Name: Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a monitorar interações GPCR-β-arrestin em células vivas em tempo real usando ensaio de complementação estrutural. Este método acelera a descoberta de fármacos inovadores com menos efeitos colaterais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa de pesquisa (NRF-2015M3A9E7029172) da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC, e planejamento futuro.

1. estratégia de design da cartilha
<ol><li>Projete primers para introduzir genes de interesse em pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vetores.</li>
	<li>Selecione pelo menos um desses três sites como uma das duas enzimas de restrição exclusivas necessárias para a clonagem direcional devido à presença de um Codon de parada no quadro que divide o site multicloning como mostrado na Figura 111.</li>
	<li>Incorporar a seqüência de nucleotídeo nos primers como mostrado na tabela 1 para codificar os resíduos do vinculador mostrados em vermelho na tabela 211.</li>
	<li>Para os vectores pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], certifique-se de que o primer 5 ́ contém um Codon ATG e uma potente sequência de consenso de Kozak (GCCGCCACC).</li>
	<li>Para os vetores pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-N [TK/SmBiT], assegure-se de que o primer 3 ́ contenha um Codon de parada. Nota: cada vetor contém o promotor HSV-TK para minimizar a associação não específica e reduzir artefatos experimentais, também cada vetor tem uma expressão de fita para a resistência ampicilina em bactérias.</li>
</ol>2. PCR
<ol><li>Configurar e executar reações de PCR para amplificar o DNA da pastilha do gene de interesse usando os primers projetados a partir do passo 1. É importante usar uma polimerase de DNA de alta fidelidade para minimizar as mutações.</li>
	<li>Use exatamente a seguinte ordem para preparar 50 μL de reação de PCR. Adicionar 35,5 μL de água destilada, 5 μL de tampão da polimerase 10x, 5 μL de mistura de dNTP (2,5 mM cada), 1 μL de molde plasmídeo (200 ng/μL), 1,25 μL de primers para a frente e para trás (10 μM) e 1 μL de polimerase de alta fidelidade (5 U/μL).</li>
	<li>Usando um termociclador ajustou acima o seguinte programa da amplificação do ADN.<ol>
<li>Denature a 95 ° c por 5 min.</li>
		<li>Repita 25 vezes o seguinte ciclo térmico: 95 ° c para 30 s, 60 ° c por 1 minuto, 72 ° c por 2 min por 1 KBP a ser amplificado.</li>
		<li>Execute uma extensão final em 72 ° c por 10 min.</li>
		<li>Segure as amostras a 4 ° c dentro do termocicer. Nota: recomenda-se altamente usar um polymerase High-fidelity a fim minimizar mutações do ponto particular aquelas que ocorrem durante a amplificação de seqüências longas. Como o amplicon se torna mais longo, o grau de precisão na replicação do DNA diminui. Para a reação do PCR, escolha a temperatura de recozimento baseada na temperatura de derretimento da região onde os oligos diretamente hibridizam com o molde do ADN e não com toda a seqüência do primer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificação do produto do PCR<ol>
<li>Isole o produto do PCR do descanso da reação do PCR usando um jogo de um fabricante da preferência12. O produto do PCR está agora pronto para a digestão da limitação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. digestão do ADN
<ol><li>Para a digestão do produto do PCR Prepare 50 μL da reação da digestão como segue.<ol>
<li>Utilizando um tubo de 1,5 mL, adicione 12 μL de água destilada.</li>
		<li>Adicione 5 μL de tampão 10x com a melhor compatibilidade com ambas as enzimas de restrição.</li>
		<li>A partir do passo 2,4 Adicionar 30 μL de produto PCR</li>
		<li>Finalmente, adicione 1,5 μL de cada enzima de restrição.</li>
		<li>Misture brevemente pelo Vortex e incubar a 37,5 ° c durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para o receptor plasmídeo digestão preparar 50 μL de reação de digestão como segue:<ol>
<li>Utilizando um tubo de 1,5 mL, adicione 23 μL de água destilada.</li>
		<li>Adicione 5 μL de tampão 10x com a melhor compatibilidade com ambas as enzimas de restrição.</li>
		<li>Adicionar 15 μL de plasmídeo receptor (200 ng/μL).</li>
		<li>Adicionar 1,5 μL de cada enzima de restrição.</li>
		<li>Misture brevemente pelo Vortex e incubar a 37,5 ° c durante a noite. Nota: é importante usar 3 μg de plasmídeo receptor, a fim de obter material suficiente após a purificação do gel de agarose de DNA. Também é relevante deixar digestões de DNA durante a noite usando ambas as enzimas para obter alta eficiência de clonagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. purificação e clonagem do gel do Agarose do ADN
<ol><li>Prepare um gel de agarose 1% para executar o plasmídeo de DNA digerido e insere e proceder para cortar as bandas correspondentes. Uma vez que o vetor correspondente e as faixas da inserção foram purified12, determine a concentração do ADN usando um espectrofotômetro.</li>
	<li>Realize a ligadura de DNA para fundir a pastilha ao plasmídeo receptor.</li>
	<li>Prepare reações de ligadura de cerca de 100 ng de DNA total, incluindo 50 ng de vetor plasmídeo.</li>
	<li>Configurar a taxa de inserção de plasmídeo receptor de aproximadamente 1:3; Ele pode ser calculado usando uma calculadora de inserção vetorial13.</li>
	<li>Configure controles negativos em paralelo. Por exemplo, uma ligadura do DNA plasmídeo receptor sem qualquer pastilha fornecerá informações sobre o quanto de fundo de plasmídeo receptor não digerido ou autoligante está presente.</li>
</ol>5. transformação de clones
<ol><li>Coloc um tubo de DH5α pilhas competentes do congelador em-80 ° c e transfira-o imediatamente no gelo por 20 minutos.</li>
	<li>Após esse tempo, tomar 55 μL de DH5α células competentes e adicionar 4 μL de reação de ligadura e misturar por flicking o tubo e armazenar no gelo por 45 min.</li>
	<li>Coloc o tubo em um banho de água aquecido previamente em 42 ° c para exatamente 48 s e começ imediatamente os tubos de volta no gelo por outros 3 minutos.</li>
	<li>Adicionar 600 μL de caldo de Luria (LB) médio previamente aquecido a 37,5 ° c e incubar com agitação durante 1 hora a 200 rpm.</li>
	<li>Transferir 200 μL para uma placa de ágar contendo ampicilina 100 μg/mL e espalhar suavemente sobre a superfície com o líquido é absorvido principalmente.</li>
	<li>Incubar as placas durante a noite para ver as colônias na manhã seguinte. O plasmídeo receptor na placa de pastilha deve ter significativamente mais colônias do que a placa de plasmídeo receptor sozinho.</li>
</ol>6. isolamento do plasmídeo acabado
<ol><li>Escolha 3-10 colônias bacterianas individuais e transfira para 1 mL de meio LB contendo ampicilina (100 μg/mL) e incubar por 6 h.</li>
	<li>Tomar 200 μL de suspensão bacteriana e transferir para 5 mL de meio LB contendo a mesma concentração de ampicilina como no passo 6,1 e incubar durante a noite a 37,5 ° c com agitação a 200 rpm.</li>
	<li>Usando uma purificação do kit de DNA protocolo, realize purificações de DNA protocolo usando 5 ml de lb cultivadas durante a noite seguindo as instruções do fabricante14.</li>
	<li>Para identificar ligações bem-sucedidas, configurar reações de PCR da mesma forma como na seção 2 usando o DNA obtido da etapa 6,3 como um modelo com os mesmos primers como na seção 2 durante a primeira PCR. Clones positivos produzirão produtos de PCR com o tamanho correspondente.</li>
	<li>Após a purificação grande do ADN da preparação dos clones positivos, conduza uma digestão diagnóstica da limitação de 500 ng do ADN purified com as enzimas usadas durante a etapa do clonagem e funcione os produtos digeridos em um gel do agarose de 1%. Deve haver duas bandas: uma do tamanho do vetor e uma do tamanho da nova inserção.</li>
	<li>Verifique a sequência de construção sequenciando usando os seguintes primers: forward 5 '-aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3 ' e Reverse 5 '-gcatttttttcactgcattctagtt-3 '. Nota: quando o DNA é replicado usando PCR, há sempre a possibilidade de erros durante a amplificação, mesmo quando se utiliza uma polimerase de alta fidelidade, portanto, é muito importante para sequenciar as construções finais.</li>
</ol>7. transfection e expressão da proteína
<ol><li>Em uma placa de poço branco 96 revestida previamente poli-L-lisina, realize a semeadura celular um dia antes da transfecção em 2,5 x 104 células por poço usando o meio de águia modificada de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino Fetal, 100 U/ml de penicilina G e 100 μg/ mL de estreptomicina.</li>
	<li>Use apenas os 60 poços internos para minimizar o potencial de gradientes térmicos nos efeitos da placa e da borda da evaporação. Adicionar 200 μL de água destilada estéril aos 36 poços exteriores e 150 μL nos espaços entre poços e incubar durante a noite a 37,5 ° c e 5% de CO2.</li>
	<li>A manhã seguinte executar transfection usando 100 ng de DNA total (50 ng cada construção).</li>
	<li>Configurar quatro combinações diferentes de plasmídeo (receptor: β-prendedor) de acordo com a Figura 2b.</li>
	<li>Para cada combinação de plasmídeo use 20 μL de mídia essencial de Eagle ' s Minimum Essential tamponada com HEPES usando 0,3 μL de reagente de transfecção lipídico por poço.</li>
	<li>Adicionar 20 μL de transfecção lipídico reagente-mistura de DNA para cada poço e misture a placa em círculos para 10 s.</li>
	<li>Mude o meio fresco após a incubação de 6 horas em 37,5 ° c e 5% CO2.</li>
	<li>Incubar a chapa por 24 h a 37,5 ° c e 5% CO2.</li>
</ol>8. monitorização das interações receptor-β-arrestin1/2 em células HEK293
<ol><li>Aspirar o meio e adicionar 100 μL de média essencial modificada de Eagle ' s mínima armazenada em buffer com HEPES a cada poço e deixe a placa estabilizar em RT por 10 min.</li>
	<li>Prepare o substrato furimazina combinando 1 volume de substrato 100x com 19 volumes de tampão de diluição de LCS (uma diluição de 20 vezes)11, criando um estoque de 5x para misturar com meio de cultura celular.</li>
	<li>Adicione 25 μL de 5x furimazine a cada poço e misture suavemente em círculos por 10 s.</li>
	<li>Medir a luminescência por 10 min para a estabilização do sinal na RT. Nota: ao usar este sinal de linha de base para normalizar a resposta de cada poço, ele ajudará a reduzir a variabilidade causada por diferenças no número de células chapeadas por poço, também diferenças na eficiência de transfecção, etc. Uma vez calculado, a média da resposta normalizada dos poços replicados para um determinado tratamento medicamentoso.</li>
	<li>Prepare a solução do ligante 13.5 x em meios essenciais mínimos modificados da águia tamponado com HEPES.</li>
	<li>Para experimentos em temperatura ambiente com 10 μL de 13,5 x adição de ligantes, adicione os compostos usando injetores ou uma pipeta multicanal e misture a placa com a mão ou usando um agitador orbital (20 s a 200 rpm).</li>
	<li>Para experimentos a 37,5 ° c com 10 μL de 13,5 x adição de ligantes, use injetores para dispensar compostos e misture usando o agitador orbital do instrumento. Em caso de não utilização de injectores, retire a placa do luminómetro, adicione os ligantes e misture a chapa à mão ou utilizando um agitador orbital (20 s a 200 rpm). Nota: use injectores e uma coqueteleira dentro do instrumento de detecção para minimizar as flutuações de temperatura associadas à remoção da placa do luminômetro. Os luminômetros padrão do de bancada podem ser usados para este ensaio. Use um tempo de integração de 0,25 – 2 s.</li>
</ol>

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCRs+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+GPCR+drug+discovery%3A+new+agents%2C+targets+and+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li>
<li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pharmacology+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li>
<li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li>
<li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li>
<li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+%CE%B2-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li>
<li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li>
<li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+signalling%3A+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li>
<li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+signatures+in+%CE%B2-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nanobit+Protein+Protein+Interaction+System+Protocol%22">Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22HiYield+Gel%2FPCR+Fragments+Extraction+Kit%22">HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit</a>. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).</li>
<li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ligation+Calculator%22">Ligation Calculator</a>. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cosmo+Genetech%22">Cosmo Genetech</a>. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS=
 (2019).</li>
<li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+incretins%3A+GLP-1+and+GIP%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li>
<li>ProMega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoGLO+Endurazine+and+Vivazine+Live+Cell+Substrates+Technical+Manual%22">NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Usando o método apresentado aqui, as interações entre todo o GPCR e β-arrestin1/2 podem ser monitoradas em sistemas vivos do tempo real usando este ensaio estrutural da complementação do GPCR-β-prendedor. Neste sentido, nós pudemos observar o recrutamento diferencial do β-prendedor entre as duas isoformas do β-prendedor pelo GLP-1R (uma classe protótipo B GPCR), nós igualmente observamos uma dissociação do complexo do receptor-β-prendedor alguns minutos após ter alcançado o máximo sinal luminescente.
<p class="jove_c...

Os GPCRs representam o alvo de quase 35% dos fármacos atuais no mercado1,2 e um entendimento claro de sua farmacologia é crucial no desenvolvimento de novas drogas terapêuticas3. Um dos aspectos-chave na descoberta da droga de GPCR, particular durante o desenvolvimento de agonistas tendenciosos é a caracterização de ligantes novos para interações do receptor-β-prendedor4 e interações do β-prendedor com outras proteínas citosólico tais como clathrin5.
Foi documentado que a sinalização dependente do β-prendedor joga um papel chave em desordens neurológicas tais como a desordem bipolar, a depressão principal, e a esquizofrenia6 e igualmente efeitos secundários severos em alguns medicamentações tais como a morfina7.
Os métodos atuais usados para monitorar essas interações geralmente não representam os níveis endógenos reais das proteínas em estudo, em alguns casos eles mostram sinal fraco, fotobranqueamento e dependendo da GPCR pode ser tecnicamente desafiador para configurar8. Este novo ensaio de complementação estrutural utiliza vetores de promotor de baixa expressão para imitar os níveis fisiológicos endógenos e proporciona alta sensibilidade em relação aos métodos atuais9. Usando essa abordagem, foi possível caracterizar facilmente a galanin receptor-β-arrestin1/2 e também as interações β-arrestin2-clathrin10. Esta metodologia pode ser amplamente utilizada para qualquer GPCR de particular interesse onde os β-prendedor desempenham uma função fisiológica chave ou sua sinalização é relevante em algumas doenças.

<table><tbody><tr><td>Antibióticos penicilina estreptomicina</td><td>Welgene</td><td>LS202-02</td> Incubadora bacteriana de <td>penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td></td><td>JEIO Tech</td><td>IB-05G</td><td>Incubadora (Air-Jacket), Basic</td></tr><tr><td>Cell Culture Medium</td><td>Welgene</td><td>LM 001-05</td><td>DMEM Cell culture medium</td></tr><tr><td>Cell transfection medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Optimem 1X cell culture medium</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>NUAIRE</td><td>NU5720</td><td>Incubadora de CO2 de Calor Direto</td></tr><tr><td>Banho-maria digital</td><td>Laboratório técnico</td><td>LWB-122D</td><td>Banho-maria digital técnico de laboratório</td></tr> DNA <tr><td>Polimerase leitura à prova</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1011</td><td>PfU DNA polimerase</td></tr><tr><td>Kit de purificação de DNA</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>miniprepKit de purificação LaboPass Plasmídeo Mini</td></tr><tr><td>DNA Taq Polimerase</td><td>Enzynomics</td><td>P750</td><td>nTaq DNA polimerase</td></tr><tr><td>Restrição enzimática BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>BglII</td></tr><tr><td>Tampão de restrição enzimática</td><td>New England Biolabs</td><td>B72045</td><td>CutSmart 10X Buffer</td></tr><tr><td>Restrição enzimática EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>EcoRI-HF</td></tr><tr><td>Restrição enzimática NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R01315</td><td>NheI</td></tr><tr><td>Restrição enzimática XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>XhoI</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco Canadá</td><td>12483020</td> Gel de <td>soro bovino fetal</td></tr><tr><td>/PCR DNA MiniKit</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>KH23108</td><td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td></tr><tr><td>Ligase</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1025</td><td>T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>Microscópio óptico</td><td>Olympus</td><td>CKX53SF</td><td>CKX53 Microscópio Olympus</td></tr><tr><td>reagente de transfecção de lipídios</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Luminômetro</td><td>Biotek / Fisher Scientific</td><td>12504386</td><td>Synergy 2 Leitores de microplacas multimodo</td></tr><tr><td>Sistema NanoBiT</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>NanoBiT PPI MCS Sistema inicial</td></tr><tr><td>Substrato de nanoluciferase</td><td>Promega</td><td>N2012</td><td>Nano-Glo Sistema de ensaio de células vivas</td></tr><tr><td>PCR Termociclador</td><td>Eppendorf</td><td>6336000015</td><td>Ciclador mestre Nexus SX1</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Solução de poli-L-lisina</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Trysin EDTA 10X</td></tr><tr><td>Cultura de células brancas 96 placas de poços</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>Placa de ensaio de 96 poços</td></tr></tbody></table>

monitorando gpcr-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

As interações entre receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e β-prendedor são processos vitais com implicações fisiológicas de grande importância. Atualmente, a caracterização de drogas novas para suas interações com β-prendedor e outras proteínas citosólico é extremamente valiosa no campo da descoberta da droga de GPCR particular durante o estudo do agonism tendencioso de GPCR. Aqui, mostramos a aplicação de um novo ensaio de complementação estrutural para monitorar com precisão as interações receptor-β-prendedor em sistemas vivos em tempo real. Este método é simples, exato e pode facilmente ser estendido a todo o GPCR do interesse e igualmente tem a vantagem que supera interações inespecíficas devido à presença de um promotor da baixa expressão atual em cada sistema do vetor. Este ensaio de complementação estrutural fornece características-chave que permitem um monitoramento preciso e preciso das interações receptor-β-prendedor, tornando-o adequado no estudo do agonismo tendencioso de qualquer sistema GPCR, bem como a fosforilação do GPCR c-Terminus códigos ' escritos por diferentes GPCR-quinases (GRKs) e modificações pós-translacionais de presas que estabilizam ou destabilizam o complexo receptor-β-prendedor.

Usando o procedimento apresentado aqui, as interações entre um GPCR protótipo e duas isoformas do β-prendedor foram monitoradas. Glucagon como os construtores do receptor do peptide (GLP-1R) foram feitos usando os primers que contêm locais da limitação da enzima de NheI e de EcoRI e clonados nos vetores pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] quando no caso de β-prendedor, dois vetores adicionais foram usado pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] usando sites de restrição enzimática BgIII e EcoRI no caso de ...

As interações de GPCR-β-prendedor são um campo emergente na descoberta da droga de GPCR. Métodos precisos, precisos e fáceis de configurar são necessários para monitorar tais interações em sistemas vivos. Nós mostramos um ensaio estrutural da complementação para monitorar interações de GPCR-β-prendedor em pilhas vivas do tempo real, e pode ser estendido a todo o GPCR.

Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Este protocolo tem um alto impacto no campo da descoberta e desenvolvimento de drogas, especialmente no desenvolvimento de novas drogas de primeira classe com efeitos colaterais mínimos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser aplicada a qualquer sistema GPCR, e usada para obter informações precisas sobre farmacologia receptora em sistemas de vida em tempo real. As implicações desta técnica estão intimamente relacionadas a novas terapias, particularmente onde as beta-prendeções são relevantes.Estes incluem receptores de opiod em receptores de dor e dopamina na esquizofrenia. Este método pode ser útil em muitas áreas de pesquisa científica médica, da neurologia à doença cardiopulmonar. A demonstração pcr do nosso método é importante, pois permite uma apresentação detalhada das etapas críticas no protocolo, o que não seria possível com a publicação convencional.Comece projetando primers para introduzir genes de interesse aos vetores pBiT. Devido ao codon de parada de inframe que divide o site de multi-clonagem, selecione pelo menos um dos três locais como uma das duas enzimas de restrição únicas necessárias para clonagem direcional. Consulte o manuscrito para sequências de nucleotídeos para codificar os resíduos do linker e incorporá-los nos primers.Para o pBiT1.1-C e pBiT2.1-C certifique-se de que o primer dianteiro contém um códon ATG e uma potente sequência de consenso Kozak. Para o pBiT1.1-N e pBiT2.1-N certifique-se de que o primer reverso contenha um códon stop. Use os primers projetados para amplificar o DNA de inserção do gene de interesse.Combine os reagentes PCR de acordo com as instruções do manuscrito, certificando-se de usar uma polimerase de DNA de alta fidelidade para minimizar mutações. Programe o termociclador e inicie a reação. Após completar o PCR, digerir o produto em uma reação de digestão de 50 microliter.Em um tubo de 1,5 mililitro, combine 12 microliters de água destilada, cinco microliters do tampão de digestão de restrição 10X apropriado e 30 microliters do produto PCR. Em seguida, adicione 1,5 microliters de cada enzima de restrição. Vórtice a mistura de reação.E incubar durante a noite a 37,5 graus Celsius. Prepare uma segunda reação para digerir o plasmídeo receptor. Em um tubo de 1,5 mililitro, combine 23 microliters de água, cinco microliters do tampão de digestão de restrição de 10X apropriado, 15 microlitrais do plasmídeo receptor e 1,5 microlitres de cada enzima de restrição.Misture brevemente o tubo. E incubar durante a noite a 37,5 graus Celsius. No dia seguinte à clonagem e transformação, escolha de três a dez colônias bacterianas individuais e transfira-as para um mililitro de meio LB com ampicillina.Incubar as células por seis horas. E então transfira 200 microliters de suspensão bacteriana para cinco mililitros de meio LB fresco com ampicillina. Incubar a cultura a 37,5 graus Celsius com agitação a 200 rpm durante a noite.No dia seguinte, isole o plasmid com um mini-kit de purificação de DNA. Trie o plasmídeo purificado para uma ligadura bem sucedida com PCR. Um dia antes da transfecção, semeou as células em uma placa de 96 poços revestido de poli-L-lysina usando o meio modificado da Águia de Dulbecco suplementado com soro bovino 10% fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina G, e 100 microliters por mililitro de estreptomicina.Adicione apenas células aos 60 poços internos para minimizar o potencial de gradientes térmicos através da placa e efeitos de borda da evaporação. Adicione 200 microlitros de água destilada estéril aos 36 poços externos e 150 microlitros nos espaços entre os poços. Em seguida, incubar a placa durante a noite a 37,5 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, realize a transfecção usando um total de 100 nanogramas de DNA. Configure quatro combinações diferentes de plasmídeos de acordo com as instruções do manuscrito. Utilizando 20 microliters de mídia essencial mínima modificada da Eagle tamponadas com HEPES, e 0,3 microliters de reagente de transfecção lipídica por poço.Adicione 20 microliters de reagente de transfecção lipídica e mistura de DNA a cada poço, e misture a placa em círculos por 10 segundos. Incubar a placa a 37,5 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas. Refrescar o meio.E incubar por mais 24 horas. Após a incubação, aspire o meio e adicione 100 microliters de mídia essencial modificada da Eagle tamponada com HEPES para cada poço. Deixe a placa estabilizar à temperatura ambiente por 10 minutos.Enquanto isso, prepare o substrato de furimazina combinando um volume do substrato 100X com 19 volumes de tampão de diluição LCS, criando um estoque de 5X para misturar com o meio de cultura celular. Quando as células estiverem prontas, adicione 25 microliters do estoque a cada poço e misture suavemente a placa por 10 segundos. Em seguida, meça a luminescência por 10 minutos à temperatura ambiente para estabilização do sinal.Para experimentos com adição de ligantes, prepare a solução de ligante 13,5X na mídia essencial mínima modificada da Eagle tamponada com HEPES, e adicione 10 microliters por poço usando uma pipeta multicanal. Em seguida, misture a placa à mão ou com um agitador orbital. Este protocolo tem sido usado com sucesso para estudar interações entre um GPCR prototípico e dois isoforms de beta-arrestina.Quatro combinações plasmidas diferentes foram rastreadas, e a com o maior sinal luminescente foi selecionada para outros experimentos. Os valores EC50 para cada isoforma beta-detenção foram determinados por meio de curvas de dose-resposta, que foram obtidas a partir da resposta máxima de cada concentração de estudos cinéticos. É fundamental prestar atenção especial ao projetar os primers PCR.O desenvolvimento das construções certas é essencial para o sucesso desses ensaios. Seguindo essa metodologia, você poderá monitorar as interações receptor-beta-prender, bem como interações receptoras com outras proteínas citosóicas. Essa metodologia ajudará a responder a perguntas fundamentais no campo da farmacologia GPCR, estudando como as interações GPCR-beta-arrestin podem ser moduladas por modificações na estrutura de ligantes.

monitoring-gpcr-arrestin12-interactions-real-time-living-systems-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

O ensaio de mobilização de cálcio e de fluorescência baseada aqui descrito é um sistema de rastreio inverso farmacologia de médio rendimento para a identificação de ligandos funcionalmente activação (s) de órfãos receptores acoplados à proteína (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.

Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

Métodos simples para detectar a ativação seletiva de proteínas G por receptores acoplados à proteína G continuam sendo um grande desafio na sinalização celular. Aqui, os biossensores de transferência de energia de ressonância Fӧrster (FRET) foram desenvolvidos amarrando um GPCR a peptídeos de proteína G para sondar mudanças conformacionais em concentrações controladas em células vivas.

Conformações GPCR G Protein selectivos medida usando FRET Sensores em um Fluorometer Ensaio de células vivas de suspensão

Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

O ensaio de celular descrito destina-se a identificação do receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4)-interação agentes que inibem ou estimulam, competitivos ou qual alostericamente, o intracelular Ca2 + lançamento iniciado pela ativação de CXCR4.

Um cinética baseada em fluorescência Ca2 + mobilização ensaio para identificar agonistas do Receptor acoplado à proteína G, antagonistas e moduladores alostéricos

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Dado que os GPCRs são alvos atraentes para drogados, a triagem de ligantes GPCR é, portanto, indispensável para a identificação de compostos de chumbo e para estudos de desordeiro. Para esses esforços, descrevemos o PRESTO-Tango, uma plataforma de recursos de código aberto usada para o perfil simultâneo de recrutamento transitório β-arrestin2 em aproximadamente 300 GPCRs usando um ensaio de repórter baseado em TEV.

Interrogatório paralelo de β-Arrestin2 Recrutamento para Triagem de Ligand em escala GPCR usando ensaio PRESTO-Tango

O S1P exerce seus diversos efeitos fisiológicos através da subfamília de receptores S1P (S1PRs). Aqui, um pipeline é descrito para expor sobre as estruturas e função das S1PRs.

Um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

O protocolo apresentado neste estudo ilustra a eficácia do Detector de Diferença de AMPc In Situ  na medição do AMPc através de dois métodos. Um método utiliza um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com células HEK-293. O outro método demonstra células HASM individuais sob um microscópio fluorescente.

Dinâmica de cAMP em tempo real em células vivas usando o detector de diferença de cAMP fluorescente in situ

Este protocolo descreve o uso de biossensores baseados em BRAKET para medição em tempo real da ativação da proteína G em células vivas HEK293 após estimulação do ligante do receptor acoplado à proteína G. Aqui, o receptor β2-adrenérgico e o receptor canabinóide tipo 1 servem como exemplos para demonstrar a eficiência dos sensores para vários subtipos de proteína G e em vários GPCRs.

Biossensores de proteína G baseados em BRAKET para medir a atividade do receptor acoplado à proteína G em células vivas

Aprenda a monitorar interações GPCR-β-arrestin em células vivas em tempo real usando ensaio de complementação estrutural. Este método acelera a descoberta de fármacos inovadores com menos efeitos colaterais.

Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas

Explorar mais vídeos