Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

Este protocolo pode ser usado para preparar materiais fúngicos e vegetais para ressonância magnética nuclear de estado sólido, ou RN, e polarização nuclear dinâmica, ou DNP, experimentos para caracterização complexa do biossistema. Essa técnica nos permite investigar biomateriais a um nível de resolução atômica em seu ambiente nativo, por exemplo, em células inteiras. A aquisição de informações estruturais de alta resolução sobre materiais fúngicos ajudará no desenvolvimento de medicamentos antifúngicos.

O método fornece uma visão da composição e estrutura de carboidratos complexos em paredes celulares fúngicas e pode ser aplicado a muitos organismos ricos em carboidratos, incluindo plantas, fungos, algas e bactérias. Alguns investigadores podem lutar contra a contaminação fúngica em suas culturas celulares. Meu conselho é esterilizar o meio e o equipamento completamente antes de usar para evitar essa contaminação.

Esta demonstração ajudará os investigadores com pouca experiência em NMR ou cultura celular a aprender a implementar essas técnicas em sistemas fúngicos e vegetais. Para preparar o meio de crescimento líquido sem rótulo, dissolva 6,5 gramas de extrato de levedura peptone dextrose ou pó YPD em 100 mililitros de água destilada e, em seguida, autoclave a solução resultante por 25 minutos a 134 graus Celsius. Para preparar o meio de crescimento sólido sem rótulo, adicione 6,5 gramas de ágar em pó YPD a 100 mililitros de água destilada, e autoclave o meio por 25 minutos a 121 graus Celsius, antes de esfriar o médio a aproximadamente 50 graus Celsius.

Em seguida, transfira de 13 a 15 mililitros do meio de crescimento sólido derretido em placas de Petri de plástico estéril individuais, e coloque imediatamente as tampas nos pratos. Para preparar o carbono-13, meio de crescimento líquido com rótulo nitrogênio 15, ajuste um volume de 100 mililitros de isótopo contendo meio mínimo a um pH de 6,6 com ácido ou base conforme necessário. Em seguida, dissolva os sais listados na tabela em 100 mililitros de água destilada, adicione ao carbono-13, nitrogênio-15-rotulado meio de crescimento líquido, e autoclave a solução resultante por 25 minutos a 121 graus Celsius.

Quando a solução for resfriada à temperatura ambiente, adicione 100 microliters de elementos de traço solução ao volume inteiro de carbono-13, nitrogênio-15-rotulado meio mínimo. Para cultivar os materiais fúngicos, use um laço inoculante para transferir uma pequena quantidade de fungos do armazenamento para uma placa YPD, e cultivar o fungo por dois dias em uma incubadora Celsius de 30 graus. No final da incubação, use um novo laço inoculante para transferir uma borda fúngica de crescimento ativo para o meio de crescimento líquido de carbono-13, com rótulo de nitrogênio 15, e coloque a cultura a 30 graus Celsius e 220 rotações por minuto por três a cinco dias em uma incubadora de agitação.

Quando grandes quantidades do fungo cobrirem o fundo do frasco e flutuarem no líquido, colete os fungos por centrifugação e descarte o supernatante. Hidrate a pelota com uma solução adequada e use fórceps para coletar cerca de 0,5 gramas da pelota bem hidratada para análises de RMR e DNP. Em seguida, misture o material restante com uma solução de 20% de glicerol em um tubo cônico e coloque a amostra fúngica a menos 80 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.

Para preparar o A.fumigatus para análise de NMR de estado sólido, primeiro use um saco de diálise com um corte de peso molecular de 3,5 quilodalton para dialisar o carbono-13 de 0,5 gramas, amostra fúngica de nitrogênio-15 com um litro de tampão fosfato de 10 milimônios a quatro graus Celsius durante três dias para remover pequenas moléculas do meio de crescimento. No final da diálise, transfira a amostra para um tubo de 15 mililitros para centrifugação, e embale de 70 a 80 miligramas da pasta de amostra uniformemente de carbono 13 e bem hidratada em um rotor de dióxido de zircônio de quatro milímetros. Use uma haste de metal para espremer suave e repetidamente a amostra, usando papel para absorver o excesso de água.

Em seguida, tampa firmemente o rotor e insira a amostra no espectrômetro para caracterização de NMR de estado sólido. Para preparar o A.fumigatus para análise de DNP, adicione 100 microliters de matriz DNP em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por carbono-13, amostra fúngica com rótulo carbono 15 e dissolva 0,7 miligramas de agente polarizador em cada tubo para formar uma solução de estoque radical de 10 milimolares. Depois de dois a três minutos para garantir que os radicais sejam totalmente dissolvidos na solução, mergulhe 10 miligramas de carbono dialisado-13, amostra fúngica com nitrogênio-15 em 50 microlitrais da solução de agente polarizador, e use um pilão e uma argamassa para moer levemente a mistura para garantir a penetração dos radicais nas paredes celulares porosas.

Adicione mais 30 microliters da solução radical à pelota moída para hidratar ainda mais a amostra fúngica, e embalar a pelota em um rotor de safira de 3,2 milímetros. Aperte levemente e remova o excesso de solvente DNP como demonstrado, e adicione um plugue de silicone de 3,2 milímetros para evitar a perda de hidratação. Em seguida, adicione o rotor a um espectrômetro NMR para experimento de rotina ou um espectrômetro DNP para medição do espectro aprimorado do DNP sob irradiação de micro-ondas.

Para preparar materiais vegetais para estudos de DNP, use uma lâmina de barbear para cortar o material vegetal uniformemente com etiqueta de carbono 13 em pedaços de um a dois milímetros. Use uma argamassa e pilão para moer os pedaços em partículas menores até que o pó final tenha uma aparência homogênea. Adicione 40 microlitadores de 10 mililitros de solução de estoque radical ao material vegetal, e moer levemente a amostra por mais cinco minutos para garantir a mistura homogênea com o radical.

Hidrate a amostra de terra com outros 20 microliters de solução de estoque radical, e embale a amostra de planta equilibrada em um rotor de safira de 3,2 milímetros para análise de DNP. Em seguida, insira um plugue de silicone para evitar a perda de hidratação e carregue a amostra no espectrômetro DNP. A rotulagem de isótopos aumenta substancialmente a sensibilidade da RMN e torna possível medir uma série de espectros de correlação de carbono bidimensional 13-carbono-13 e carbono-13-nitrogênio-15 para analisar a composição, hidratação, mobilidade e embalagem dos polímeros para sua integração para a construção de um modelo tridimensional de arquitetura de parede celular.

Se sinais off-diagonal são difíceis de obter no espectro 2D carbono-13-carbono-13, a rotulagem estatística pode ter ocorrido. Os dois picos de carbono-13 em 96 e 92 partes por milhão são sinais de glicose de carbono 1. Portanto, suas fortes intensidades no espectro de polarização direta de carbono-13 quantitativo medido com longos atrasos de reciclagem de 35 segundos normalmente indicam o domínio de pequenas moléculas devido à diálise incompleta ou lavagem.

Com amostras bem rotuladas, correlações de longo alcance podem ser medidas para detectar as proximidades espaciais das biomoléculas e construir um modelo estrutural das paredes celulares intactas. Essa técnica permite que a função estrutural em muitos materiais naturais e projetados seja explorada, facilitando estudos futuros de biomateriais ricos em carboidratos e polímeros funcionalizados. Como alguns fungos podem causar infecção ou doenças sistemáticas em humanos, certifique-se de lidar com materiais fúngicos em uma coifa de fluxo laminar para proteção e minimizar a exposição.