Name: Capacidade de diferenciação de células progenitoras de aorta humana Perivascular adiposo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar células progenitoras multipotentes de tecido adiposo perivascular humano para diferenciação em linhagens adipogênica, osteogênica e condrogênica. Este método avança a compreensão da biologia vascular e medicina regenerativa cardiovascular.

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Reconhecemos a assistência de navegação de pesquisa no Maine Medical Center para assistir com a aquisição de tecido clínico, histopatologia e Histomorfometria Core (apoiada pela 1P20GM121301, L. Liaw PI) em Maine Medical Center Research Instituto de corte e coloração. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01 HL141149 (L. Liaw).

O uso de tecidos humanos neste estudo foi avaliado e aprovado pelo institucional Review Board de Maine centro médico, e todos os funcionários receberam treinamento adequado antes da experimentação.
1. preparações
<ol><li>Fazer reserva de dissociação por reconstituir 50mg colagenase/dispase animal-free misturar eu solução com 1 mL de solução de trabalho de 1 mg/mL preparar nanopure H2O. adicionando 49 mL de glicose alta DMEM contendo 1% w/v BSA para o reconstituído colagenase / solução de Dispase. Loja alíquotas de trabalho 5ml a-20 ° C e quente a 37 ° C, usando um antes do banho de água para usar.</li>
	<li>Faça a solução antibiótica, adicionando 1 mL de solução de antibiótico/antimicótico 100 x (concentração final é 200 penicilina unidades/mL, de 200 unidades/mL Estreptomicina e de 0,5 µ g/mL fungizone) a 49 mL de HBSS e armazene no gelo.</li>
	<li>Preparar a solução de gelatina (0,2% p/v), dissolvendo a gelatina de 200 mg de pele bovina em 100 mL de nanopure H2Autoclave O. a solução para 20 min e armazenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar 500 mL de meio de crescimento PVAT: glicose alta DMEM/F12 com suplemento de glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio, suplementado com 10% FBS e agente antimicrobiano de 100 µ g/mL (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Preparar a mídia de indução de adipogenic 50ml: glicose alta de 40,8 mL DMEM, suplementado com mídia de crescimento 7,5 mL PVAT, 500 µ l de 100 x antibiótico/antimicótico solução (concentração final é 100 penicilina unidades/mL, 100 unidades/mL Estreptomicina e fungizone 0,25 µ g/mL), 0.5 mM IBMX (estoque de 500 mM em 0.1 M NaOH), 1 dexametasona µM (estoque de 1 mM em etanol), 5 µM rosiglitazone (estoque de 5 mM em DMSO), 33 biotina µM (estoque de 66 mM em DMSO), 100 nM insulina (200 ações µM em 0,1% de ácido acético) e o ácido pantotênico 20 µM (estoque de 100 mM H2 Ó).</li>
	<li>Preparar 50 mL de mídia de indução de controlo para a linhagem de adipogenic: glicose alta de 40,8 mL DMEM suplementado com mídia de crescimento PVAT 7,5 mL e 500 µ l de caneta-estreptococos (estoque de x 100).</li>
	<li>Preparar a mídia de manutenção adipogenic 50ml: glicose alta de 41,5 mL DMEM suplementado com 7,5 mL PVAT crescimento mídia da etapa 1.3, 500 µ l pen-estreptococos (estoque de x 100), dexametasona 1 µM (estoque de 1 mM em EtOH), 33 biotina µM (estoque de 66 mM em DMSO), 100 insulina nM (200 µM ações 0,1% ac ácido ETIC) e ácido pantotênico de 20 µM (estoque de 100 mM em H2O).</li>
	<li>Preparar 500 mL de mídia de crescimento para as linhagens osteogênicas e chondrogenic: suplemento de FBS, 1 glutamina x glicose alta αMEM suplementado com 10% (ver Tabela de materiais) e 5 mL de caneta-estreptococos (estoque de x 100).</li>
	<li>Preparar 50 mL de mídia de indução para a linhagem osteogênica: 50 mL de medula óssea mídia crescimento MSC suplementada com 10 nM dexametasona e β-glicerofosfato de 10 mM.</li>
	<li>Preparar 50 mL de mídia de indução para a linhagem de chondrogenic: 50 mL de medula óssea mídia crescimento MSC suplementada com 100 dexametasona nM e 50 µ g/mL fosfato de sódio ascorbato-2-10 ng/mL TGFβ1. Para as condições osteogênicas e chondrogenic, a mídia de crescimento basal da medula óssea MSC irá servir como a mídia não-indução.</li>
</ol>2. Protocolo 1: Cultura humana PVAT células da fracção do estroma Vascular
Nota: PVAT é ressecado do local da anastomose do enxerto na aorta ascendente de pacientes anestesiados submetidos a procedimentos de enxerto de bypass de artéria coronária. PVAT aórtica é colocado em um 15ml cónico contendo 10 mL gelo frio alta glicose DMEM F12 e transferido da sala de cirurgia para laboratório até 2 horas após ressecção. PVAT aórtica é tecido Descartado durante procedimento de bypass e tem sido considerado como pesquisa de sujeitos não-humanos pelo Conselho de revisão interna do Maine Medical Center.
<ol><li>Este protocolo é para um pedaço de ~ 500 mg de PVAT humana (aproximadamente 3 x 1 x 0,5 cm3). Transferi PVAT humano fresco de DMEM para um tubo cônico de 50 mL contendo 25 mL de solução antibiótica. Incube com balanço por 20 min a 4 ° C. Enquanto o PVAT em solução antibiótica, descongelar uma alíquota do buffer de dissociação a 37 ° C.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de solução de antibiótico/antimicótico 100 x 5 mL de tampão de dissociação e esterilizar usando um filtro de seringa 0,22 µm. Adicione 1 mL de solução de gelatina para 1 bem de uma placa de 24. Um capuz de fluxo laminar, utilize Pinças esterilizadas e tesoura para transmitir PVAT da solução antibiótica para uma placa de Petri estéril. Adicionar 1 mL de tampão de dissociação previamente aquecido no tecido e picar finamente o tecido inteiro em uma pasta (sem pedaços maiores que ~ 2 x 2 mm2) usando Pinças esterilizadas e tesoura de dissecação.</li>
	<li>Transferir o chorume de 1 mL a 4 mL de tampão de dissociação e incubar o tubo em seu lado em um agitador orbital de pre-aquecido a 37 ° C a 200 rpm por 1h. Depois de 1h, sem pedaços de tecido visível estará presentes, e a solução aparecerá como uma suspensão de células nublado.</li>
	<li>Filtre a solução através de um filtro de célula 70 µm situado no topo de um tubo cónico de 50 mL. Lave o filtro com uma solução antibiótica 10ml adicionais para capturar o maior número de células possível. Não esprema o filtro.</li>
	<li>Granule as células para 12 min a 300 x g em uma centrífuga de balde oscilante. Nota: Após a centrifugação, o tubo será separado em uma camada gordurosa de adipócitos, uma interfase e uma pelota. A pelota é a fração vascular do estroma contendo células endoteliais, células do sistema imunológico, as células do sangue e células progenitoras.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 10 mL de HBSS e centrifugar durante 5 min à 300 x g. Repita esta etapa para um total de 2 lavagens em HBSS. Após a lavagem final, não lise os glóbulos vermelhos. Repetidas tentativas com vários buffers comercialmente disponíveis e tempos de incubação têm levado a reduções marcadas na fixação de células progenitoras e viabilidade.</li>
	<li>Aspire a gelatina da placa de 24 poços. Lave delicadamente o bem 1x com HBSS remover gelatina desacoplada.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de fração vascular do estroma com hemácias intactas em 1 mL de sementes para a gelatina-revestido e mídia de crescimento bem. Adicione FGF2 humana (resuspended em PBS suplementado com BSA de 0,01% w/v) a uma concentração final de 25 ng/mL em meio de cultura. Incube durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>No dia seguinte, remover mídia de crescimento e lavagem poços 5x com HBSS para remover células vermelhas do sangue e as células mortas. Adicione 1 mL de meio de crescimento fresco suplementado com 25 ng/mL FGF2.</li>
	<li>Mudar a cada 48h, certificando-se de suplemento com 25 ng/mL de mídia FGF2 fresco cada vez.</li>
	<li>
As células tipicamente alcançar confluência 100% 7-10 dias após explant; Então células de passagem:
	<ol>
<li>Aspirar 2, monocamadas de mídia e lavagem de crescimento x em 1 mL HBSS. Aspire HBSS todos dos poços e adicione algumas gotas de solução de dissociação de célula.</li>
		<li>Torneira e agite a chapa várias vezes e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 por 5 – 7 min levantar as células. Adicionar ~ 1 mL de meio de cultura fresco para as células desanexadas e distribuir 500 µ l a 2 poços de uma placa de 24, cada contendo mídia de crescimento 500 µ l e 25 ng FGF2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continue a expandir células humanas PVAT-derivado, conforme indicado no passo anterior. Cada passagem deve ser maior do que uma divisão de 1:2. As células são passadas de 5 a 7 vezes antes de alocar para ensaios de diferenciação.</li>
</ol>3. protocolo 2: Cultura medula óssea humana MSC colônias
Nota: Medula óssea humana MSC são isoladas como descrito8 e armazenado como cedo passagem congelada estoques em congelar mídia (70% FBS 20% basal DMEM e 10% DMSO) ~ 100.000 células/ml no líquido N2.
<ol><li>Rapidamente, descongelar um frasco de MSC medula óssea a partir do líquido N2 em um banho-maria a 37 ° C e a placa para um poço de uma placa de cultura de 6-poços contendo 3 mL de meio de crescimento de MSC e incubar durante uma noite a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>No dia seguinte, meios de cultura MSC de aspirar e lavar as células 3 x em 2 mL de HBSS. Na confluência de 100%, meios de crescimento de aspirar e lavar as células 3 x em 2 mL de HBSS. Adicionar solução de desprendimento 500 µ l/poço de célula e incubar a 37 ° C e 5% CO2 por 5 min. torneira a placa para garantir que todas as células são desalojados e distribuir conteúdo 2 poços de uma placa de 6 contendo 2 mL MSC crescimento meios de comunicação.</li>
	<li>Expanda a medula óssea humana e MSC PVAT-derivado em paralelo para aproximadamente 5-7 passagens ou até quantidades suficientes para o teste tenha sido alcançado.</li>
</ol>4. protocolo 3: Placa e induzir Adipogenic, osteogênica e linhagens de Chondrogenic
<ol><li>Placa de número da medula óssea e células PVAT-derivado por bem de uma placa de 12 e apropriado Replica para cada condição experimental. Para adipogenic e condições osteogênicas, ~ 200, 000 – 225.000 células/poço é necessários, para chondrogenic condições, 150.000 – 175.000 células/poço são necessários. Nota: Nós corremos um mínimo de N = 3 poços replicar para controle e induzido condições para cada linhagem experimental para um total de 2 independente funciona (N = total de 6 repetições).</li>
	<li>Desassocie as células de tanto a população de células progenitoras PVAT humana e a população de MSC medula óssea humana usando solução de desprendimento de célula e incubação a 37 ° C e 5% de CO2 para populações de piscina 5 min. em frascos cônicos 15ml separado. Gire o frasco para baixo a 500 x g durante 7 min para as células de Pelotas. Resuspenda em 1 mL de PBS e usar um hemocytometer para estimar o número de células.</li>
	<li>As células em pratos 12-poços da placa como indicado no ponto 4.1. Fornece pratos separados para adipogenic induzido e não induzida, osteogênica e as condições para que a condição não induzida pode ser fixo em um ponto do tempo anterior sem interromper continuando a cultura da condição induzida.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de adipogenic e indução osteogênica media a cada poço da condição induzida. Adicione 1,5 mL de adipogenic e osteogênica não-indução mídia a cada poço da condição não induzida. Começa a incubação do adipogenic e populações de células osteogênicas de induzidos e não induzida em 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Spin para baixo o volume restante de células humanas de progenitor PVAT e medula óssea humana MSCs para 7 min a 500 x g.</li>
	<li>Determine o volume necessário para Ressuspender o restante da medula óssea e células PVAT-derivado pelotas para atingir uma densidade de 100.000 células/10 µ l (106 células/mL). Resuspenda pelotas do volume calculado de mídia de crescimento MSC para indução de linhagem de chondrogenic. Movimente suavemente o volume das células acima e para baixo usando uma pipeta para garantir uma distribuição homogénea.</li>
	<li>Pipete uma gotícula de 10 µ l da solução concentrada de células para o centro de cada poço para formar um micromass de 100.000 células. Coloque 1 mL de estéril H2O no poço adjacente para evitar a evaporação. Incubar as culturas micromass por 2 h a 37 ° C e 5% CO2 para permitir que o micromass para agregar.</li>
	<li>Depois de 2 horas, cuidadosamente adicionar mídia de diferenciação chondrogenic cravada com 10 ng/mL TGFβ1 humana a cada um dos poços induzida-condição. Cuidadosamente adicione 1,5 mL da mídia não-indução (meio de crescimento da medula óssea MSC) nos poços de condição não induzida. Use chapas separadas 12-poços para as induzido e não induzida condições para que a condição não induzida pode ser fixo em um ponto do tempo anterior.</li>
</ol>5. protocolo 4: Cultura Adipogenic, osteogênica e linhagens de Chondrogenic por 14 dias
<ol><li>Cultura as condições de todas as três linhagens induzidas e não induzida por 4 dias a 37 ° C e 5% CO2, refrescante mídia cada 2 dias. No dia 4, altere a condição de linhagem adipogenic induzido de mídia de indução aos meios de manutenção para o restante do ensaio.</li>
	<li>Corrigir todas as condições não induzida em formol a 10% por 12 h. Dispose de formalina e lavar tudo fixada poços 2x em PBS para remover todos os vestígios de formol. Armazenar as placas em PBS a 4 ° C até o processamento.</li>
	<li>Cultura as condições induzidas por um total de 14 dias, refrescante mídia cada 2 dias. Adicione TGFβ1 fresco em 10 ng/mL concentração final com cada atualização de mídia da indução chondrogenic. Continue a cultura da linhagem de adipogenic na adipogenic manutenção mídia e mídia de indução de linhagem osteogênica, atualizando a cada 2 dias. No dia 14, fixar condições tudo induzidas por 12 h em formol a 10% para a coloração.</li>
	<li>Raspar ou despeje o micromass na condição induzida chondrogenic dentro de um estojo para a incorporação. Desidrate o micromass em uma série de banhos de álcool cada vez mais concentrado por 5 min, começando em 70%, em seguida, 80%, duas vezes em 95% e duas vezes mais em álcool absoluto. Coloque a fita em um agente de dealcoholization e então finalmente incorporar a gaveta em cera de parafina para corte e coloração.</li>
</ol>6. protocolo 5: Coloração Adipogenic condição com óleo O vermelho
<ol><li>Prepare solução estoque de óleo vermelho O dissolvendo 350 mg de óleo vermelho em 100 mL de isopropanol 100%. Misture por 2 h com uma barra de agitação e vácuo através de um filtro de 0,2 µm. Solução de reserva pode ser armazenada no escuro à temperatura ambiente por 1 ano.</li>
	<li>Prepare o óleo vermelho O solução de trabalho misturando 3 partes de solução de 2 partes diH20 (por exemplo, 60 mL da solução de 40 mL diH20). A concentração final de óleo vermelho O da solução de trabalho é de 2,1 mg/mL.</li>
	<li>Remova todo fluido de poços. Lave cada bem 2x com 60% de isopropanol, certificando-se de remover completamente toda a água dos lados dos poços. 60% de isopropanol, Aspire e rapidamente adicionar solução de óleo vermelho O trabalho sem tocar as paredes dos poços para cobrir o fundo. É fundamental que este passo é feito rapidamente, assim que os poços não secar.</li>
	<li>Se adicionarmos o óleo vermelho O, incube durante 10 minutos à temperatura ambiente com balanço suave.</li>
	<li>Remover todo O vermelho de óleo e adicione imediatamente destilada H2O. Wash com água destilada H2O para 10m começar a remover desacoplado óleo vermelho O. Depois de 10 min, Aspire O vermelho de óleo e repita o procedimento de lavagem 3 x.</li>
	<li>Uma vez que a lavagem é completa, adicionar PBS e as células da imagem. Armazenar as células coradas em PBS a 4 ° C.</li>
</ol>7. protocolo 6: Coloração osteogênica condição com vermelho de alizarina
<ol><li>Remova todo fluido de cada poço. Adicionar um volume adequado de solução de mancha de vermelho de alizarina 2% a cada poço (1,5 mL por bem para uma placa de 12) e inclinar suavemente a placa lateral-lateral até que a solução cobre completamente o fundo do poço.</li>
	<li>Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente. Vermelho de alizarina remova os poços. Suavemente, enxágue cada poço quatro vezes com água destilada H2O, tomando cuidado para não deslocar os cristais de cálcio. Deixe-a secar.</li>
</ol>8. protocolo 7: A coloração tricromo Chondrogenic condição com Masson
<ol><li>
Asse slides em forno seco de 60 ° C por 30 min. seções Deparaffinize e hidrato com água destilada.
	<ol>
<li>Para hidratar, coloque slides em três incubação do 5min com agentes de dealcoholization, seguidos de incubação do 5 min em decrescente concentrações de álcool da seguinte forma: dois em 100% (etanol absoluto) em 95% de álcool, dois em 80%, dois em 70% e, finalmente, dois em água destilada H2O. Slides pode permanecer em H2O enquanto fixador de Bouin está preparada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lugar de 40 mL de fixador de Bouin em uma jarra de plástico coplin microwavable (descoberta). Microondas em alta para trazer a temperatura de 55 ° C. Coloque o slide em uma solução aquecida por 20 min; deixe descansar no balcão coberto. Lavar em água corrente por 10 minutos ou até que todos da cor amarela desaparece.</li>
	<li>Mancha de seções em hematoxilina de Weigert por 10 min. Lave em água corrente por 10 minutos.</li>
	<li>Mancha de seções em solução de fucsina ácida escarlate do Beibrich de 10 min. lavar 3 x 10 min em água da torneira. Mordente slides em solução de ácido fosfotúngstico/fosfomolíbdico durante 10 minutos. Não enxague.</li>
	<li>Coloque slides diretamente na solução azul de anilina durante 10 min. enxaguar com dois mergulhos breves na água da torneira.</li>
	<li>Coloque slides em solução de ácido acético a 1% para 3 a 5 min. Lave em água da torneira por 1 min. lugar em etanol a 95% por 1 min. desidratando, conforme indicado no passo 5.4 e montagem com resina sintética.</li>
</ol>

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<li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Using+human+adipose-derived+stem%2Fstromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li>
<li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Células progenitoras adiposa de diferentes depósitos variam amplamente no fenótipo e diferenciação potencial9. Cultivo de progenitores PVAT-derivado de um único doador paciente na indução simultânea para baixo três linhagens diferentes, adipogenic, osteogênica e chondrogenic, permite uma investigação bem controlada da capacidade deste romance pluripotentes população de células progenitoras. A metodologia descrita neste relatório pode ser usada para testar a capacidade de diferenciação de células p...

Tecido adiposo é uma fonte rica de multi potentes tronco células mesenquimais (MSC) capazes de diferenciar em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic1. Este tecido se expande através da hipertrofia dos adipócitos maduros e de diferenciação de novo de MSC residente de adipócitos. Tecido adiposo de perivascular (PVAT) envolve os vasos sanguíneos e regula a função vascular2,3. Expansão de PVAT induzida pela obesidade exacerba patologias cardiovasculares. Enquanto o potencial multipotent de MSC de depósitos de tecido adiposos subcutâneos humanos têm sido bem estudadas4,5, nenhum estudo tem explantados e avaliada a capacidade de diferenciação das células progenitoras humano PVAT-derivado, provavelmente devido a a invasividade dos contratos. Assim, o objetivo deste trabalho é fornecer uma metodologia de explantes e propagar as células progenitoras de PVAT aórtica humana de pacientes com doença cardiovascular e testar a sua propensão para diferenciar a osteogênica, chondrogenic e adipogenic linhagens. Nossa fonte de PVAT é do local da anastomose do enxerto desvio na crescente aorta de pacientes obesos submetidos à cirurgia de enxerto de bypass de artéria coronária. PVAT recentemente isolado é enzimaticamente dissociada e a fração do estroma vascular é isolada e propagada in vitro, permitindo-nos testar, pela primeira vez, a capacidade de diferenciação de células progenitoras derivadas PVAT humana.
Usando principal culto humano PVAT do estroma vascular fração, testamos três ensaios projetados para induzir células tronco/progenitoras para diferenciar em direção adipogenic, osteogênica, ou linhagens chondrogenic. Nosso estudo prévio identificou uma população de CD73 + CD105 + e células PDGFRa + (CD140a) que podem verdadeiramente diferenciar em adipócitos6, apesar de sua multipotency não foi testado. PVAT regula diretamente de Tom e inflamação vascular7. A justificativa para testar o potencial de diferenciação dessa população celular novela é para começar a entender a influência especializada de PVAT na função vascular e mecanismos de expansão PVAT durante a obesidade. Esta metodologia melhora o nosso entendimento das funções das células progenitoras derivadas de tecido adiposo e nos permite identificar e comparar as semelhanças e diferenças de células progenitoras de fontes diferentes de tecido. Nós construímos abordagens estabelecidos e validados para isolar e diferenciando MSC no sentido de diferentes linhagens e otimizar procedimentos para maximizar a viabilidade de células progenitoras derivadas PVAT humana. Estas técnicas têm aplicações amplas nos campos da haste e progenitoras célula pesquisa e tecido adiposo desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>Mistura de colagenase/dispase livre de animais I &nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCR139</td><td>50mg</td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>NewComerSupply</td><td>1003A</td><td>1% Solução aquosa pH 2,5</td></tr><tr><td>Alizarin Red</td><td>Amresco</td><td>9436-25G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td></td></tr><tr><td>Aniline Blue</td><td>NewComerSupply</td><td>10073C</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico/antimicótico</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Fucsina de ácido escarlate de Beibrich</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A3908-25G</td><td></td></tr><tr><td>b-glicerofosfato</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>Biebrich Scarlet</td><td>EKI</td><td>2248-25G</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Fixador de Bouin</td><td>NewComerSupply</td><td>1020A</td><td></td></tr><tr><td>Bovino albumina sérica</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td>armazenada a 4 &deg; </td></tr><tr><td>Solução de descolamento de células</td> C <td>Accutase</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de sino (70 mm)</td> <td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D4902-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4,5 g / L de glicose, L-glut e piruvato</td></tr><tr><td>DMEM / F12 meio</td><td>ThermoFisher</td><td>10565-042</td><td>glicose alta, glutamax, sódio bicarbinato</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals&nbsp;</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>NewComerSupply</td><td>1090</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina, pele bovina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>suplemento de glutamina</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>10-547F</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I5879-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Solução de insulina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Óleo vermelho O</td><td>Millipore-Sigma</td><td>O0625-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pantotênico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5155-100G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Solução de ácido fosfotúngstico / fosfomoíbdico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P4006-100G / 221856-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Reagente antimicrobiano para meios de cultura.</td></tr><tr><td>Rosiglitazona</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R2408-10MG</td><td></td></tr><tr><td>TGFb1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina de Weigert</td><td>EKI</td><td>4880-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

capacidade de diferenciação de células progenitoras de aorta humana perivascular adiposo

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Tecido adiposo é uma fonte rica de multi potentes tronco células mesenquimais (MSC) capazes de diferenciar em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic. Adipogenic diferenciação de células progenitoras é um mecanismo importante conduzir a expansão do tecido adiposo e disfunção em resposta à obesidade. Mudanças de entendimento para o tecido adiposo de perivascular (PVAT) é, portanto, clinicamente relevantes na doença metabólica. No entanto, estudos anteriores têm sido predominantemente realizada em mouse e outro animal modelos. Este protocolo usa humana torácica PVAT amostras coletadas de pacientes submetidos à cirurgia de enxerto de bypass de artéria coronária. Tecido adiposo da aorta ascendente foi recolhido e utilizado para explantação da fração vascular do estroma. Anteriormente confirmamos a presença de células adiposas reprodutoras em PVAT humana com a capacidade de se diferenciarem em lipídios contendo adipócitos. Neste estudo, mais analisamos o potencial de diferenciação das células da fracção do estroma vascular, presumivelmente, contendo células progenitoras multi potente. Nós comparamos PVAT-derivado de células de medula óssea humana MSC para diferenciação em adipogenic, osteogênica e linhagens de chondrogenic. Após 14 dias de diferenciação, manchas específicas foram utilizadas para detectar o acúmulo de lipídios nos adipócitos (O óleo vermelho), calcificar depósitos em células osteogênicas (vermelho de alizarina), ou glicosaminoglicanos e colagénio nas células chondrogenic (Trichrome de Masson). Enquanto a medula óssea MSC eficientemente diferenciada em todas as três linhagens, PVAT-derivado de células tinham adipogenic e chondrogenic potencial, mas faltava-lhe potencial osteogênico robusto.

Isolamento da fração vascular do estroma de PVAT humana
A figura 1A mostra um diagrama esquemático da região anatômica, onde obteve-se o PVAT sobrejacente a aorta ascendente. Descrevemos anteriormente as populações de pacientes submetidos a revascularização do qual estas amostras foram derivadas6enxerto de bypass. A figura 1B mos...

O objetivo do presente protocolo é testar a capacidade de células progenitoras derivadas de tecido adiposo de perivascular humana de se diferenciar em várias linhagens de célula. Diferenciação foi comparada com as células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea humana, que é conhecida por se diferenciar em adipócitos, osteócito e linhagens de condrócitos.

Capacidade de diferenciação de células progenitoras de aorta humana Perivascular adiposo

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

O tecido adiposo perivascular envolve os vasos sanguíneos e regula a fisiologia cardiovascular. Este protocolo é usado para responder a perguntas-chave relacionadas à função de progenitores adiposos humanos no microambiente vascular. As células progenitoras adiposas variam de acordo com sua localização anatômica.Mostramos que uma população de progenitores multipotentes pode ser derivada com sucesso do tecido adiposo perivascular de pacientes com doenças cardiovasculares. Demonstrando o procedimento estará Spencer Scott, um estudante de medicina do meu laboratório. Obtenha um pedaço de 500 miligramas de Tecido Adiposo Perivascular Humano ou PVAT da sala de cirurgia, conforme descrito no protocolo de texto.Transfira pvat humano fresco do DMEM para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de solução antibiótica. Incubar com balanço por 20 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto o PVAT está em solução de antibióticos, descongele uma alíquota de tampão de dissociação a 37 graus Celsius.Adicione 50 microliters de 100x de solução antibiótico/antimíctico a cinco mililitros de tampão de dissociação e esterilize usando um filtro de seringa de 0,22 mícrons. Adicione um mililitro de solução de gelatina a um poço de uma placa de 24 poços. Em uma capa de fluxo laminar, use fórceps estéreis e tesouras para transferir PVAT da solução antibiótica para uma placa de Petri estéril.Adicione um mililitro de tampão de dissociação pré-aquecido ao tecido. Finamente pica o tecido inteiro em um chorume usando fórceps estéreis e tesouras de dissecção. Transfira o chorume de um mililitro para quatro mililitros de tampão de dissociação.Incubar o tubo de lado em um agitador orbital pré-aquecido de 37 graus Celsius a 200 rpm por uma hora. Após uma hora, não devem estar presentes pedaços de tecido visíveis e a solução aparecerá como uma suspensão celular nublada. Filtre a solução através de um conjunto de filtro de células de 70 mícrons em cima de um tubo cônico de 50 mililitros.Enxágüe o coador com mais 10 mililitros de solução antibiótica para capturar o maior número possível de células. Não aperte o coador. Agora, pelota as células por 12 minutos a 300 vezes g em uma centrífuga de balde balançando.Após a centrifugação, o tubo será separado em uma camada superior gordurosa de adipócitos, uma interfase e uma pelota. A pelota é a fração vascular estromal contendo células endoteliais, células imunes, células sanguíneas e células progenitoras. Resuspense a pelota em 10 mililitros de HBSS e centrífuga por cinco minutos a 300 vezes g.Repita esta etapa para um total de duas lavagens no HBSS. Agora aspire a gelatina de uma placa de 24 poços. Lave suavemente o poço uma vez com HBSS para remover a gelatina sem saída.Resuspend a pelota de fração vascular estromica com glóbulos vermelhos intactos em um mililitro de crescimento médio e sementes no poço revestido de gelatina. Em seguida, adicione FGF2 humano a uma concentração final de 25 nanogramas por mililitro no meio da cultura. Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de CO2.Depois de cultivar as células por 24 horas, remova a mídia de crescimento e lave as células cinco vezes com HBSS. Esta etapa de lavagem remove glóbulos vermelhos e células mortas. Em seguida, adicione um mililitro de nova mídia de crescimento complementada com 25 nanogramas por mililitro FGF2 a cada poço.Mude a mídia a cada 48 horas certificando-se de complementar com 25 nanogramas por mililitro fgf2 fresco cada vez. As células de passagem atingem 100% de confluência de 7 a 10 dias após a explantação. Para isso, aspire a mídia de crescimento e lave a monocamadas duas vezes com um MILilitro HBSS.Aspire todos os HBSS dos poços e adicione algumas gotas de solução de dissociação celular. Bata e gire a placa várias vezes e incubar a 37 graus Celsius com 5%de CO2 por cinco a sete minutos para levantar as células. Em seguida, adicione aproximadamente um mililitro de meio de cultura fresca às células separadas.Distribua 500 microlitadores das células isoladas para dois poços de uma placa de 24 poços cada contendo 500 microliters de mídia de crescimento e 25 nanogramas FGF2. Além disso, cultura células-tronco mesenquimais de medula óssea humana ou colônias MSC como descrito no protocolo de texto. Emplaque os números apropriados de células derivadas de medula óssea e PVAT por poço de uma placa de 12 poços.Para condições adipogênicas e osteogênicas, chapa aproximadamente 200.000 a 225.000 células por poço. Considerando que para condições condrogênicas, placa 150.000 a 175.000 células por poço. Em seguida, dissociar células tanto da população de células progenitoras pvat humanas quanto da população de MSC da medula óssea humana adicionando solução de descolamento celular.Incubar as células na solução de desprendimento a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por cinco minutos. Puxe as populações para 15 mililitros cônicos separados. Gire os frascos para baixo a 500 vezes g durante sete minutos para pelotar as células.Em seguida, resuspense as células em um mililitro de PBS e use um hemótmetro para estimar o número da célula. Emplaque as células em pratos de 12 poços como antes. Forneça pratos separados para as condições adipogênicas e osteogênicas induzidas e não induzidas.E adicione 1,5 mililitros de mídia de condução adipogênica e osteogênica a cada poço da condição induzida. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de mídia não indutiva adipogênica e osteogênica a cada poço da condição não induzida. Iniciar a incubação das populações celulares induzidas por adipogênicos e osteogênicos e não induzidas a 37 graus Celsius e 5%DE CO2.Gire o volume restante de células progenitoras PVAT humanas e MSCs de medula óssea humana por sete minutos a 500 vezes g. Determine o volume necessário para resuspensar as demais pelotas de células derivadas da medula óssea e pvat para atingir uma densidade de 100.000 células por 10 microliters. Em seguida, resuspenque as pelotas no volume calculado de mídia de crescimento msc para indução de linhagem condrogênica.Mova suavemente o volume de células para cima e para baixo usando uma pipeta para garantir uma distribuição homogênea. Agora pipeta uma gotícula de 10 microliter da solução celular concentrada no centro de cada poço para formar uma micro massa de 100.000 células. Coloque um mililitro de água estéril no poço adjacente para evitar a evaporação.Incubar as micro culturas de massa por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 para permitir que a micro massa se acumule. Após duas horas, adicione cuidadosamente a mídia de diferenciação condrogênica cravada com 10 nanogramas por mililitro humano TGF-beta-um para cada um dos poços de condição induzido. Agora adicione cuidadosamente 1,5 mililitros da mídia não indução aos poços de condição não induzidos.Raspe ou despeje a micro massa na condição condrogênica induzida em um, a fim de desidratar, incorporar e manchar a amostra conforme descrito no protocolo de texto. Estudos de diferenciação adipogênica foram realizados em paralelo com as células progenitoras derivadas da medula óssea humana e das células progenitoras derivadas do PVAT. Na condição não induzida, nenhum acúmulo lipídudo é evidente.Isso contrasta com a condição induzida mostrada após a coloração de lipídios neutros com O.Óleo Vermelho Enquanto o grau de diferenciação nas células derivadas de PVAT aórticos humanos é mais robusto, ambas as fontes celulares humanas apresentaram a capacidade de diferenciar para a linhagem adipogênica. O protocolo de diferenciação osteogênica foi utilizado para MSCs derivados da medula óssea humana e células derivadas de PVAT. As células não induzidas não mancharam com Alizarin Red.Após o protocolo de diferenciação osteogênica, os MSCs humanos desenvolveram nódulos calcificados que manchavam com Alizarin Red, enquanto as células Aórticas Humanas PVAT não. As células derivadas tanto dos MSCs de medula óssea humana quanto do PVAT humano apresentaram características características da diferenciação condrogênica com acúmulo abundante de colágeno na micro massa. A micro massa é formada a partir de MSCs de medula óssea humana e células derivadas de PVAT aórticas também apresentaram acúmulo abundante de glicosaminoglicanos, conforme indicado pela coloração azul alciana.Morfologicamente, estruturas semelhantes a lacunas foram detectadas com células sentadas em cavidades cercadas por deposição de colágeno. É fundamental picar finamente o tecido adiposo perivascular antes da dissociação enzimática e garantir que as densidades celulares adequadas sejam banhadas para cada ensaio de diferenciação de linhagem. Após este procedimento, o PCR quantitativo combinado com a bolha ocidental e a citometria de fluxo devem ser usados para caracterizar marcadores específicos de linhagem de progenitores diferenciados de fontes de adipose perivascular e medula óssea.Com essa técnica, podemos começar a entender os mecanismos que regulam a expansão e disfunção do tecido adiposo perivascular durante a obesidade e as implicações que as células progenitoras têm sobre a função vascular e as doenças cardiovasculares.

differentiation-capacity-human-aortic-perivascular-adipose-progenitor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de...

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Os adipócitos maduros podem representar uma fonte abundante de células-tronco por meio da desdiferenciação, o que leva a uma população homogênea de células semelhantes a fibroblastos. A digestão da colagenase é usada para isolar adipócitos maduros da gordura humana. O objetivo do nosso protocolo é obter células de gordura multipotentes e desdiferenciadas a partir de adipócitos humanos maduros.

Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo de porco (pADSC) de tecidos adiposos subcutâneos com exame de multipotência. O pADSC multipotente é usado para delinear processos de diferenciação de adipócitos e estudar a transdiferenciação em múltiplas linhagens celulares de mesênquima mesodérmico ou outras linhagens de ectoderma e endoderme para estudos regenerativos.

Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

Aqui, relatamos um método para o isolamento das populações de células progênitentes de adipócitos (APC) do tecido de tecido adiposo perivascular (PVAT) usando a classificação celular celular ativada por magnética (MCS). Este método permite um maior isolamento de APC por grama de tecido adiposo quando comparado à Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas

A diferenciação dos adipócitos brancos e bege de tecido adiposo vascular progenitores tem potencial para melhoria metabólica em obesidade. Descrevemos os protocolos para um CD34 + CD31 + isolamento de células endoteliais de gordura humana e uma subsequente em vitro expansão e diferenciação em adipócitos brancos e bege. Diversas aplicações a jusante são discutidas.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Apresentamos um protocolo para o isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco derivadas de adipose derivados da crista neural (NCADSCs) do tecido periártico adiposo de Wnt-1 Cre+/-; Rostou rosa26RFP/+. Os NCADSCs podem ser uma fonte de ADSCs facilmente acessível para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro.

Isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco originais de adipose da crista neural do tecido adipogênico periaorótico

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

O protocolo permite a geração de uma população de adipócitos puros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). O ácido retinóico é usado para diferenciar iPSCs em células-tronco mesenquimais (CTMs) que são usadas para produzir adipócitos. Em seguida, uma abordagem de classificação baseada na coloração vermelha do Nilo é usada para obter adipócitos puros.

Diferenciação Robusta de iPSCs Humanas em uma População Pura de Adipócitos para Estudo de Distúrbios Associados a Adpócitos

Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.

Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

Aprenda a isolar e cultivar células progenitoras multipotentes de tecido adiposo perivascular humano para diferenciação em linhagens adipogênica, osteogênica e condrogênica. Este método avança a compreensão da biologia vascular e medicina regenerativa cardiovascular.

Capacidade de diferenciação de células progenitoras de aorta humana Perivascular adiposo

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