Name: Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprenda a fixação pulmonar com pressão constante para avaliação histológica de enfisema em camundongos. Este método permite fixar múltiplos pulmões simultaneamente sem colapso, garantindo espécimes estáveis para análise morfométrica.

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Este trabalho foi apoiado em parte pelo JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) e pelo Instituto de medicina ambiental e de gênero, faculdade de medicina da Universidade de Juntendo, Grant Number E2920 (T. Sato). O financiador não teve nenhum papel no desenho dos métodos atuais e na escrita do manuscrito.

Os seguintes métodos foram aprovados pelos comitês de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina da Universidade Juntendo. As directrizes para a conduta apropriada de experimentos animais, Conselho da ciência de Japão, junho 1, 2006 foram seguidas. Existem três etapas principais neste método: 1) dissecção do camundongo, 2) exsanguinação pulmonar e 3) fixação de tecidos pulmonares assistidos por equipamentos especializados. Tipicamente, os espécimes do pulmão são processados ao Embebimento após 48 h da fixação12,15,16,17,18.
1. dissecção do rato
<ol><li>Meça o peso de corpo do rato, a seguir determine a quantidade de pentobarbital a administrar.</li>
	<li>Injete pentobarbital via intraperitoneal em uma dosagem de 70 MGS/quilograma do peso corporal e confirme a anestesia pela ausência de reação à pitada do dedo do pé.</li>
	<li>Injete a agulha em um ângulo de 45 ° até que penetre a pele e o músculo. Desenhe o êmbolo e confirme um vácuo de ar e, em seguida, injete o pentobarbital.</li>
	<li>Confirme a anestesia pela ausência de movimento reflexo. Nota: usar o rato anestesiado em oposição a um rato eutanasiado é recomendado para a exsanguinação total do pulmão.</li>
	<li>Corte a pele do rato e o músculo abdominal na linha medial, visando a área cefólica.</li>
	<li>Corte lateralmente para fornecer um espaço de trabalho mais largo.</li>
</ol>2. exsanguinação pulmonar
<ol><li>Exponha a camada de diafragma e perfure-a com fórceps.</li>
	<li>Abra o espaço torácico e corte a área esternal, permitindo que os pulmões e o coração sejam vistos claramente.</li>
	<li>Corte o coração no átrio esquerdo e no ventrículo direito.</li>
	<li>Inserir uma cânula (24 G) na área do ventrículo direito e direcioná-la para a área cefólica até atingir a artéria pulmonar, como mostra a Figura 1.</li>
	<li>Gire sobre a bomba e permita que o 1x fosfato-tampão salino (PBS) circule (aproximadamente 200 mL/h) até que todo o tecido do pulmão mude a uma cor branca.</li>
</ol>3. fixação do tecido pulmonar
<ol><li>Retire a traquéia, pulmões e coração.</li>
	<li>Libertar todos os três órgãos cortando os tecidos conjuntivos circundantes.</li>
	<li>Amarre o brônquio principal direito com um fio de sutura e corte todos os lóbulos do pulmão direito.</li>
	<li>(Opcional): os lóbulos do pulmão direito consistem em quatro partes. Corte estas peças do brônquio principal direito e divida as peças para processamento como amostras de tecido congelado.</li>
	<li>Insira o coração e os lóbulos do pulmão esquerdo em agentes de fixação, localizados dentro de uma seringa de 10 mL. PRECAUÇÃO: os agentes de fixação são perigosos. Use equipamento de proteção adequado (por exemplo, luvas de borracha longas) e trabalhe em um quarto bem ventilado.</li>
	<li>Criar uma condição de vácuo usando uma seringa de 10 mL para inflar o pulmão, como mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Inserir uma cânula (20 G) na traquéia e amarrar um nó.</li>
	<li>Inflar o pulmão com agentes de fixação para verificar com vazamentos, usando uma seringa de 1 mL.</li>
	<li>Transferência para equipamento de pressão de fixação pulmonar, conforme ilustrado na Figura 3.</li>
	<li>Após períodos de fixação, retire a amostra de pulmão que amarra a traquéia com um nó.</li>
</ol>

<ol><li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+strategy+for+the+diagnosis%2C+management%2C+and+prevention+of+chronic+obstructive+lung+disease+2017+report.+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li>
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<li>Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+inhibits+alveolar+repair%3A+a+mechanism+for+the+development+of+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).</li>
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<li>Koike, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+lack+of+vitamin+C+intake+generates+pulmonary+emphysema+in+senescence+marker+protein-30+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice.</a> American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).</li>
<li>Koike, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+prevents+cigarette+smoke-induced+pulmonary+emphysema+in+mice+and+provides+pulmonary+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+pure+water+prevents+cigarette+smoke-induced+pulmonary+emphysema+in+SMP30+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).</li>
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<li>Maeno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+are+required+for+inflammation+and+destruction+in+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).</li>
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</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes para declarar.

O procedimento de fixação para os pulmões de roedores aqui apresentados não é novidade; no entanto, este sistema tem várias vantagens. Em primeiro lugar, pode fixar muitos pulmões (máximo de 20) com a mesma condição de uma só vez. A sociedade de patologia toxicológica afirma que a pressão para a instilação da gravidade varia de 22 – 25 cmH2O22. Notavelmente, vários estudos têm realizado fixação pulmonar a uma pressão de 25 cmH2O13,<sup class...

A DPOC é uma das principais causas mundiais de óbito1. A fumaça do cigarro é a causa mais importante da DPOC, mas os mecanismos de patogênese permanecem incompletamente definidos. A DPOC demonstra duas características principais, incluindo a limitação progressiva do fluxo aéreo e uma resposta inflamatória anormal do pulmão. A desordem emphysematous ocorre freqüentemente nos pulmões de pacientes de DPOC2. Os achados patológicos do enfisema são caracterizados pela destruição da parede alveolar3. Várias espécies animais têm sido utilizadas para gerar modelos de DPOC in vivo (ou seja, cães, cobaias, macacos e roedores)4. No entanto, o mouse se tornou o mais comumente usado na construção de modelos de DPOC. Isso tem muitas vantagens, incluindo seu baixo custo, capacidade de ser geneticamente modificada, extensa disponibilidade de informação genômica, disponibilidade de anticorpos e capacidade de usar uma variedade de cepas de mouse5. Presentemente, não há nenhum modelo do rato que possa imitar as características cheias da DPOC humana; assim, os pesquisadores individuais devem escolher qual modelo é mais adequado para a pesquisa específica de DPOC6. O modelo do rato emphysematous é um de muitos modelos do rato de DPOC que estão atualmente disponíveis. Modelos adicionais incluem o modelo de exacerbação do camundongo, modelo de comorbidades sistêmicas e modelo de suscetibilidade à DPOC7.
O modelo emphysematous do rato pode ser gerado por diversos tipos de agentes exógenos, incluindo agentes químicos e exposição do fumo do cigarro4. A exposição química (por exemplo, a elastase) produz um tipo severo de enfisema, enquanto o fumo do cigarro resulta em enfisema leve8,9. Acredita-se que a fumaça do cigarro seja a principal causa para a patogênese da DPOC; Portanto, a escolha da fumaça do cigarro como um meio para criar um modelo de mouse de DPOC é razoável10. Muitos estudos usaram fumaça de cigarro para criar enfisema no mouse. Por exemplo, Nikula et al. criaram com sucesso um modelo emphysematous do rato de B6C3F1 ratos fêmeas expondo os à fumaça de cigarro por 7 ou 13 meses11. Nós igualmente estabelecemos um modelo emphysematous do rato através do marcador da senescência protein/SMP-30 ratos de KO12. É crucial executar um método da fixação do pulmão que possa corretamente Visualizar este modelo suave do enfisema pela exposição do fumo do cigarro.
Vários métodos para fixação pulmonar foram estabelecidos13. No entanto, não há nenhum método padrão-ouro de fixação do tecido pulmonar para avaliação do enfisema14. Vários estudos deste laboratório mostraram que o sistema de fixação aqui apresentado é útil ao criar uma condição estável para avaliar o enfisema12,15,16,17,18. A vantagem principal do sistema atual é que pode fixar muitos pulmões com a mesma circunstância em uma vez sem colapso ou deflação do pulmão. O sistema atual da fixação do pulmão usa algum equipamento especial que permita que os espécimes do pulmão sejam inflados em uma pressão constante apropriada por um período dado. Este equipamento especial consiste em três porções, incluindo um recipiente mais baixo, um recipiente superior, e uma bomba. Os espécimes pulmonares são colocados no recipiente inferior que está conectado a agentes de fixação pressurizados, resultando em uma diferença de pressão de 25 cmH2o no nível de agentes entre os recipientes superior e inferior19.

<table><tbody><tr><td>10% de formalina (solução tampão neutro de formalina)</td><td>Wako</td><td>060-01667</td><td></td></tr><tr><td>Pinça dobrada</td><td>Hammacher</td><td>HSC187-11</td><td></td></tr><tr><td>Cânula, tamanho 20G</td><td>Terumo</td><td>SR-FS2032</td><td></td></tr><tr><td>Cânula, tamanho 22G</td><td>Terumo</td><td>SR-OT2225C</td><td>Cânula para exsanguinar o pulmão</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Hammacher</td><td>HSC184-10</td><td></td></tr><tr><td>Kimtowel</td><td>Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)</td><td>62011</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente inferior (material de vidro acrílico)</td><td>Tokyo Science</td><td>Custom-made</td><td>Componente de equipamento de pressão</td></tr><tr><td>Bomba de rolo</td><td>Nissin Scientific Corp</td><td>NRP-75</td><td>Máquina de bomba para exsanguinar pulmão</td></tr><tr><td>Bomba de rolo RP-2000</td><td>Eyela (Tóquio Rikakikai Co. Ltd)</td> <td>160200</td><td>Bomba de equipamento de pressão</td></tr><tr><td>Tubo de silicone &Oslash; 9 mm</td><td>Sansyo</td><td>94-0479</td><td>Componente do equipamento de pressão</td></tr><tr><td>Somnopentyl (64,8 mg / mL)</td> <td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>SOM02-YA1312</td><td>Pentobarbital Tesoura cirúrgica de sódio</td></tr><tr><td></td><td>Hammacher</td><td>HSB014-11</td><td></td></tr><tr><td>Fio de sutura, tamanho 0</td><td>Nescosuture</td><td>GA01SW</td><td></td></tr><tr><td>Seringa, 1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Seringa, 1 ml com agulha</td><td>Terumo</td><td>SS-01T2613S</td><td></td></tr><tr><td>Seringa, 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Torneira de três vias</td><td>Terumo</td><td>TS-TR1K01</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente superior (material de vidro acrílico)</td><td>Tokyo Science</td><td>Componente de equipamento de pressão feito sob medida</td><td></td></tr></tbody></table>

fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

O enfisema é uma característica significativa da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Os estudos que envolvem um modelo emphysematous do rato exigem a fixação óptima do pulmão para produzir espécimes histológicos de confiança do pulmão. Devido à natureza da composição estrutural do pulmão, que consiste em grande parte de ar e tecido, há um risco de que ela desmorona ou desestica durante o processo de fixação. Existem vários métodos de fixação pulmonar, cada um dos quais tem suas próprias vantagens e desvantagens. O método de fixação pulmonar aqui apresentado utiliza pressão constante para possibilitar a avaliação tecidual ideal para estudos utilizando um modelo de pulmão de camundongo emphysematoso. A principal vantagem é que ele pode corrigir muitos pulmões com a mesma condição de uma só vez. Os espécimes pulmonares são obtidos de camundongos crônicos expostos ao fumo do cigarro. A fixação pulmonar é realizada por meio de equipamentos especializados que possibilitam a produção de pressão constante. Esta pressão constante mantem o pulmão em um estado razoavelmente inflado. Assim, este método gera um espécime histológico do pulmão que é adequado para avaliar o enfisema leve induzido por fumaça de cigarro.

Conforme descrito anteriormente, o equipamento especializado, que gera pressão constante estendida, pode ser dividido em três partes (Figura 3A). A parte inferior é o ponto no qual se insere a amostra pulmonar (Figura 4a). O pulmão é conectado através de uma cânula (20 G) à ponta do fluxo de formalina usando um galo de parada de três vias (Figura 4B). A pressão é gerada a partir dos...

É apresentado aqui um protocolo útil para a fixação do pulmão que cria uma condição estável para a avaliação histológica de espécimes do pulmão de um modelo do rato do enfisema. A vantagem principal deste modelo é que pode fixar muitos pulmões com a mesma pressão constante sem colapso ou deflação do pulmão.

Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

A pressão constante dentro do dispositivo de fixação mantém os pulmões em um estado razoavelmente inflado gerando um espécime pulmonar histológico adequado para avaliar enfisema leve induzido pela fumaça do cigarro. A principal vantagem deste modelo é que ele pode consertar muitos pulmões ao mesmo tempo usando a mesma pressão constante sem colapso pulmonar ou deflação. Demonstrando o procedimento será Naoko Arano uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Depois de confirmar a falta de resposta ao movimento reflexo fazer uma incisão na pele e tecido muscular ao longo da linha medial do camundongo, visando a região cefálica, e cortar lateralmente para criar um espaço de trabalho mais amplo. Depois de expor a camada de diafragma perfurar o tecido com fórceps e abrir o espaço torácico. Corte a área severa permitindo que os pulmões e o coração sejam visualizados.E corte o átrio esquerdo e o ventrículo direito. Insira uma cânula de 24 bitola conectada a uma bomba de perfusão na área do ventrículo direito e direcione a cânula para a área cefálica até atingir a artéria pulmonar. Em seguida, ligue a bomba e perfunda o tecido com aproximadamente 200 mililitros de PBS por uma hora até que todo o tecido pulmonar tenha mudado para uma cor branca.No final da perfusão corte o tecido conjuntivo ao redor da traqueia, pulmões e coração, e use uma sutura para amarrar o brônquio principal direito. Em seguida, colher todos os lóbulos individuais do pulmão direito e colocar o coração e os lóbulos do pulmão esquerdo em seringas individuais de 10 mililitros contendo um fixador apropriado. Retraia o êmbolo criando um vácuo na seringa para inflar os pulmões e remover o pulmão da seringa.Insira uma cânula de 20 bitolas na traqueia e use uma sutura para fixar a cânula no lugar. Conecte uma seringa de um mililitro cheia de fixação à cânula e encha o pulmão com fixação adicional para verificar se há vazamentos. Certifique-se de que o local de inserção foi fixado para evitar que a amostra pulmonar se desprende da placa pulmonar durante a fixação.Em seguida, transfira o tecido para o equipamento de pressão de fixação pulmonar, removendo a amostra e amarrando a traqueia com um nó no final do período de fixação. O componente inferior do equipamento de pressão de fixação pulmonar no qual a amostra pulmonar está inserida está conectado através de 20 bitolas de bitola à ponta do fluxo de formalina com uma torneira de três vias. A pressão é gerada a partir dos diferentes níveis de superfície do fixador entre os compartimentos inferior e superior.A diferença de pressão é de 25 centímetros de água, mas o botão de ajuste de altura pode ser usado para ajustar a pressão para entre 25 e 30 centímetros de água. Uma bomba conecta os recipientes inferiores e superiores, preservando uma diferença de 25 centímetros na altura da superfície fixa, e direciona o fluxo do agente. Após 48 horas de fixação, os pulmões de ratos eliminatórios SMP30 expostos ao ar ambiente não exibem um alargamento marcado do espaço aéreo.O alargamento significativo do espaço aéreo e a destruição da parede alveolar, no entanto, são observados em camundongos eliminatórios SMP30 expostos à fumaça crônica do cigarro. Além disso, a interceptação linear média e o índice destrutivo dos espécimes pulmonares são significativamente maiores na fumaça exposta smp30 ratos nocaute do que no ar expostos animais. Nosso laboratório usa 10% de formalina, mas os pesquisadores podem usar outros agentes de fixação de acordo com suas necessidades experimentais.Como relatamos usando o sistema de fixação demonstrado, amostras pulmonares podem ser colhidas de vários modelos de enfisema de camundongos para sua avaliação morfométrica. Como os agentes de fixação podem ser perigosos sempre use os equipamentos de proteção pessoal adequados e trabalhem em uma sala bem ventilada.

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Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos

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