Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos
26 de setembro de 2019
É apresentado aqui um protocolo útil para a fixação do pulmão que cria uma condição estável para a avaliação histológica de espécimes do pulmão de um modelo do rato do enfisema. A vantagem principal deste modelo é que pode fixar muitos pulmões com a mesma pressão constante sem colapso ou deflação do pulmão.
A pressão constante dentro do dispositivo de fixação mantém os pulmões em um estado razoavelmente inflado gerando um espécime pulmonar histológico adequado para avaliar enfisema leve induzido pela fumaça do cigarro. A principal vantagem deste modelo é que ele pode consertar muitos pulmões ao mesmo tempo usando a mesma pressão constante sem colapso pulmonar ou deflação. Demonstrando o procedimento será Naoko Arano uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Depois de confirmar a falta de resposta ao movimento reflexo fazer uma incisão na pele e tecido muscular ao longo da linha medial do camundongo, visando a região cefálica, e cortar lateralmente para criar um espaço de trabalho mais amplo. Depois de expor a camada de diafragma perfurar o tecido com fórceps e abrir o espaço torácico. Corte a área severa permitindo que os pulmões e o coração sejam visualizados.
E corte o átrio esquerdo e o ventrículo direito. Insira uma cânula de 24 bitola conectada a uma bomba de perfusão na área do ventrículo direito e direcione a cânula para a área cefálica até atingir a artéria pulmonar. Em seguida, ligue a bomba e perfunda o tecido com aproximadamente 200 mililitros de PBS por uma hora até que todo o tecido pulmonar tenha mudado para uma cor branca.
No final da perfusão corte o tecido conjuntivo ao redor da traqueia, pulmões e coração, e use uma sutura para amarrar o brônquio principal direito. Em seguida, colher todos os lóbulos individuais do pulmão direito e colocar o coração e os lóbulos do pulmão esquerdo em seringas individuais de 10 mililitros contendo um fixador apropriado. Retraia o êmbolo criando um vácuo na seringa para inflar os pulmões e remover o pulmão da seringa.
Insira uma cânula de 20 bitolas na traqueia e use uma sutura para fixar a cânula no lugar. Conecte uma seringa de um mililitro cheia de fixação à cânula e encha o pulmão com fixação adicional para verificar se há vazamentos. Certifique-se de que o local de inserção foi fixado para evitar que a amostra pulmonar se desprende da placa pulmonar durante a fixação.
Em seguida, transfira o tecido para o equipamento de pressão de fixação pulmonar, removendo a amostra e amarrando a traqueia com um nó no final do período de fixação. O componente inferior do equipamento de pressão de fixação pulmonar no qual a amostra pulmonar está inserida está conectado através de 20 bitolas de bitola à ponta do fluxo de formalina com uma torneira de três vias. A pressão é gerada a partir dos diferentes níveis de superfície do fixador entre os compartimentos inferior e superior.
A diferença de pressão é de 25 centímetros de água, mas o botão de ajuste de altura pode ser usado para ajustar a pressão para entre 25 e 30 centímetros de água. Uma bomba conecta os recipientes inferiores e superiores, preservando uma diferença de 25 centímetros na altura da superfície fixa, e direciona o fluxo do agente. Após 48 horas de fixação, os pulmões de ratos eliminatórios SMP30 expostos ao ar ambiente não exibem um alargamento marcado do espaço aéreo.
O alargamento significativo do espaço aéreo e a destruição da parede alveolar, no entanto, são observados em camundongos eliminatórios SMP30 expostos à fumaça crônica do cigarro. Além disso, a interceptação linear média e o índice destrutivo dos espécimes pulmonares são significativamente maiores na fumaça exposta smp30 ratos nocaute do que no ar expostos animais. Nosso laboratório usa 10% de formalina, mas os pesquisadores podem usar outros agentes de fixação de acordo com suas necessidades experimentais.
Como relatamos usando o sistema de fixação demonstrado, amostras pulmonares podem ser colhidas de vários modelos de enfisema de camundongos para sua avaliação morfométrica. Como os agentes de fixação podem ser perigosos sempre use os equipamentos de proteção pessoal adequados e trabalhem em uma sala bem ventilada.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este protocolo descreve um método de fixação pulmonar que garante condições estáveis para a avaliação histológica de espécimes pulmonares de um modelo murino de enfisema. A técnica permite a fixação de múltiplos pulmões simultaneamente, sem colapso ou desinsuflação.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Histologia
Antecedentes
- A enfisema é uma condição pulmonar frequentemente induzida pela fumaça de cigarro.
- A avaliação histológica é fundamental para compreender a patologia pulmonar.
- A manutenção da inflação pulmonar durante a fixação é essencial para uma avaliação precisa.
- Este protocolo aborda os desafios nas técnicas de fixação pulmonar.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um método confiável para fixação pulmonar.
- Facilitar a avaliação de espécimes pulmonares em pesquisas.
- Melhorar a consistência na análise histológica de modelos de enfisema.
Métodos Utilizados
- Uso de um dispositivo de fixação que mantém pressão constante.
- Incisão ao longo da linha mediana do camundongo para acessar a cavidade torácica.
- Furação do diafragma para abrir o espaço torácico.
- Visualização dos pulmões e do coração para coleta de espécimes.
Resultados Principais
- Manutenção bem-sucedida da inflação pulmonar durante a fixação.
- Capacidade de fixar múltiplos pulmões simultaneamente.
- Espécimes histológicos estáveis adequados para avaliação.
- Demonstração do procedimento por um estudante de pós-graduação.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para fixação pulmonar.
- Ele melhora a qualidade das avaliações histológicas em pesquisas.
- Essa técnica pode ser aplicada a diversos estudos envolvendo patologia pulmonar.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A fixação pulmonar consistente sob pressão constante resolve um desafio crítico em modelos pré-clínicos de doenças respiratórias, permitindo uma avaliação histológica reprodutível de enfisema em camundongos. Este método possibilita uma análise morfométrica confiável, reduzindo a variabilidade e aumentando a confiança preditiva na validação inicial de alvos na pesquisa de DPOC. A capacidade de processar múltiplos espécimes simultaneamente agiliza estudos comparativos e apoia decisões robustas de triagem de portfólio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite avaliação morfométrica padronizada da gravidade do enfisema em modelos de camundongos.
- Apoia a validação funcional de alvos candidatos ao fornecer arquitetura tecidual reprodutível.
- Facilita a redução de riscos biológicos ao minimizar artefatos induzidos pela fixação.
- Aprimora a confiança preditiva na associação de desfechos histológicos a hipóteses mecanicistas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara espécimes pulmonares validados para ensaios histológicos quantitativos subsequentes.
- Garante reprodutibilidade e comparabilidade entre coortes experimentais.
- Permite o processamento escalonável de múltiplas amostras em condições idênticas.
- Permite a avaliação confiável dos efeitos de compostos na estrutura pulmonar em campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos de patologia pulmonar com desfechos relevantes para doenças em estudos translacionais.
- Mantém a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, padronizando o preparo dos tecidos.
- Reduz o risco de achados artifatos que poderiam confundir avaliações de biomarcadores ou eficácia.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados histológicos robustos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de fixação com pressão constante integra-se à descoberta inicial e ao contínuo de validação pré-clínica, apoiando tanto a validação de alvos quanto a identificação de compostos promissores em modelos de doenças respiratórias.
- Biologia da Descoberta: Fornece uma arquitetura tecidual confiável para testes de hipóteses e análise de vias em modelos de enfisema.
- Triagem: Gera resultados histológicos quantitativos e reprodutíveis para avaliação de compostos.
- Análises: Permite medições morfométricas, como o intercepto linear médio e o índice de destruição, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Apoia a correlação entre achados pré-clínicos e a patologia clínica do enfisema, quando aplicável.
- Reutilização Corporativa: Oferece uma capacidade padronizada de fixação adaptável a diversos modelos de doenças pulmonares em camundongos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e a validação de alvos ao minimizar a variabilidade na fixação.
- Valor Operacional: Aumenta a produtividade e a padronização ao permitir a fixação simultânea de múltiplos espécimes.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao apoiar pontos finais histológicos robustos.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de programas para doenças respiratórias com base em dados teciduais confiáveis.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em procedimentos cirúrgicos em camundongos e no manuseio de tecido pulmonar.
- Necessita de equipamento de fixação especializado capaz de manter pressão constante.
- Exige padronização entre equipes dos parâmetros de fixação para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diferentes fixadores conforme as exigências experimentais.
- Deve abordar protocolos de segurança para o manuseio de agentes de fixação perigosos.
