Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da triagem de medicamentos, como elucidar o efeito de inibidores de moléculas pequenas em concentrações muito baixas para interações proteína-proteína. A principal vantagem dessa técnica é que ela é livre de calibração, pode ser implementada em qualquer microscópio confocal e utiliza quantidades muito pequenas de proteínas marcadas. As implicações dessa técnica se estendem ao desenvolvimento de medicamentos contra o câncer, inibidores de moléculas pequenas e vários inibidores de fusão, pois fornece informações quantitativas sobre as interações proteína-proteína.

Embora esse método possa fornecer informações sobre interações e agregações de proteínas in vitro, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como dinâmica de proteínas de células vivas e interações célula-célula. Para começar, transforme as células pLysS com um vetor pET-22b contendo FKBP12 humano monomerizado e tags N-terminal His6 e mVenus. Depois que as células se recuperarem da incubação e do choque térmico, coloque-as em ágar LB suplementado com antibióticos.

Transfira as colônias transformadas para uma cultura inicial de 100 mililitros LB e cresça por 16 a 20 horas a 37 graus Celsius com agitação. Após a incubação, diluir a cultura inicial densa de um a 100 em meio LB em dois lotes de 500 mililitros. Em seguida, cresça por duas a três horas até uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,6 a 0,8.

Após o resfriamento das culturas em gelo, induzir a produção de proteínas com IPTG 250 micromolares. Cultive as culturas por 16 a 20 horas a 21 graus Celsius e 200 rpm. Em seguida, colher células por centrifugação a 2.000 g por 20 minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 40 mililitros de tampão IMAC A suplementado com inibidores de protease livres de EDTA. Agora, sonice as células a 500 watts, 20 kilohertz e 40% de amplitude a nove segundos ligados, 11 segundos desligados por 15 minutos no gelo. Após a sonicação, colher o material solúvel por centrifugação a 20.000 g por uma hora a quatro graus Celsius.

Transfira o lisado solúvel para um frasco cônico e adicione dois mililitros de resina TALON. Deixe a suspensão incubar por uma hora com rotação de 105 rpm. Agora, colha a resina e lave-a com 250 mililitros de tampão IMAC A seguido por 500 mililitros de tampão IMAC B. Eluir a proteína marcada com His6 usando o tampão IMAC C. Injete o eluído em uma coluna de exclusão de tamanho pré-equilibrada e colete o pico FKBP12, que elui a aproximadamente 87,7 mililitros.

Avalie a pureza da proteína via SDS-PAGE, agrupe e concentre conforme necessário. Para configurar a matriz de placas multipoços, primeiro prepare uma solução de FKBP12 purificada com 100 nanomolares no mesmo tampão usado para cromatografia de exclusão de tamanho. Sonicar e centrifugar com centrifugação rápida de 13.000 rpm para evitar a formação de agregados.

Agora, pipete de 100 a 200 microlitros da proteína diluída em uma câmara de observação de oito poços com fundo de vidro. Adicione o dímero BB às concentrações finais de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nanomolares. Como referência, prepare uma solução de mVênus de 100 nanomolares sozinho para avaliar os efeitos potenciais de agregação e precipitação e recuperar um valor de brilho para o monômero com as mesmas configurações de aquisição.

Qualquer sistema confocal de microscópio de varredura de luz equipado com detectores digitais ou detectores analógicos bem caracterizados e capaz de manter um tempo de permanência constante para cada pixel adquirido pode ser usado. Selecione a objetiva de imersão em água de correção de colar projetada para espectroscopia de correlação de fluorescência. Agora, adicione uma gota de água à objetiva de imersão em água de correção do colarinho.

Monte a câmara de observação de oito poços no palco. Defina o caminho do feixe de excitação ligando o laser de 514 nanômetros e configurando-o para uma potência de 20 a 100 nanowatts na saída da objetiva. Ligue um detector HyD.

Detectores capazes de contagem de fótons são preferíveis. Selecione a janela de emissão de 520 a 560 nanômetros. Para o modo de aquisição, use 16 por 16 pixels.

Defina o tempo de permanência do pixel de forma que o tempo do quadro seja maior do que a difusão da proteína e o tempo de permanência do pixel seja muito menor. Isso correspondeu a definir o tempo de permanência para aproximadamente 13 microssegundos para o sistema usado nesta demonstração. Defina o orifício em uma unidade Airy para a emissão correspondente de aproximadamente 545 nanômetros.

Selecione o modo de aquisição de tempo xy e selecione o número de quadros a serem adquiridos por aquisição e poço. Agora, defina o tamanho do pixel em aproximadamente 120 nanômetros. Se o sistema estiver equipado com o modo de alto rendimento, introduza as coordenadas de cada poço e o número de aquisições por poço para automatizar o processo.

Se o sistema estiver equipado com um sistema de perfusão, carregue a solução BB e programe a perfusão para começar logo após o 5.000º quadro para avaliar a cinética de dimerização enquanto adquire 10.000 imagens. Selecione o poço correto e concentre-se na solução. Em seguida, inicie a aquisição e salve a pilha de imagens resultante no formato TIFF.

Sequências de 20.000 imagens de FKBP12 mVenus purificado em solução de 100 nanômetros foram adquiridas conforme especificado na seção do protocolo. A intensidade do primeiro quadro é mostrada junto com o perfil de intensidade média da imagem sem tendência. O brilho sem e com filtragem suave também é mostrado.

Após a aquisição de 10.000 quadros, o medicamento homodimerizante BB foi adicionado à solução durante a aquisição. Cada série consecutiva de 5.000 quadros foi analisada. O brilho médio cinco minutos após a adição do BB foi de 1,010, o que é um aumento de duas vezes, indicando um dímero FKBP12.

A cinética do processo mostra um atraso entre a adição de BB e a dimerização total de FKBP12 de aproximadamente dois minutos. Um aspecto fundamental para avaliar as interações proteína-proteína in vitro é a produção e purificação de sua proteína marcada. Certifique-se de ter pequenas quantidades da proteína de interesse rotulada e que sua proteína não esteja agregando de acordo com sua análise.

Após este procedimento, outros métodos, como ressonância plasmônica de superfície ou espectroscopia de correlação de fluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como constantes de dissociação ou coeficientes de difusão. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biofísica explorarem em detalhes as interações proteína-proteína em células vivas. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes para purificação de proteínas pode ser extremamente perigoso, e cuidados, como óculos de segurança, luvas, devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.