Um modelo de cultura em lote in vitro para estimar os efeitos dos regimes intervencionistas na microbiota fecal humana

Considerando o papel emergente do microbioma intestinal em várias doenças humanas, vários moduladores de microbioma intestinal, como probióticos, prebióticos, dietas e drogas podem ajudar na amenização de doenças de saúde associadas ao microbioma intestinal. No entanto, nenhum sistema de triagem rápido e acessível está disponível para prever os efeitos desses moduladores de microbioma intestinal, mas este sistema é simples o suficiente para prever como intervenções particulares podem impactar o microbioma intestinal que, em última análise, pode impactar a saúde do hospedeiro. Este protocolo é simples, acessível e prático para laboratórios que investigam os moduladores de microbioma intestinal e seus efeitos sobre a microbiota e a saúde do hospedeiro.

A manutenção de condições assépticas e anaeróbicas é crucial para este experimento. Além disso, o espécime fecal deve ser usado de novo, imediatamente após a coleta. Caso contrário, se o experimento for planejado posteriormente, a amostra deve ser armazenada a menos 80 imediatamente após a coleta, sem qualquer exposição à temperatura ambiente e ao ar.

A precisão de manuseio durante a preparação e a pipetação também é importante para manter a precisão e a reprodutibilidade. Levará menos de 12 horas durante o dia. Podemos construir uma cultura da noite para o dia se precisarem das amostras em 24 horas.

Em seguida, seguido pelos ácidos graxos de cadeia curta e pela determinação do microbioma. Este processo será demonstrado por dois grandes estudantes da uni, Shokouh Ahmadi e Rabina Mainali do meu laboratório. Para preparar a mídia de fermentação sob uma capa de fumaça, em uma garrafa de reagente na mistura de ímã, misture a solução A, a solução mineral de traço, a solução mineral tracelada, a solução de vitaminas solúveis em água, a solução de biotina de folato, a solução de riboflavina, a solução de hemin, a mistura de ácidos graxos de cadeia curta e a resazurina.

Em seguida, adicione no extrato de levedura da garrafa, carbonato de sódio, monohidroide de cloridrato de cisteína, e tripectose. Adicione 296,1 mililitros de água destilada, ajuste o pH com um cloridrato normal ou hidróxido de sódio para garantir que esteja em torno de 7,0. Transfira o béquer para uma estação de trabalho asséptica e use um filtro de vácuo com tamanho de poros a 0,22 micrômetros para filtrar a mídia para esterilizar.

Para preparar uma solução de diluição anaeróbica de litro, dissolva cinco gramas de cloreto de sódio, dois gramas de glicose e 0,3 gramas de monohidrato de cloridrato de cínstea na água ionizada. Autoclave a garrafa de reagente com tampa a 121,1 graus Celsius por 15 minutos, e armazene-a dentro da câmara anaeróbica. Antes do início do experimento de fermentação, mantenha todos os materiais, soluções e ferramentas necessários para o experimento de fermentação dentro da câmara anaeróbica por pelo menos 48 horas, para garantir que qualquer oxigênio resíduo seja removido.

Pelo menos 24 horas antes do experimento de fermentação, pesar 300 miligramas de inulina, e transferi-lo para um tubo de 50 mililitros, que é então colocado dentro da câmara anaeróbica. Adicione 26 mililitros de fermentação esterilizada no tubo e vórtice para misturar. Permitir a hidratação da fibra por aproximadamente 24 horas.

O dia do experimento de fermentação, prepare o inóculo fecal. Primeiro, pesar cinco gramas de amostra fecal fresca em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione a solução de diluição anaeróbica ao tubo para atingir um volume final de 50 mililitros.

Vórtice por 15 minutos, ou até que completamente homogeneizado. Mantenha os tubos inoculados a 37 graus Celsius dentro da câmara anaeróbica, e inverta suavemente uma vez a cada hora para resuspensar as fibras e o inóculo. Depois de três, seis, nove ou 24 horas, tire a quantidade adequada de mídia fermentada, e centrifugar as amostras a 14.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Congele imediatamente o supernascer e a pelota em nitrogênio líquido, depois de congelar, armazene o supernacido para análise de ácidos graxos de cadeia curta e pelota para análise de microbioma, a menos 80 graus Celsius. Este protocolo é usado para demonstrar o efeito de um prebiótico específico. As fezes de indivíduos humanos saudáveis, após o tratamento com inulina, apresentaram pH relativamente estável por nove horas, enquanto caíram drasticamente após 24 horas.

A inoculação da inulina aumentou significativamente os níveis de ácidos graxos de cadeia curta e lactato em amostra fecal tratada com inulina é comparada com a cultura de microbiota fecal não tratada. A análise principal das coordenadas mostra diferentes a composição da microbiota às medidas unifrac ponderadas e não ponderadas da diversidade beta entre amostras tratadas com inulina e amostras não tratadas. Índices de diversidade alfa versus diversidade filogenética através de árvores inteiras de DP, riqueza de espécies, unidades taxonômicas operacionais, semelhança de espécies, bem como abundância relativa de filos e gêneros principais, todos apresentam diferentes assinaturas de microbiota intestinal entre amostras tratadas com inulina e amostras não tratadas.

O cladograma taxonômico, derivado da análise do tamanho do efeito discriminante linear das sequências 16S, representa a taxa diferencialmente abundante entre diferentes grupos de amostras. Siga todos os passos com cuidado. O mais importante é manter rigorosas condições assépticas e anaeróbicas.

O supernascido e do experimento pode ser usado para tratar mudanças de nível de ácidos graxos de cadeia curta como resultado da fermentação baseada em fibras. Além disso, o na pelota pode ser usado para analisar as alterações na composição do microbioma intestinal. Alguns produtos químicos usados para fazer a mídia cultural são potencialmente perigosos.

Por favor, a folha MSDS e tome precauções em conformidade.