Name: Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a preparar amostras de fungos e plantas para análise estrutural por RNM de estado sólido e DNP. Este método permite caracterizar biomateriais em resolução atômica em seus ambientes nativos, auxiliando no desenvolvimento de antifúngicos.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation através da NSF OIA-1833040. O laboratório nacional de campo magnético elevado (NHMFL) é suportado pela National Science Foundation através de DMR-1157490 e o estado da Flórida. O sistema MAS-DNP no NHMFL é financiado em parte pelo NIH S10 OD018519 e NSF CHE-1229170.

1. crescimento de 13C, 15N-rotulado Aspergillus fumigatus meio líquido
<ol><li>Preparação de sem rótulo e 13C, meio de crescimento N-rotulado de 15 Nota: Os dois meio de levedura extrato peptona Dextrose (YPD) e o melhor médio mínimo43 foram utilizados para a manutenção da cultura fúngica. Todas as etapas após a autoclavagem são executadas em uma capa de fluxo laminar para minimizar a contaminação.<ol>
<li>Preparação de meio líquido sem rótulo: dissolver 6,5 g de pó YPD em 100 mL de água destilada e, em seguida, autoclave para 25 min a 134 ° C.</li>
		<li>Preparação de meio sólido sem rótulo<ol>
<li>Adicione 1,5 g de ágar-ágar e 6,5 g de pó YPD em 100 mL de água destilada.</li>
			<li>Autoclave a médio para 25 min a 121 ° C e, em seguida, cool até aproximadamente 50 ° C.</li>
			<li>13-15 mL do meio de transferência em cada plástico pre-estéril de Petri e cubra o prato com uma tampa imediatamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparação de 13C, 15N-rotulado de meio líquido Nota: Para preparar a solução de crescimento para o isótopo etiquetando, um meio mínimo contendo 13C-glicose e 15N-sódio nitrato e uma solução de oligoelementos são preparados separadamente e depois misturados antes do uso.<ol>
<li>Prepare 100 mL do meio mínimo contendo isótopos conforme listado na tabela 1. Ajuste o pH para 6.6 usando NaOH (1 M) ou uma solução de HCl (1M).</li>
			<li>Autoclave o meio mínimo para 25 min a 121 ° C.</li>
			<li>Preparar 100 mL (1, 000 x) da solução de oligoelementos, dissolver os sais listados na tabela 2 na água destilada. Autoclave a solução durante 25 minutos a 134 ° C. Esfriar e armazenar a solução a 4 ° C para uso a curto prazo. O pH será cerca de 6,5 e pode ser verificado utilizando um medidor de pH.</li>
			<li>Adicione 0,1 mL de solução de oligoelementos para 100 mL de 13C, 15N-rotulado meio mínimo conforme listado na tabela 2 , antes do uso.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescimento dos fungos materiais<ol>
<li>Transferi uma pequena quantidade de fungos de armazenamento em um prato YPD usando um loop inoculando numa vizinhança de fluxo laminar. Manter a cultura a 30 ° C durante 2 dias na incubadora.</li>
		<li>Use um loop inoculando para transferir um ativa borda fúngica crescente para a 13C,15N-rotulagem solução em uma capa de fluxo laminar. Manter a cultura a 30 ° C por 3-5 dias a 220 rpm numa incubadora de agitação.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g por 20 min. remover o sobrenadante e coletar o sedimento.</li>
		<li>Use uma pinça para coletar ~0.5 g de pelota bem hidratada (> 50 hidratação de wt %) para estudos de NMR. Perda de hidratação em qualquer ponto agravarão substancialmente a resolução espectral. Nota: Se necessário, uma pequena quantidade (0,1 g) dos micélios hidratados pode ser separada e totalmente secas sob fluxo de gás de2 N em uma capa ou um Liofilizador para estimar o nível de hidratação e calcular a porcentagem de massa seca. Geralmente, um sedimento contendo ~0.3 g massa seca pode ser obtida após 3 dias. Se a experiência NMR para ser realizado é longa (> 7 dias) e/ou se o estado dos fungos precisa ser corrigido, o material fúngico pode ser profundamente congelado no líquido N2 por 10-20 min antes processamento adicional. Se o experimento será curto (3 a 6 dias), o congelamento pode ser ignorado para que a amostra pode permanecer fresca.</li>
		<li>Misturar o material em excesso com 20% (v/v) de glicerol num tubo de centrífuga e mantê-lo em um freezer-80 ᵒC para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação da . fumigatus de DNP estudos e NMR Solid-State
<ol><li>Preparação da . fumigatus para experimentos de NMR Solid-State<ol>
<li>Dialize 13C, 15N-rotulado fungos amostra (etapa 1.2.4.) contra 1 L de 10 mM de tampão fosfato (pH 7.0) a 4 ° C, usando um saco de diálise com 3.5 peso molecular kDa corte para remover pequenas moléculas do meio de crescimento para um período total de 3 dias. Altere a reserva duas vezes por dia. Nota: Como alternativa, a amostra pode ser lavada para 6 - 10 vezes com água desionizada para remover residuais pequenas moléculas.</li>
		<li>Transferi a amostra para um tubo de 15 mL e centrifugar por 5 min (10.000 x g) utilizando uma centrífuga de bancada. Remover o sobrenadante e recolher os materiais restantes de fungos.</li>
		<li>Pacote de 70-80 mg do uniformemente 13C-etiquetado e bem hidratado amostra Cole um ZrO2 rotor de 4 mm ou 30-50 mg de rotores de 3,2 mm para experiências NMR. Repetidamente, espremer a amostra suavemente usando uma haste de metal e absorver o excesso de água usando papel.</li>
		<li>Firmemente a tampa do rotor e inserir a amostra no espectrómetro para caracterização de NMR Solid-State. Nota: Os novíssimo rotores são sugeridos para minimizar a possibilidade de travamento do rotor e vazamento no espectrómetro NMR da amostra. Se necessário, uma inserção de Kel-F descartável com parafusos de vedação pode ser usada para servir como um recipiente secundário dentro do rotor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de amostras da . fumigatus para experimentos DNP<ol>
<li>Prepare-se 100 µ l de DNP solventes29,44 (também conhecida como a matriz DNP) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para 13C,15amostras de fungos N-rotulados. Esta matriz DNP contém uma mistura de d8-glicerol/D2O/H2O (60/30/10% de Vol). Nota: Se amostras sem rótulo devem ser investigados, então prepare-se a matriz DNP usando 13d empobrecido C8-glicerol (12C3, 99,95%; D8, 98%) e D2O e H2O para evitar 13C sinal contribuição de solventes.</li>
		<li>Dissolva 0,7 mg de AMUPol45 em 100 µ l de solventes DNP para formulário 10mm radical solução-mãe. Vórtice para 2-3 minutos garantir que os radicais são totalmente dissolvidos na solução.</li>
		<li>Mergulhe 10mg dos dializados 13C, 15N-rotulado materiais fúngicos como descrito nos passos anteriores (etapas 2.1.1 e 2.1.2) em 50 µ l de solução de AMUPol e triture levemente a mistura usando um pilão e almofariz para garantir a penetração dos radicais em as paredes celulares porosas. Nota: Para reduzir a taxa de perda de hidratação, a moagem pode também ocorrer em um tubo de microcentrifugadora usando um micropestle.</li>
		<li>Adicione outro µ l 30 da solução radical ao pellet moído para hidratar mais a amostra fúngica.</li>
		<li>Embalar o pellet em um rotor de safira de 3,2 mm, aperte levemente e retire o solvente DNP em excesso. Adicione um plug de 3,2 mm do silicone para impedir a perda de hidratação. Normalmente, 5-30 mg da amostra pode ser embalado para o rotor. A quantia exata que precisa de ser determinado pela exigência das experiências NMR sensibilidade para ser conduzido.</li>
		<li>Inserir e girar a amostra em um espectrômetro DNP, medir um espectro DNP aprimorado sob irradiação de microondas e compará-lo com o espectro de microondas. Isto levará a um reforço fator εligar/desligar, que deve ser de 20-40 para estes materiais complexos. Execute os experimentos projetados para determinar a estrutura da parede celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação da planta de biomassa para NMR e estudos DNP
<ol><li>Preparação de materiais vegetais para NMR Solid-State<ol>
<li>Produzir uniformemente 13C-rotulado plantas in-house usando 13CO2 suprimentos em uma câmara ou 13C-glicose meio crescimento conforme descrito anteriormente,,4647 ou aquisição directa de materiais rotulados de empresas de criação de etiquetas de isótopo. Nota: 13C-glicose pode somente ser usado em crescimento escuro para evitar a introdução de 12C pela fotossíntese.</li>
		<li>Cortar o uniformemente 13C rotulado material vegetal em pedaços pequenos (tipicamente 1-2 mm de dimensão) usando uma lâmina de laboratório. Nota: Dependendo da finalidade, as paredes celulares extraídas são por vezes utilizadas para caracterização estrutural e os protocolos detalhados são relatados em anteriores estudos21,46.</li>
		<li>Se a amostra foi previamente secos, adicionar 100 µ l de água a 30 mg de materiais vegetais em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga, vórtice, equilibrar à temperatura ambiente por 1 dia. Centrifugar a 4.000 x g durante 10 minutos e remover o excesso de água com uma pipeta.</li>
		<li>Se a amostra era nunca seca em qualquer ponto, use diretamente a amostra sem tratamento adicional.</li>
		<li>Embale os materiais de planta resultante em 3,2 mm ou 4 mm ZrO2 rotores para experimentos de NMR Solid-State.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de materiais vegetais para estudos DNP<ol>
<li>Prepare 60 µ l solução stock de 10mm AMUPol radical como descritos passos 2.2.1 e 2.2.2.</li>
		<li>Cortar o uniformemente 13C rotulado material vegetal a ser estudado em pedaços pequenos (1-2 mm de dimensão) usando uma lâmina de laboratório e pesar 20 mg dos materiais vegetais.</li>
		<li>Mão-moer os pedaços de planta em pequenas partículas (~ 1-2 mm de tamanho) usando um almofariz e um pilão. Os pós finais têm uma aparência homogênea.</li>
		<li>Adicionar 40 µ l da solução-mãe DNP preparado na etapa anterior (etapa 2.2.2) para o material de planta e triture levemente por 5 min garantir homogênea mistura-se com o radical.</li>
		<li>Adicione outro 20 µ l da solução estoque para hidratar mais o material vegetal após a moagem.</li>
		<li>Embale a amostra de planta equilibrada em um rotor de safira de 3,2 mm para experimentos DNP. Introduza um tampão de silicone para evitar a perda de hidratação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. padrão NMR Solid-State experimentos para caracterização inicial dos biomateriais ricos em carboidratos
Nota: Uma breve visão geral das experiências NMR é fornecida nesta seção. No entanto, a elucidação estrutural normalmente requer vastos conhecimentos. Portanto, recomenda-se esforços de colaboração com Rydberg NMR.
<ol><li>Medida 1D 13C Cruz polarização (CP), 13C polarização direta (DP) com 2-s e 35-s reciclar atrasos e 1H -13C INEPTO48,49 espectros para obter uma compreensão geral do que os dinâmicos distribuição de componentes celulares (Figura 1a). As paredes celulares são tipicamente parte relativamente rígida e exibem sinais dominantes no espectro de CP.</li>
	<li>Medir uma série de experimentos de correlação 2D padrão 13C -13. C para atribuições de ressonância dos sinais de 13C. Comece com Recentrado inadequada50,51 para obter conectividade de carbono, que precisa ser assistido por uma série de experiências através do espaço como 1.5-ms RFDR52 (Figura 1b) e cabo de 50-ms/Marcos de Oliveira53 experiências. Nota: Se é de interesse para encontrar uma amostra rico em um componente específico, por exemplo, a primária ou paredes celulares secundárias, então vários segmentos ou várias plantas podem precisar de ser medidos separadamente para encontrar a amostra com a composição ideal.</li>
	<li>Conduza experimentos de correlação de13C 2D 15N - que podem ser medidos para facilitar as atribuições de ressonância de proteínas e carboidratos nitrogenados. Nota: A atribuição de ressonância é normalmente demorada. Atualmente está sendo desenvolvido um método para facilitar a atribuição de ressonância dos sinais de carboidrato para aqueles cientistas sem experiência prévia.</li>
	<li>Medir mais especializados experimentos para determinar as proximidades espaciais (Figura 1 c, d), hidratação e mobilidades de biomoléculas complexas para determinar a estrutura tridimensional dos materiais ricos em carboidratos como sistematicamente descrito anteriormente22,29.</li>
</ol>

Nós não temos nada para divulgar.

Comparado com os métodos bioquímicos, NMR Solid-State tem vantagens como uma técnica não-destrutiva e em alta resolução. NMR também é quantitativa na análise composicional, e ao contrário da maioria dos outros métodos analíticos, não terá as incertezas introduzido pela solubilidade limitada de biopolímeros. Estabelecimento do protocolo atual facilita estudos futuros sobre biomateriais ricos em carboidratos e polímeros funcionalizados. No entanto, deve notar-se que a análise de dados e atribuição de ressonância pode ser d...

Hidratos de carbono desempenham um papel central em vários processos biológicos, tais como armazenamento de energia, construção estrutural e reconhecimento celular e adesão. Eles são enriquecidos na parede celular, que é um componente fundamental em plantas, fungos, algas e bactérias1,2,3. Parede celular serve como uma fonte central para a produção de biocombustível e biomateriais, bem como um alvo promissor para terapias antimicrobiana4,5,6,7,8 , 9.
A compreensão contemporânea destes materiais complexos tem sido substancialmente avançada por décadas de esforços que foram dedicados à caracterização estrutural usando quatro principais métodos bioquímicos ou genéticos. O primeiro método principal se baseia em tratamentos sequenciais usando produtos químicos ou enzimas para quebrar as paredes celulares em porções diferentes, que é seguido por composição e análise de enlace de açúcares em cada fração de10. Este método lança luz sobre a distribuição de domínio de polímeros, mas a interpretação pode ser enganosa devido às propriedades físicas e químicas das biomoléculas. Por exemplo, é difícil determinar se a fração alcaloide extraíveis origina-se de um único domínio de moléculas menos estruturadas ou de moléculas espacialmente separadas com solubilidade comparável. Em segundo lugar, a porções extraídas ou paredes de célula inteira pode também ser medidas usando solução NMR para determinar as ligações covalentes, também denominadas como reticulação, entre diferentes moléculas11,12,13, 14,15. Desta forma, a estrutura detalhada das ligações covalentes âncoras poderia ser sondada, mas limitações podem existir devido a baixa solubilidade de polissacarídeos, o número relativamente pequeno de sites de reticulação e a ignorância dos efeitos não-covalente que estabiliza embalagem de polissacarídeo, incluindo a ligação do hidrogênio, força de van der Waals, interação eletrostática e entrelaçamento de polímero. Em terceiro lugar, a afinidade obrigatória tem sido determinada em vitro usando polissacarídeos isolados16,17,18,19, mas a purificação procedimentos podem alterar substancialmente a estrutura e propriedades destas biomoléculas. Esse método também não consegue replicar a deposição sofisticada e montagem de macromoléculas após a biossíntese. Finalmente, o fenótipo, morfologia celular e propriedades mecânicas dos mutantes genéticos com produção atenuada de determinado componente da parede celular lançar luzes sobre as funções estruturais dos polissacarídeos, mas evidências moleculares mais é necessário para colmatar estas observações macroscópicas com a função engenharia de proteína machineries20.
Recentes avanços no desenvolvimento e aplicação de espectroscopia NMR Solid-State multidimensional introduziram uma oportunidade única para resolver estes enigmas estruturais. 2D/3D Solid-State NMR experimentos permitem investigação high-resolution da composição e arquitetura de materiais ricos em carboidratos no estado nativo, sem grandes perturbações. Estudos estruturais têm sido realizados com sucesso no primário e paredes celulares secundárias de plantas, a biomassa tratada cataliticamente, biofilme bacteriano, o pigmento fantasmas em fungos e, recentemente pelos autores, as paredes celulares intactos em um fungo patogênico Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. o desenvolvimento da polarização nuclear dinâmica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 substancialmente facilita a elucidação estrutural de NMR como o aprimoramento da sensibilidade pela DNP marcadamente encurta o tempo experimental em biomateriais estes complexos. O protocolo descrito aqui detalha os procedimentos para o fungo a. fumigatus isótopo-rotulagem e preparando fúngicas e amostras da planta para a caracterização do estado sólida NMR e DNP. Procedimentos de rotulagem semelhantes devem ser aplicáveis a outros fungos com meio alterado, e os procedimentos de preparação de amostra devem ser geralmente aplicáveis a outros biomateriais ricos em carboidratos.

<table><tbody><tr><td>Molibdato de amônio tetrahidratado</td><td>Acros Organics</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>Balança de pesagem analítica</td><td>Ohaus</td><td>B730439218</td><td>Modelo PA84C</td></tr><tr><td>Bioclave 16 L</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança</td><td>Labconco corporation</td><td>302319100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>A VWR</td><td>BDH9222</td><td>loja em 15-30 & C</td></tr><tr><td>Cloreto de Cobalto (II) Hexahidratado</td><td>Honeywell|Fluka</td><td>60820</td><td>&ge; 98</td></tr>% <tr><td>Sulfato de Cobre (II) Pentahidratado</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Corning LSE incubadora de agitação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>99,9 átomos % D</td></tr><tr><td>d6-DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>99,9 átomos % D</td></tr><tr><td>d8-glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge; 99 átomos % D</td></tr><tr><td>Tubulação de diálise 3,2 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>Fosfato Dipotássico</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>&ge; 99,5 %</td></tr><tr><td>Centrífuga Heraus Megafuge 16R</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>750004271</td><td>Máximo RCF 25,830 x g</td></tr><tr><td>Kit de Inserção Descartável HR-MAS</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>Sulfato de Ferro(II) Heptahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge; 99+ %</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>armazenar a 18-26 > C</td></tr><tr><td>Manganês(II) Cloreto Tetrahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>11563</td><td>&ge; 99 %</td></tr><tr><td>Fosfato Monopotássico</td><td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge; Medidor de pH 99</td></tr>% <tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>B706689216</td><td></td></tr><tr><td>Etilenodiaminotetraacetato Tetrassódico</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge; 99,5 %</td></tr><tr><td>Sulfato de Zinco Heptahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>&ge; 98%</td></tr> <tr><td>12C3, d8-glicerol</td><td>Cambridge Isotope Laboratory</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, 99,95%; D8, 98%</td></tr><tr><td>13C6-glicose</td><td>Sigma Alrdrich</td><td>364606</td><td>&ge; 99 % (CP)</td></tr><tr><td>15N-nitrato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>364606</td><td>&ge; 98 % 15N, &ge; 99 (cp)</td></tr> <tr><td>3,2 mm de safira NMR rotor</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>3,2 mm plugue de silicone</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>4 mm MAS Kit de rotor</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>Zircônia</td></tr></tbody></table>

preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização nuclear dinâmica nmr solid-state

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Este protocolo mostra como uniformemente 13C, 15N-rotulado materiais fúngicos podem ser produzidos e como estes materiais macios devem ser procedeu para NMR Solid-State e DNP sensibilidade melhorada dos experimentos. O procedimento de processamento da amostra de biomassa de planta também é detalhado. Este método permite a medição de uma série de 1D e 2D 13C -13C / espectros de correlações15N, que permite a elucidação estrutural de alta resolução de biomateriais complexos em seu estado nativo, com mínima perturbação. O isótopo-rotulagem pode ser examinado através da quantificação da intensidade em espectros de 1D e a eficiência de transferência de polarização em espectros de correlação 2D. O sucesso da preparação da amostra de polarização nuclear dinâmica (DNP) pode ser avaliado pelo fator de aumento de sensibilidade. Novas experiências, examinando os aspectos estruturais dos polissacarídeos e proteínas conduzirá a um modelo da arquitetura tridimensional. Esses métodos podem ser modificados e adaptados para investigar uma ampla gama de materiais ricos em carboidratos, incluindo as paredes celulares naturais de plantas, fungos, algas e bactérias, bem como sintetizado ou projetado, polímeros de carboidratos e seus complexos com outros moléculas.

A rotulagem de isótopo substancialmente aumenta a sensibilidade de NMR e torna possível para medir uma série de 13C -15N correlação espectros para analisar a composição, hidratação, mobilidade e 2D 13C -13C e embalagem de polímeros, que serão integrados para construir um modelo tridimensional de arquitetura da parede celular (Figura 1). Se a rotulagem uniforme for bem-sucedido, um conjunto completo de espectros de <...

Um protocolo para a preparação de 13C,15amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Este protocolo pode ser usado para preparar materiais fúngicos e vegetais para ressonância magnética nuclear de estado sólido, ou RN, e polarização nuclear dinâmica, ou DNP, experimentos para caracterização complexa do biossistema. Essa técnica nos permite investigar biomateriais a um nível de resolução atômica em seu ambiente nativo, por exemplo, em células inteiras. A aquisição de informações estruturais de alta resolução sobre materiais fúngicos ajudará no desenvolvimento de medicamentos antifúngicos.O método fornece uma visão da composição e estrutura de carboidratos complexos em paredes celulares fúngicas e pode ser aplicado a muitos organismos ricos em carboidratos, incluindo plantas, fungos, algas e bactérias. Alguns investigadores podem lutar contra a contaminação fúngica em suas culturas celulares. Meu conselho é esterilizar o meio e o equipamento completamente antes de usar para evitar essa contaminação.Esta demonstração ajudará os investigadores com pouca experiência em NMR ou cultura celular a aprender a implementar essas técnicas em sistemas fúngicos e vegetais. Para preparar o meio de crescimento líquido sem rótulo, dissolva 6,5 gramas de extrato de levedura peptone dextrose ou pó YPD em 100 mililitros de água destilada e, em seguida, autoclave a solução resultante por 25 minutos a 134 graus Celsius. Para preparar o meio de crescimento sólido sem rótulo, adicione 6,5 gramas de ágar em pó YPD a 100 mililitros de água destilada, e autoclave o meio por 25 minutos a 121 graus Celsius, antes de esfriar o médio a aproximadamente 50 graus Celsius.Em seguida, transfira de 13 a 15 mililitros do meio de crescimento sólido derretido em placas de Petri de plástico estéril individuais, e coloque imediatamente as tampas nos pratos. Para preparar o carbono-13, meio de crescimento líquido com rótulo nitrogênio 15, ajuste um volume de 100 mililitros de isótopo contendo meio mínimo a um pH de 6,6 com ácido ou base conforme necessário. Em seguida, dissolva os sais listados na tabela em 100 mililitros de água destilada, adicione ao carbono-13, nitrogênio-15-rotulado meio de crescimento líquido, e autoclave a solução resultante por 25 minutos a 121 graus Celsius.Quando a solução for resfriada à temperatura ambiente, adicione 100 microliters de elementos de traço solução ao volume inteiro de carbono-13, nitrogênio-15-rotulado meio mínimo. Para cultivar os materiais fúngicos, use um laço inoculante para transferir uma pequena quantidade de fungos do armazenamento para uma placa YPD, e cultivar o fungo por dois dias em uma incubadora Celsius de 30 graus. No final da incubação, use um novo laço inoculante para transferir uma borda fúngica de crescimento ativo para o meio de crescimento líquido de carbono-13, com rótulo de nitrogênio 15, e coloque a cultura a 30 graus Celsius e 220 rotações por minuto por três a cinco dias em uma incubadora de agitação.Quando grandes quantidades do fungo cobrirem o fundo do frasco e flutuarem no líquido, colete os fungos por centrifugação e descarte o supernatante. Hidrate a pelota com uma solução adequada e use fórceps para coletar cerca de 0,5 gramas da pelota bem hidratada para análises de RMR e DNP. Em seguida, misture o material restante com uma solução de 20% de glicerol em um tubo cônico e coloque a amostra fúngica a menos 80 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.Para preparar o A.fumigatus para análise de NMR de estado sólido, primeiro use um saco de diálise com um corte de peso molecular de 3,5 quilodalton para dialisar o carbono-13 de 0,5 gramas, amostra fúngica de nitrogênio-15 com um litro de tampão fosfato de 10 milimônios a quatro graus Celsius durante três dias para remover pequenas moléculas do meio de crescimento. No final da diálise, transfira a amostra para um tubo de 15 mililitros para centrifugação, e embale de 70 a 80 miligramas da pasta de amostra uniformemente de carbono 13 e bem hidratada em um rotor de dióxido de zircônio de quatro milímetros. Use uma haste de metal para espremer suave e repetidamente a amostra, usando papel para absorver o excesso de água.Em seguida, tampa firmemente o rotor e insira a amostra no espectrômetro para caracterização de NMR de estado sólido. Para preparar o A.fumigatus para análise de DNP, adicione 100 microliters de matriz DNP em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por carbono-13, amostra fúngica com rótulo carbono 15 e dissolva 0,7 miligramas de agente polarizador em cada tubo para formar uma solução de estoque radical de 10 milimolares. Depois de dois a três minutos para garantir que os radicais sejam totalmente dissolvidos na solução, mergulhe 10 miligramas de carbono dialisado-13, amostra fúngica com nitrogênio-15 em 50 microlitrais da solução de agente polarizador, e use um pilão e uma argamassa para moer levemente a mistura para garantir a penetração dos radicais nas paredes celulares porosas.Adicione mais 30 microliters da solução radical à pelota moída para hidratar ainda mais a amostra fúngica, e embalar a pelota em um rotor de safira de 3,2 milímetros. Aperte levemente e remova o excesso de solvente DNP como demonstrado, e adicione um plugue de silicone de 3,2 milímetros para evitar a perda de hidratação. Em seguida, adicione o rotor a um espectrômetro NMR para experimento de rotina ou um espectrômetro DNP para medição do espectro aprimorado do DNP sob irradiação de micro-ondas.Para preparar materiais vegetais para estudos de DNP, use uma lâmina de barbear para cortar o material vegetal uniformemente com etiqueta de carbono 13 em pedaços de um a dois milímetros. Use uma argamassa e pilão para moer os pedaços em partículas menores até que o pó final tenha uma aparência homogênea. Adicione 40 microlitadores de 10 mililitros de solução de estoque radical ao material vegetal, e moer levemente a amostra por mais cinco minutos para garantir a mistura homogênea com o radical.Hidrate a amostra de terra com outros 20 microliters de solução de estoque radical, e embale a amostra de planta equilibrada em um rotor de safira de 3,2 milímetros para análise de DNP. Em seguida, insira um plugue de silicone para evitar a perda de hidratação e carregue a amostra no espectrômetro DNP. A rotulagem de isótopos aumenta substancialmente a sensibilidade da RMN e torna possível medir uma série de espectros de correlação de carbono bidimensional 13-carbono-13 e carbono-13-nitrogênio-15 para analisar a composição, hidratação, mobilidade e embalagem dos polímeros para sua integração para a construção de um modelo tridimensional de arquitetura de parede celular.Se sinais off-diagonal são difíceis de obter no espectro 2D carbono-13-carbono-13, a rotulagem estatística pode ter ocorrido. Os dois picos de carbono-13 em 96 e 92 partes por milhão são sinais de glicose de carbono 1. Portanto, suas fortes intensidades no espectro de polarização direta de carbono-13 quantitativo medido com longos atrasos de reciclagem de 35 segundos normalmente indicam o domínio de pequenas moléculas devido à diálise incompleta ou lavagem.Com amostras bem rotuladas, correlações de longo alcance podem ser medidas para detectar as proximidades espaciais das biomoléculas e construir um modelo estrutural das paredes celulares intactas. Essa técnica permite que a função estrutural em muitos materiais naturais e projetados seja explorada, facilitando estudos futuros de biomateriais ricos em carboidratos e polímeros funcionalizados. Como alguns fungos podem causar infecção ou doenças sistemáticas em humanos, certifique-se de lidar com materiais fúngicos em uma coifa de fluxo laminar para proteção e minimizar a exposição.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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