Síntese, Caracterização e Aplicação de Nanoprobes superparamagnéticos de óxido de ferro para detecção de tuberculose extrapulmonar

Globalmente, o diagnóstico extrapulmonar da tuberculose é frequentemente adiado, pois requer uma intervenção cirúrgica para confirmação devido à apresentação clínica não específica e um baixo desempenho em exames diagnósticos. Para melhorar os testes de diagnóstico sorológico para antígenos mycobacterium tuberculosis, desenvolvemos nanoprobes de óxido de ferro super-paramagnético para detectar tuberculose extrapulmonar. Os nanoprobes TB-SPIO podem fornecer imagens precisas de ressonância magnética em baixas concentrações devido às suas propriedades paramagnéticas sem induzir qualquer resposta autoimune.

Os nanoprobes TB-SPIO permitem o direcionamento e detecção da infecção por Mycobacterium tuberculosis. Eles também podem ser aplicados como agente de contraste de ressonância magnética para a detecção de outras doenças. Certifique-se de estudar o protocolo cuidadosamente antes de tentar o protocolo, pois cada parte do experimento utiliza uma tecnologia central específica.

A demonstração visual do método pode ajudar os alunos a entender como implementar o processo, especialmente para alguns dos experimentos mais complicados. Para preparar nanopartículas magnéticas de óxido de ferro revestidas de dextran, combine vigorosamente cinco mililitros de dextran T40 com hexahidato de cloreto férrico aquoso de 45 miligramas e 32 miligramas de soluções de tetrahidrato de cloreto ferroso à temperatura ambiente. Adicione rapidamente 10 mililitros de hidróxido de amônio e use uma barra de mexida para agitar a suspensão preta resultante por uma hora em temperatura ambiente.

No final da incubação de agitação, centrifugar a solução e remover os agregados. Para separar os produtos spio finais do dextran T40 desvinculado, carregue toda a mistura de reação de cinco mililitros em uma coluna de cromatografia de filtração de gel de 2,5 por 33 centímetros e elute o dextran com 0,1-molar de acetato de sódio e 0,15 molar de solução tampor de cloreto de sódio. Em seguida, colete as nanopartículas magnéticas de óxido de ferro purificadas revestidas de dextran no volume vazio e teste as colunas eluadas para ferro e dextran em 330 e 490 nanômetros de acordo com os protocolos padrão.

Para criar anticorpos superficiais Mycobacterium tuberculosis conjugados spio, primeiro sintetize o anidido spio-EDBE-succinic misturando 10 mililitros de uma solução alcalina de SPIO-EBDE com um grama de anidrido succinico por 24 horas à temperatura ambiente. No dia seguinte, use 12.000 a 4.000 tubos de membrana porosa molecular de corte de peso molecular para dialisar a solução com mudanças de 26 horas de dois litros de água destilada por mudança. Após a última mudança, adicione 100 microlitadores da solução resultante a 400 microliters de 4,5 miligramas por anticorpo superficial tb mililitros, seguido pela adição de 1-hidroxibenzotrionazol e benzotriazol-1-yloxy tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate como catalisadores à temperatura ambiente por 24 horas com agitação.

Separe as soluções do anticorpo desvinculado através da cromatografia de filtração de gel usando PBS como tampão. Para determinar o tamanho médio das partículas, morfologia e distribuição de tamanho, lança a dispersão composta em uma rede de cobre de 200 malhas e seque a amostra a temperatura ambiente antes de carregar em um microscópio eletrônico de transmissão para imagem a 100 quilovolts. Para medir os valores de tempo de relaxamento das nanoprobes, use um relaxante de ressonância magnética nuclear a 20 mega-hertz e 37 graus Celsius mais ou menos um grau.

Para imagens de células pulsadas nanoprobe, primeiro cultivar monócitos THP-1 humanos de acordo com protocolos padrão de cultura celular. Quando as células atingirem o estágio apropriado de ativação, pré-insurrecem uma vez 10 a sete monócitos com uma vezes 10 a 6 unidades formadoras de colônias de Mycobacterium bovis BCG por uma hora. No final da incubação, transfira as células para tubos de microcentrífugo de um mililitro e adicione dois milimolalares de nanoprobes de superfície conjugados por anticorpos spio Mycobacterium tuberculosis para cada tubo para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Ao final da incubação, colete as células por centrifugação e resuspenja as pelotas em 200 microliters de meio fresco. Em seguida, escaneie as amostras usando uma sequência rápida de pulso de eco gradiente através de ressonância magnética 3.0-T para determinar a especificidade e sensibilidade dos nanoprobes. Para vacinar animais experimentais com M.bovis BCG, primeiro reconstituir a vacina liofilizada ou o estoque bacteriano no meio de Sauton e diluir a solução de estoque reconstituída com soro fisiológico.

Em seguida, carregue 100 microliters da solução em uma seringa de um mililitro por animal e injete todo o volume de bactérias intradermicamente na pele dorsal esquerda ou direita de cada rato. Para a ressonância magnética in vivo de animais injetados em nanoprobe vivos, adquira imagens de spin-echo rápidos ponderadas t2 de cada animal experimental anestesiado antes de injetar dois nanomolares de sondas de anticorpos SPIO-TB suspensas em 200 microlitres de soro fisiológico na veia traseira de cada rato. Em seguida, imagem os animais novamente imediatamente após a injeção e a cada cinco minutos para os próximos 30 minutos.

Ao final da sessão de imagem, analise quantitativamente todas as imagens de ressonância magnética utilizando a intensidade do sinal como medida das regiões definidas de interesse em locais comparáveis de um centro de granuloma de M.tuberculosis e do músculo traseiro adjacente a uma área de granulomatis. Em seguida, use a fórmula para calcular os aprimoramentos relativos do sinal usando a medição de intensidade do sinal antes e de zero a três horas após a injeção dos agentes de contraste. Um mês após a inoculação, colete o tecido do local de inoculação intradérmica de cada animal e colora as amostras de tecido de 5 a 10 micrômetros com hematoxilina e eosina, manchas de Ziehl-Neelsen para bactérias ácidas e rápidas, e azul de Berlim para ferro férrico.

A imagem de microscopia eletrônica de transmissão de nanoprobes de anticorpos de superfície SPIO-TB revela que os nanoprobes exibem uma aparência bem dispersa com um tamanho médio de 3,8 mais ou menos 0,4 nanômetros por núcleo. M.bovis BCG e cepa bacteriana ácida-rápida podem ser detectadas através da coloração de Ziehl-Neelsen. Após isolamento e cultura com sondas contendo ferro férrico, as bactérias podem ser identificadas através da coloração azul de Berlim.

O grau de segmentação de TB de nanoprobes de anticorpos superficiais SPIO-TB pode ser determinado através de ressonância magnética ponderada t2, conforme indicado por uma diminuição da intensidade do sinal na presença dos nanoprobes que ocorre de forma dependente da concentração. Em animais injetados por nanoprobe, o aprimoramento ponderado por T2 da redução de sinal nas áreas de granulomatis de M.tuberculosis é aproximadamente 14 vezes maior do que o dos locais de controle. Um mês após a infecção, um granuloma subcutâneo organizado pode ser observado em camundongos C57 pretos 6 injetados em nanoprobe com vascularização sanguínea nova e agregados de linfócitos e macrófagos epitelióides observados dentro dessas lesões.

A expressão positiva da tuberculose também é observada nas áreas granulomatosas com coloração de bacilos ácido-rápido positiva no local da lesão. O azul de Berlim, uma mancha positiva de ferro férrico, também pode ser usado para determinar a sensibilidade das sondas à TB. Para a imagem de ressonância magnética in vivo da vida, os animais injetados em nanoprobe adquirem uma imagem de spin-echo rápido ponderada de base T2 de cada animal experimental anestesiado antes de injetar as sondas de anticorpos SPIO-TB. Agora que estabelecemos a técnica SOP para detectar tuberculose extrapulmonar, esses anticorpos podem ser usados especificamente para diagnosticar especificamente a tuberculose extrapulmonar.