2 mL de resina (ver Tabela de materiais). Incubar durante 1 hora com rotação 105 rpm Nota: Níquel sepharose também pode ser utilizada para esta etapa do IMAC.</li>
	<li>Resina da colheita e lave com 250 mL de tampão IMAC A seguido por 500 mL de tampão IMAC B (20 mM fosfato de sódio pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazol 7 mM, 1mm β-Mercaptoetanol). Nota: Aumentar de imidazol 50mm se usando resina sepharose de níquel.</li>
	<li>Eluir a proteína His6-tag usando IMAC buffer C (20 mM fosfato de sódio pH 7,5, 500 mM de NaCl, imidazol 300 mM, 1mm β-Mercaptoetanol).</li>
	<li>Injetar em uma exclusão de tamanho coluna (ver Tabela de materiais) incubado no pH HEPES 10mm 7.5, 150 mM de NaCl, 1 milímetro DTT. FKBP12F36V tem sua eluição de pico no mL 87,71 na coluna que usamos.</li>
	<li>Avaliar a pureza através de SDS-PAGE e piscina e concentrar-se conforme necessário.</li>
</ol>2. preparação da chapa do Multiwell matriz
<ol><li>Descongelar o FKBP12F36V purificado (ou rotulado da proteína de interesse) de-80 ° C.</li>
	<li>Preparar uma solução de 100 nM purificado FKBP12F36V (média, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 milímetro DTT). Proceda à sonicação e centrifugar (volta rápida de 13.000 rpm) para evitar a formação de agregados.</li>
	<li>Pipete 100-200 µ l para uma câmara de observação bem 8 com um fundo de vidro.</li>
	<li>Adicione o dimerizer BB para concentrações finais de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nM12,13.</li>
	<li>Como referência, preparar uma solução de 100 nM de mVenus sozinho para avaliar os potenciais efeitos de agregação e precipitação e recuperar um valor de brilho para o monômero com as mesmas configurações de aquisição.</li>
</ol>3. calibração livre Confocal aquisição
<ol><li>Inicie o sistema confocal (Figura 1). Qualquer luz de microscópio confocal sistema de digitalização equipados com detectores digitais ou bem caracterizadas detectores analógicos8e capaz de manter um tempo de interrupção constante para cada pixel adquirida funcionaria.</li>
	<li>Defina o caminho do feixe de excitação:<ol>
<li>Ligue o 514 nm laser e conjunto no nW 20-100 de potência na saída do objectivo (para FKBP12F36V-mVenus).</li>
		<li>Selecione o objetivo 63X1.4NA ou o objectivo de imersão de água um colarinho correção projetado para o FCS.</li>
		<li>Ligue um HyD, APD ou detector de PGTO calibrado. Detectores de capazes de contagem de fótons são preferíveis, como neste caso, o cálculo de S, deslocamento e σ02 são desnecessários.</li>
		<li>Selecione a janela de emissão de 520-560 nm</li>
		<li>Defina o pinhole 1 unidade arejado para o correspondente de emissão ~ 545 nm.</li>
		<li>Definir o modo de aquisição de 16 x 16 pixels</li>
		<li>Defina o tde tempo de permanência na pixel quehabitam tais que satisfaz tquadro >> TD >> thabitam, onde D é o tempo de permanência da difusão da proteína e t frame é a taxa de quadros. Isto correspondia a definir o tempo de interrupção para ~ 13 µs. Nota: Alguns fabricantes comerciais tem scanners que não estavam mantendo o tempo de interrupção por pixel constante. Esta constância é fundamental para o método de trabalho.</li>
		<li>Definir o tamanho do pixel em ~ 120 nm.</li>
		<li>Selecione o modo de aquisição xyt e o número de quadros a serem adquiridos por aquisição e bem (por exemplo 5.000).</li>
		<li>Se o sistema é equipado com o modo de alta produtividade, introduza as coordenadas de cada poço e o número de aquisições por alvéolo para automatizar o processo. Nota: Tenha cuidado para assegurar a presença de um dispensador de água para se utilizar um objectivo de imersão.</li>
		<li>Se o sistema é equipado com um sistema de perfusão, carregar a solução do BB e programar a perfusão para começar a direita-após o quadro doth de 5000 para avaliar a cinética de dimerização durante a aquisição , por exemplo, de 10.000 imagens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar uma gota de óleo para o objectivo de imersão de óleo / água se utilizando o objectivo de imersão de água um colarinho correção projetado para o FCS.</li>
	<li>Monte a câmara 8 observação bem no palco.</li>
	<li>Selecione o bem correto e concentrar a solução. Nota: Importante: evitar focando perto do copo inferior para evitar a reflexão e a dispersão. Quando o foco mais profundo na solução, desligue a opção de foco automático.</li>
	<li>Iniciar a aquisição e salvar a pilha resultante de imagens no formato TIFF.</li>
</ol>4. detrend e análise de brilho usando o pacote de R nandb
<ol><li>Como uma verificação de qualidade pré-processamento, use ImageJ14 para dar uma olhada nas imagens e recuperar o perfil de intensidade, como mostrado na Figura 2um. Isso é útil para determinar se ou não demasiado fotobranqueamento ocorreu. Se houver demasiada branqueamento, os dados não são apropriados para uma análise mais aprofundada. Nota: ImageJ também pode ser útil para converter imagens em TIFF de formatos comerciais. O software de nandb descrito abaixo só pode trabalhar com arquivos TIFF.</li>
	<li>Baixe e instale o R e RStudio15,16. É melhor fazer o download e instalar R primeiro e, em seguida, RStudio. Nota: O que se segue é uma descrição de como usar o pacote de nandb R. Conhecimento da língua R não é necessário para usar nandb, no entanto, isso irá facilitar a vida.</li>
	<li>Instale o pacote nandb.<ol>
<li>Abra RStudio e no console, digite install.packages("nandb") e aguarde a instalação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conheça nandb<ol>
<li>Revise o manual17.</li>
		<li>Rever a ajuda interna do RStudio para várias funções. A função mais provável a ser usado será usando será brightness(). Exibir o arquivo de ajuda para essa função, digite? Brightness() no console.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular o brilho<ol>
<li>Dizem que um tem um arquivo de imagem na área de trabalho chamado img001.tif (nota que 'nandb' só funciona com arquivos TIFF). Se pode calcular o brilho da imagem: b <-brilho ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")<ol>
<li>Ela atribui o brilho da imagem com a variável b em R. O tau = "auto" garante que a imagem é detrended corretamente antes do cálculo do brilho. A coisa mais comum para fazer a partir daqui é calcular a média ou mediano brilho da imagem. Pode fazer isso digitando mean(b) ou median(b). Um pode também gravar a imagem de brilho para a área de trabalho usando ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dizem que um tem pasta cheia de imagens images_folder na área de trabalho e é necessário calcular os brilhos destas imagens e gravar as imagens de brilho como arquivos TIFF. Então vê? brightness_folder(). Esta função processa uma pasta inteira de uma vez: brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto") Isto é particularmente bom para aqueles que têm um software que eles preferem R, porque todos os arquivos são processados em um único comando, e então um pode continuar a trabalhar com as imagens TIFF do brilho de saída em seu software escolhido, seja ImageJ14 , Python ou outra coisa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pair+forster+resonance+energy+transfer%3A+A+versatile+tool+to+investigate+protein+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics.</a> BioEssays. 40, (2018).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+fluorescence+lifetime+correlation+spectroscopy+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell.</a> Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).</li>
<li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li>
<li>Tramier, M., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+anisotropy+imaging+microscopy+for+homo-FRET+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).</li>
<li>Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein+aggregation+and+interaction+in+live+cells%3A+A+guide+to+number+and+brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nandb-number+and+brightness+in+R+with+a+novel+automatic+detrending+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm.</a> Bioinformatics. , (2017).</li>
<li>Hur, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurement+of+Brightness+from+Living+Cells+in+the+Presence+of+Photodepletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion.</a> PLoS One. 9, (2014).</li>
<li>Amara, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+dimerizer+for+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).</li>
<li>Rollins, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligand-reversible+dimerization+system+for+controlling+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).</li>
<li>R: A Language and Environment for Statistical Computing. <a target="_blank" href="NULL">R Core</a>. , (2017).</li>
<li>RStudio: Integrated Development Environment for R. <a target="_blank" href="http://web.warwick.ac.uk/statsdept/useR-2011/abstracts/180111-allairejj.pdf">R Team</a>. , (2016).</li>
<li>Nolan, R. nandb R package. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=nandb">https://CRAN.R-project.org/package=nandb</a> (2017).</li>
<li>Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysics+of+green+fluorescent+protein%3A+influence+of+the+key+amino+acids+at+positions+65%2C+203%2C+and+222%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222.</a> Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Butkevich, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+fluorescent+dyes+for+live-cell+labeling%3A+synthesis%2C+spectra+and+super-resolution+STED%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%3A+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED.</a> Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

N & B são uma técnica para detectar multimerization usando luz comercial varredura confocal microscópios equipados com detectores digitais. Esta abordagem é bastante atraente em relação ao único ponto FCS, FCCS e smFRET porque é livre de calibração e o cálculo de brilho é simples e independente de concentração6. É de grande importância, no entanto, para corrigir a flutuações de intensidade do branqueamento e a longo prazo antes de executar os cálculos de brilho9; um ligeiro...

Da proteína-proteína interações eu n Vitro
Tradicionalmente, cristalografia e experimentos de ressonância magnética nuclear combinados com microscopia cryo-elétron (cryoEM) são as tecnologias escolhidas para descrever com precisão a arquitetura tridimensional de proteínas e inferir sua função por examinando seus detalhes estruturais de alta resolução. Proteínas, no entanto, não são estruturas estáticas e podem se submeter a uma variedade de mudanças conformacionais e vibrações no tempo e no espaço. Eis porque estruturais informações cristalográficas ou CryoEM de dados precisa ser complementado com outras técnicas (por exemplo, simulações de dinâmica molecular e molécula técnicas): a função de uma proteína está relacionada com sua conformacional alterações e interações e esta informação não está presente em uma estrutura estática. A fim de sondar para dinâmica intra molecular, técnicas baseadas numa única molécula Forster ressonância transferência de energia (smFRET) são muito eficaz1. Essas abordagens são capazes de avaliar diferentes subpopulações de moléculas em meios complexos. Isto é muito importante, como essas mudanças são rápidas e ocorrem durante a aquisição dos dados (ou seja, nanossegundos para segundo intervalo).
Duas abordagens principais são comumente empregadas para detectar e quantificar estas mudanças: proteínas em solução e superfície-imobilização. Para a deteção de interações inter moleculares e, em particular, o processo de dimerização induzida por ligantes, smFRET nem sempre é a melhor ferramenta. Com efeito, FRET depende não só a distância (≈10 nm), mas também na orientação dos dois dipolos (doador e aceptor, χ2) e a sobreposição das emissões doador com espectros de absorção2 do aceitador, mas talvez esta última circunstância é menor importante desde que o experimentalista pode escolheu o casal certo de traste. Uma desvantagem particular do smFRET para sondar homo-dimerização provém da rotulagem da proteína de interesse: para smFRET hetero, dimerização só pode ser detectado até 50% (ou seja, hetero-FRET só será capaz de detectar o doador-aceitador e doador-aceitador homo-dímeros mas não doador-doador ou aceptor-aceitador, que é os outros 50% dos dímeros). O uso de espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) e derivados (FCCS, etc.3) para determinar as constantes de difusão de proteína e vinculação constantes em vitro é outra alternativa. Essas abordagens não são capazes de totalmente quantificar homo-dimerização ou, como no FCS um medidas concentração e difusão e o raio e a difusão coeficiente de uma partícula difusão dependem muito mal o peso molecular; por exemplo um aumento de 10 vezes o peso molecular apenas implicará uma mudança de 2,15 dobra na difusão coeficiente4. No caso de duas cores FCS ou FCCS, apenas 50% dos homo-dímeros será considerada pelo mesmo motivo acima. Abordagens mais práticas e quantitativas para detectar homo-dimerização in vitro e em vivo são homo-FRET5 e o número e o brilho (N &amp; B)6. Dado o fato de que homo-FRET requer recuperação de instrumentação específica do anisotropy valor (ou seja, óptica elementos/analisadores para recuperar a polarização paralela e perpendicular), N &amp; B é apresentado aqui como uma técnica favorável para detecta a proteína homo-dimerização e agregação. Pode ser empregado tanto in vitro e em vivo com uma armadilha comercial.
Número e brilho
N &amp; B tem sido recentemente revistos7. Essa revisão focada sobre a aplicação da técnica em células vivas. Vale a pena reproduzir aqui o formalismo matemático como estas equações será aplicado aos dados coletados em vitro. Em primeiro lugar, é necessário definir alguns termos e quantidades matemáticas:
<ul><li>Uma entidade é um conjunto de moléculas que são vinculados juntos.</li>
	<li>O brilho ε de uma entidade é o número de fótons que emite por unidade de tempo (por quadro).</li>
	<li>
n é o número de entidades presentes.</li>
	<li>Para um determinado pixel ao longo de uma série de imagem, &lt; i &gt; é que sua média intensidade e σ2 é a variância em sua intensidade.</li>
</ul>Em seguida, com contagem de fótons detectores e assumindo entidades móveis e sem fundo,
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq2.jpg">
onde N é o número aparente e B é o brilho aparente. Isso resulta em
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq4.jpg">
Damasceno et al 8 mostrou que com equipamento analógico, um precisa de três termos de correção: o fator de S, o fundo em deslocamentoe o ruído de leitura σ02. Então, novamente, supondo que entidades móveis,
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq6.jpg">
dando
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq8.jpg">
Observe que a equação acima é diferente que dado em Damasceno et al 8 e uma revisão posterior. 7 em Damasceno et al a S no denominador foi omitido devido a um erro de digitação, e esse erro foi reproduzido na revisão. A equação acima é a correta. Instruções para medição S, deslocamento e σ02 - juntamente com uma explicação do seu significado - são dadas por Damasceno et al 8
Ε o brilho é proporcional ao estado oligoméricos das entidades difusão: ε será duas vezes tão grande por dímeros como para monômeros, três vezes maior para Trímeros como para monômeros, o dobro do tamanho para hexâmeros como para Trímeros e assim por diante. Desta forma, medindo o brilho ε, pode-se quantificar qualquer tipo de multimerization.
Se há uma mistura de Estados oligoméricas número de presente, e brilho não é capaz de recuperar os Estados individuais oligoméricos presentes. Esta é uma limitação da técnica.
Detrend software algoritmo e nandb
A importância de corrigir por fotobranqueamento tem sido salientada anteriormente9. Fotobranqueamento inevitavelmente ocorre durante experimentos de microscopia de luz no modo de lapso de tempo; tanto em células vivas e em vitro. Muitas abordagens têm sido descritas na literatura para corrigir para o branqueamento de7. A técnica de filtragem exponencial com escolha automática de detrending parâmetro T é o atual melhor. Ele é integrado com o livre, open source software nandb9. Com efeito, software que requer que o usuário escolher manualmente o parâmetro detrending pode levar a resultados incorretos porque esta escolha do parâmetro provavelmente será arbitrário e incorrecto. O algoritmo automático inspeciona os dados e determina o parâmetro apropriado para ele, sem a necessidade de intervenção do usuário9. Mesmo com a melhor escolha de parâmetro de suavização, detrending tem suas limitações e funciona bem apenas com fotobranqueamento porcentagens inferiores a 25%, como mostrado com simulações9. Curiosamente, quando usando a rotina detrending automática, sua precisão é tal que um pode trabalhar com valores de brilho baixo (mesmo B &lt; 1.01) e, portanto, de baixa intensidade e ainda ser suficientemente precisas para quantificar homo-dimerização.
Fotobranqueamento também causa outro problema: a presença de fluorophores foto em um complexo de multimer. Assim, por exemplo, um trímero aparecem como um dímero quando uma das três unidades no trímero é não-fluorescente. Hur e Mueller10 mostraram como corrigir para isso e esta correção também salientou em uma posterior revisão7. O software de nandb inclui esta correção9.
A FKBP12 F36V sistema
FKBP12F36V é uma proteína que naturalmente não oligomerize, mas é conhecida por dimerizam após a adição da droga (coloquialmente conhecida como o BB dimerizing ligante)11,AP2018712. Isso torna um caso de teste ideal para número e brilho: com FKBP12F36V rotulados, uma duplicação de estado oligoméricos deve ser observada após a adição do BB.

<table><tbody><tr><td>Células RosettaTM (DE3) pLysS</td><td>Novagen</td><td>70956-3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem ID da substância 329824407</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem ID da substância: 24892250</td><td></td></tr><tr><td>LB cultura inicial</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB meio</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem Substance ID 329815691</td><td></td></tr><tr><td>IMAC buffer</td><td>Medicago</td><td>09-1010-10</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de protease livres de EDTA&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON resina</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Níquel sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 16/60 coluna</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fundo de vidro 8 poços prato de observação</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

livre de calibração em vitro quantificação da proteína homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, open source software de análise de brilho

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Número e o brilho é uma técnica de espectroscopia (FFS) de flutuação livre de calibração fluorescência para detectar proteínas homo-oligomerização. Pode ser empregado usando um microscópio confocal convencional equipado com detectores digitais. Um protocolo para o uso da técnica em vitro é mostrado por meio de um caso de uso, onde o número e o brilho podem ser vistos para quantificar com precisão o estado oligoméricos de FKBP12F36V mVenus-rotulados antes e após a adição da droga dimerizing AP20187. A importância de usar os parâmetros de aquisição de microscópio correto e os métodos de pré-processamento e análise de dados corretos são discutidos. Em particular, a importância da escolha de fotobranqueamento correção está estressada. Este método de baixo custo pode ser empregado para estudar interações da proteína-proteína em muitos contextos biológicos.

Brilho detrending e monomérico
Uma vez que os dados foi adquiridos, um pode começar os cálculos de brilho para determinar o estado oligoméricos da proteína de interesse na solução. Mesmo se o efeito de clareamento em solução pode não ser tão drástico como isso pode ser na vivo, o rastreamento de intensidade ainda terá provavelmente não significa estacionária, possivelmente devido a efeitos de photophysi...

Este protocolo descreve uma abordagem livre de calibração para quantificação da proteína homo-oligomerização em vitro baseado em espectroscopia de fluorescência flutuação utilizando microscopia de luz comercial. As configurações corretas de aquisição e métodos de análise são mostrados.

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da triagem de medicamentos, como elucidar o efeito de inibidores de moléculas pequenas em concentrações muito baixas para interações proteína-proteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela é livre de calibração, pode ser implementada em qualquer microscópio confocal e utiliza quantidades muito pequenas de proteínas marcadas. As implicações dessa técnica se estendem ao desenvolvimento de medicamentos contra o câncer, inibidores de moléculas pequenas e vários inibidores de fusão, pois fornece informações quantitativas sobre as interações proteína-proteína.Embora esse método possa fornecer informações sobre interações e agregações de proteínas in vitro, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como dinâmica de proteínas de células vivas e interações célula-célula. Para começar, transforme as células pLysS com um vetor pET-22b contendo FKBP12 humano monomerizado e tags N-terminal His6 e mVenus. Depois que as células se recuperarem da incubação e do choque térmico, coloque-as em ágar LB suplementado com antibióticos.Transfira as colônias transformadas para uma cultura inicial de 100 mililitros LB e cresça por 16 a 20 horas a 37 graus Celsius com agitação. Após a incubação, diluir a cultura inicial densa de um a 100 em meio LB em dois lotes de 500 mililitros. Em seguida, cresça por duas a três horas até uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,6 a 0,8.Após o resfriamento das culturas em gelo, induzir a produção de proteínas com IPTG 250 micromolares. Cultive as culturas por 16 a 20 horas a 21 graus Celsius e 200 rpm. Em seguida, colher células por centrifugação a 2.000 g por 20 minutos.Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 40 mililitros de tampão IMAC A suplementado com inibidores de protease livres de EDTA. Agora, sonice as células a 500 watts, 20 kilohertz e 40% de amplitude a nove segundos ligados, 11 segundos desligados por 15 minutos no gelo. Após a sonicação, colher o material solúvel por centrifugação a 20.000 g por uma hora a quatro graus Celsius.Transfira o lisado solúvel para um frasco cônico e adicione dois mililitros de resina TALON. Deixe a suspensão incubar por uma hora com rotação de 105 rpm. Agora, colha a resina e lave-a com 250 mililitros de tampão IMAC A seguido por 500 mililitros de tampão IMAC B. Eluir a proteína marcada com His6 usando o tampão IMAC C. Injete o eluído em uma coluna de exclusão de tamanho pré-equilibrada e colete o pico FKBP12, que elui a aproximadamente 87,7 mililitros.Avalie a pureza da proteína via SDS-PAGE, agrupe e concentre conforme necessário. Para configurar a matriz de placas multipoços, primeiro prepare uma solução de FKBP12 purificada com 100 nanomolares no mesmo tampão usado para cromatografia de exclusão de tamanho. Sonicar e centrifugar com centrifugação rápida de 13.000 rpm para evitar a formação de agregados.Agora, pipete de 100 a 200 microlitros da proteína diluída em uma câmara de observação de oito poços com fundo de vidro. Adicione o dímero BB às concentrações finais de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nanomolares. Como referência, prepare uma solução de mVênus de 100 nanomolares sozinho para avaliar os efeitos potenciais de agregação e precipitação e recuperar um valor de brilho para o monômero com as mesmas configurações de aquisição.Qualquer sistema confocal de microscópio de varredura de luz equipado com detectores digitais ou detectores analógicos bem caracterizados e capaz de manter um tempo de permanência constante para cada pixel adquirido pode ser usado. Selecione a objetiva de imersão em água de correção de colar projetada para espectroscopia de correlação de fluorescência. Agora, adicione uma gota de água à objetiva de imersão em água de correção do colarinho.Monte a câmara de observação de oito poços no palco. Defina o caminho do feixe de excitação ligando o laser de 514 nanômetros e configurando-o para uma potência de 20 a 100 nanowatts na saída da objetiva. Ligue um detector HyD.Detectores capazes de contagem de fótons são preferíveis. Selecione a janela de emissão de 520 a 560 nanômetros. Para o modo de aquisição, use 16 por 16 pixels.Defina o tempo de permanência do pixel de forma que o tempo do quadro seja maior do que a difusão da proteína e o tempo de permanência do pixel seja muito menor. Isso correspondeu a definir o tempo de permanência para aproximadamente 13 microssegundos para o sistema usado nesta demonstração. Defina o orifício em uma unidade Airy para a emissão correspondente de aproximadamente 545 nanômetros.Selecione o modo de aquisição de tempo xy e selecione o número de quadros a serem adquiridos por aquisição e poço. Agora, defina o tamanho do pixel em aproximadamente 120 nanômetros. Se o sistema estiver equipado com o modo de alto rendimento, introduza as coordenadas de cada poço e o número de aquisições por poço para automatizar o processo.Se o sistema estiver equipado com um sistema de perfusão, carregue a solução BB e programe a perfusão para começar logo após o 5.000º quadro para avaliar a cinética de dimerização enquanto adquire 10.000 imagens. Selecione o poço correto e concentre-se na solução. Em seguida, inicie a aquisição e salve a pilha de imagens resultante no formato TIFF.Sequências de 20.000 imagens de FKBP12 mVenus purificado em solução de 100 nanômetros foram adquiridas conforme especificado na seção do protocolo. A intensidade do primeiro quadro é mostrada junto com o perfil de intensidade média da imagem sem tendência. O brilho sem e com filtragem suave também é mostrado.Após a aquisição de 10.000 quadros, o medicamento homodimerizante BB foi adicionado à solução durante a aquisição. Cada série consecutiva de 5.000 quadros foi analisada. O brilho médio cinco minutos após a adição do BB foi de 1,010, o que é um aumento de duas vezes, indicando um dímero FKBP12.A cinética do processo mostra um atraso entre a adição de BB e a dimerização total de FKBP12 de aproximadamente dois minutos. Um aspecto fundamental para avaliar as interações proteína-proteína in vitro é a produção e purificação de sua proteína marcada. Certifique-se de ter pequenas quantidades da proteína de interesse rotulada e que sua proteína não esteja agregando de acordo com sua análise.Após este procedimento, outros métodos, como ressonância plasmônica de superfície ou espectroscopia de correlação de fluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como constantes de dissociação ou coeficientes de difusão. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biofísica explorarem em detalhes as interações proteína-proteína em células vivas. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes para purificação de proteínas pode ser extremamente perigoso, e cuidados, como óculos de segurança, luvas, devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.

calibration-free-vitro-quantification-protein-homo-oligomerization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Empregando um espectralmente resolvido dois fótons sistema de imagens de microscopia, pixel-nível mapas de Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eficiências são obtidas para células que expressam receptores de membrana para formar a hipótese de homo-oligoméricos complexos. Da FRET mapas eficiência, somos capazes de estimar informações sobre o complexo estequiométrico oligômero em estudo.

Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

Este vídeo demonstra a técnica de espectroscopia de flutuação de fluorescência (FFS) para estudar a homo-oligomerização de proteínas. As proteínas marcadas com fluorescência em uma amostra são dimerizadas usando um agente ao estudar a oligomerização de proteínas usando FFS. Usando um microscópio confocal, à medida que as proteínas se movem para dentro e para fora do pequeno volume de observação, a análise das flutuações no brilho das moléculas fluorescentes é realizada para determinar o estado...

Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Homo-Oligomerização de Proteínas

Aqui relatamos protocolos para detectar proteínas endógenas e exógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas e quantificar esses níveis de proteína em centrômeros-cinetocoros por coloração imunofluorescente indireta através do uso de fixação (fixação de paraformaldeído, acetona ou metanol).

Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de três cores de smFRET e sua análise com um ensemble 3D Hidden Markov modelo. Com esta abordagem, cientistas podem extrair informações cinéticas de sistemas complexos proteína, incluindo cooperatividade ou interações correlacionadas.

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&amp;B).

Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

A ubiquização CENP-A é um importante requisito para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular. Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização da proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) marcada pela EYFP.

Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

Descrevemos protocolos para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS) que envolvem os ligases ubiquitina Von Hippel-Lindau E3 ligase (BVS) e Cereblon (CRBN).  Os métodos biofísicos aqui ilustrados incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).

Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

Este protocolo combina fotometria de massa com um novo sistema microfluídico para investigar interações proteína-proteína de baixa afinidade. Essa abordagem é baseada na rápida diluição de complexos altamente concentrados em solução, o que permite medições de baixa afinidade e amplia a aplicabilidade da fotometria de massa.

Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

Aprenda a quantificar homo-oligomerização de proteínas in vitro usando espectroscopia de flutuação de fluorescência sem calibração. Este método acessível auxilia no desenvolvimento de medicamentos anticâncer e inibidores de fusão.

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho (Vídeo) | JoVE Journal

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

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