Name: Uma aproximação simples para executar medidas de TEER usando um volt-AMPEREMETER self-made com freqüência programável da saída (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a montar um volt-amperímetro de baixo custo com frequência programável para medir impedância transepitelial em monocamadas epiteliais. Este método acessível utiliza componentes eletrônicos padrão e sensores de quatro terminais.

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Os autores gostariam de agradecer a Herman Liggesmeyer e Marvin Bende pelo seu aconselhamento especializado em Eletrotécnica e informática.

1. montagem de um volt-AMPEREMETER básico para a medida do TEER
<ol><li>Prepare um carregador USB padrão como a fonte de alimentação de 5 V DC, um cabo de extensão USB, um microcontrolador que será usado como um gerador de onda quadrada programável, dois multímetros padrão que são capazes de medir corrente alternada e tensão como raiz média quadrada ( True-RMS), quatro cabos com plugues da banana, um cabo de extensão do telefone com um conector fêmea RJ14 que inclui seis pinos com os quatro internos prendidos (6P4C), dois cabos curtos, um terminal do brilho, um 120 kΩ Pre-resistor, ferrules da extremidade do fio, e lugs de solda. As ferramentas exigidas são um descascador da isolação, uma ferramenta de friso, e um ferro de solda.</li>
	<li>Primeiro, conecte a extensão USB à placa do microcontrolador.</li>
	<li>Tira o isolamento final de dois cabos curtos. Soldar um lado por cabo ou diretamente aos pinos 0 e 2 do microcontrolador ou aos talões de solda, que por sua vez são cortados nos respectivos pinos. Friso as outras extremidades para a extremidade do fio virolas e conectá-los a um terminal de brilho como representado na Figura 1.</li>
	<li>Ligue os plugues de banana para os multímetros. Tira e friso a outra extremidade de cada um dos quatro cabos.</li>
	<li>Corte o cabo de extensão do telefone em duas partes e desmontar e friso os condutores do lado que contém o conector fêmea. Verifique a continuidade dos condutores e pinos.</li>
	<li>O primeiro multímetro será usado para medir a corrente em μA (note que o modo AC tem de ser definido explicitamente). Conecte-o em uma série com um pré-resistor de 120 kΩ para pinos cinco e seis do conector RJ14, correspondendo ao par de eletrodos externo do eletrodo de pauzinho.</li>
	<li>Finalmente, vincular o segundo multímetro, que será usado para medir a queda de tensão transepielial em mV, através do terminal de brilho para pinos três e quatro do conector RJ14, correspondendo ao par eletrodo interno do eletrodo pauzinho.</li>
	<li>Se desejar, monte a instalação em um chassi.</li>
</ol>2. programar o microcontrolador
<ol><li>Modifique o código-fonte fornecido (arquivo de codificação suplementar 1) conforme necessário. Na forma dada, os pinos 0 e 2 alternarão entre o solo e + 5 V com 40 MS de meia-hora de oscilação. Assim, um sinal de onda quadrada com uma amplitude de 5 V e uma frequência de aproximadamente 12,5 Hz será gerado. Os valores reais podem diferir devido à imprecisão do emissor de tempo do microcontrolador.</li>
	<li>Conecte o microcontrolador a um computador desktop através de uma porta USB e carregue o código-fonte com o software correspondente25.</li>
</ol>3. gravação de oscilosgramas de tensão (opcional)
<ol><li>Contorne os pinos cinco e seis do conector RJ14 com um resistor de teste de 1 kΩ e conecte-se a um osciloscópio.</li>
	<li>Verifique a frequência, a tensão de pico e a forma de onda. Digitalize e exporte os dados.</li>
	<li>Se desejado, oscilogramas de registro de um dispositivo de referência (EVOM) e o voltamômetro automontado para comparação. Nota: neste caso, os dados foram gravados com um escopo de armazenamento digital HM 208. Sendo um osciloscópio digital muito básico, a imagem pode ser digitalizada internamente (congelada), mas teve que ser plotada usando um gravador analógico PM 8143 X-Y. A imagem foi posteriormente digitalizada.</li>
</ol>4. cultivo da pilha e medida de TEER
<ol><li>Células de papiloma do plexo coróide humano de semente (HIBCPP) em inserções de filtro de cultura celular com um tamanho de poros de 3 μm em DMEM/F12 (ver tabela de materiais) contendo 10% de soro de bezerro fetal9. Cresça as células a 37 ° c em uma atmosfera saturada de água contendo 5% de CO2 , conforme descrito por Dinner et al.9.</li>
	<li>Quando os filtros atingem uma impedância de 70 Ω ∙ cm2, mude para DMEM/F12 sem soro e defina o temporal como dia 0.</li>
	<li>Conecte o eletrodo à porta RJ14 do voltamômetro automontado e conecte a fonte de alimentação USB. Defina os multímetros para o modo de tensão AC (mV) e o modo de corrente AC (μA), respectivamente.<ol>
<li>Alternativamente, conecte o eletrodo a um dispositivo de referência disponível comercialmente e ative de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esterilizar o eletrodo em etanol a 80% por 10 min e equilibrar no meio apropriado por mais 10 min.</li>
	<li>Coloque o eletrodo em ambos os compartimentos de um sistema de inserção de filtro de cultura celular (a parte mais longa do eletrodo no compartimento inferior e a parte mais curta no compartimento superior) contendo uma camada de células HIBCPP até que os valores de medição permaneçam constantes.</li>
	<li>Para um dispositivo de referência, anote a impedância diretamente ou Calcule a impedância de acordo com a lei de Ohm (R = U/I) para o voltamômetro automontado. Esteja ciente de que o ângulo do eletrodo afeta as medições.</li>
	<li>Repita a medida de TEER (etapas 3 − 6) do dia 0 até o dia 4.</li>
</ol>

<ol><li>Matter, K., Balda, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of tight junctions.</a> Methods. 30, 228-234 (2003).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).</li>
<li>Daniels, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells+maintain+the+properties+of+primary+cells+in+an+in+vitro+model+of+immune+migration+across+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier.</a> Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).</li>
<li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-enhanced%2C+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160(2014).</li>
<li>Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+invasion+and+transcytosis+in+transfected+human+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).</li>
<li>Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+immortalized+human+cerebromicrovascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).</li>
<li>Ishiwata, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroids+plexus+papilloma+cell+line+%28HIBCPP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Human Cell. 18, 67-72 (2005).</li>
<li>Dinner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Choroid+Plexus+Epithelial+Cell-based+Model+of+the+Human+Blood-Cerebrospinal+Fluid+Barrier+to+Study+Bacterial+Infection+from+the+Basolateral+Side%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Schwerk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+a+novel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PLoS One. 7, e30069(2012).</li>
<li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).</li>
<li>Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+choroid+plexus+cells+in+culture%3A+expression+of+polarized+phenotype%2C+maintenance+of+barrier+properties+and+apical+secretion+of+CSF-components%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components.</a> European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).</li>
<li>Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Choroid+plexus+epithelial+cells+in+culture%3A+regulation+of+barrier+properties+and+transport+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes.</a> Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).</li>
<li>Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+blood-brain+interfaces+in+relation+to+brain+disposition+of+small+compounds+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules.</a> Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Mathia, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+characteristics+of+calu-3+human+bronchial+epithelial+cells%3A+in+vitro-in+vivo+correlation+to+predict+lung+absorption+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats.</a> Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).</li>
<li>Fuchs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+alveolar+epithelial+cells+in+primary+culture%3A+morphological+characterization+and+synthesis+of+caveolin-1+and+surfactant+protein-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C.</a> Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).</li>
<li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li>
<li>Yeste, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+correction+factor+for+transepithelial+electrical+resistance+measurements+in+Transwell+and+microfluidic+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures.</a> Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754(2016).</li>
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<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).</li>
<li>Esch, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+chip+porous+polymer+membranes+for+integration+of+gastrointestinal+tract+epithelium+with+microfluidic+%27body-on-a-chip%27+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices.</a> Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).</li>
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<li>Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+cell+monitoring%3A+barrier+properties+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5(2013).</li>
<li>Hufnagl, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Time+Resolved+Transepithelial+Impedance+Spectroscopy+Of+Caco+2+Monolayers+Relying+on+Lithographically+Patterned+Basolateral+Electrode+Cell+Arrays%22">Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays</a>. , University of Vienna. (2010).</li>
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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Antes que um voltamômetro self-made possa ser usado em uma rotina diária, é essencial verific o dispositivo para a função apropriada. No nosso caso, uma meia-hora de oscilação de 40 MS (12,5 Hz) foi programada, mas o tempo de oscilação efetivo acabou por ser de 60 MS (16,7 Hz). Esta imprecisão do emissor de tempo do microcontrolador não teve nenhum impacto detectável em medidas de TEER. Talvez seja melhor determinar a freqüência real usando a configuração de freqüência de um dos multímetros. Se algum desvio for encontrad...

As células epiteliais e endoteliais funcionam como limites celulares, separando os lados apical e basolateral do corpo. Se forem conectados através de junções apertadas, a difusão passiva da substância através dos espaços transcelulares paracelulares é restringida1, tendo por resultado a formação de uma barreira seletivamente permeável. Vários sistemas de barreira artificial foram desenvolvidos2 usando células endoteliais microvasculares (hbmec, barreira hematoencefálica3,4,5,6,7), plexocoróide células epiteliais (hibcpp/pcpec, barreira hemato-liquórica8,9,10,11,12,13,14), células de adenocarcinoma colorretal (Caco-2, modelos gastrintestinais15), oulinhagens de células aéreas/alveolares (modelos pulmonares16,17). Estes sistemas consistem tipicamente nas pilhas crescidas em um monocamada em membranas permeáveis (isto é, sistemas da inserção do filtro) para permitir o acesso aos lados apical e basolateral. É importante que a integridade do sistema modelo corresponda às condições in vivo. Assim, várias técnicas foram desenvolvidas para analisar a função de barreira medindo a difusão paracelular de compostos traçador em toda a camada celular. Essas substâncias incluem sacarose radiomarcada, albumina rotulada com corante, inulina rotulada com FITC ou dextranos2rotulado com corante. No entanto, corantes químicos podem tornar as células inutilizáveis para outras experiências. Para monitorar os sistemas de barreira de forma não invasiva, a mensuração da resistência elétrica transepielial/transendotelial (teer) em monocamada celular pode ser utilizada2,18,19. Porque os sistemas do elétrodo bipolar são influenciados pela impedância da polarização do elétrodo na relação do elétrodo-eletrólito, as medidas tetrapolar são usadas geralmente para superar esta limitação20. A técnica de underpostura é uma detecção de quatro terminais (4T) que foi descrita pela primeira vez em 1861 por William Thomson (Lord Kelvin)21. Em suma, a corrente é injetada por um par de eletrodos de transporte atual, enquanto um segundo par de eletrodos de detecção de voltagem é usado para medir a queda de tensão20. Hoje em dia, os chamados elétrodos do chopstick consistem em um par de elétrodos dobro, cada um que contem uma pelota da prata/prata-cloreto para medir a tensão e um elétrodo de prata para passar a corrente2. A impedância elétrica é medida entre o compartimento apical e o basolateral com a camada celular entre (Figura 1). Um sinal de onda quadrada em uma freqüência de tipicamente 12,5 Hz é aplicado nos eletrodos externos e a corrente alternada resultante (AC) medida. Adicionalmente, a gota potencial através da camada da pilha é medida pelo segundo par (interno) do elétrodo. A impedância elétrica é então calculada de acordo com a lei de Ohm. Os valores de TEER são normalizados multiplicando a impedância e a área de superfície da camada celular e são tipicamente expressos em Ω ∙ cm2.
Há os sistemas em que as pilhas e os elétrodos são arranjados em uma maneira mais sofisticada, mas são baseados igualmente no princípio de medição 4T e podem ser usados com os mesmos dispositivos da medida. Os sistemas de EndOhm, por exemplo, em que o filtro é introduzido, contêm uma câmara e um tampão com um par de elétrodos concêntricos com a mesma estrutura que o elétrodo do chopstick. A forma dos eletrodos permite um fluxo de densidade de corrente mais uniforme em toda a membrana, reduzindo assim a variação entre as leituras. Ainda mais complexo (mas também mais preciso) é uma câmara Ussing, onde uma camada celular separa duas câmaras preenchidas com solução de Ringer22. A própria câmara pode ser gaseificada com oxigénio, CO2ou N2, e agitada ou suplementada com substâncias experimentais. Porque o transporte do íon através da camada da pilha ocorre, uma diferença potencial pode ser medida por dois elétrodos tensão-detectando perto do tecido. Esta voltagem é cancelada por dois eletrodos de transporte de corrente colocados ao lado da camada celular. A corrente medida dará então o transporte de íons líquidos e a resistência transepitelial, que reflete a integridade da barreira, pode ser determinada22. A medida de teer pode igualmente ser aplicada nos sistemas Body-on-a-chip que representam os modelos de barreira-tecido23,24. Estes sistemas imitam in vivo as condições das células e muitas vezes consistem em vários tipos de células, empilhadas em cima umas das outras em camadas.
O protocolo a seguir explica como configurar um voltamômetro econômico e confiável com frequência de saída programável que não produz diferenças estatisticamente significativas no TEER em comparação com os sistemas de medição disponíveis comercialmente.

<table><tbody><tr>Resistor de <td></td><td></td><td>120 kOhm</td><td>Equipamento geral (genérico)</td></tr><tr><td>Cabos</td><td></td><td></td> de plugue banana <td>Equipamento geral (genérico)</td></tr><tr><td>Cabos</td><td></td><td></td><td>Equipamento geral (genérico)</td></tr><tr><td>Eletrodo de pauzinho</td><td>Merck Millicell</td><td>MERSSTX01</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo de pauzinho (alternativo)</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>STX2</td><td></td></tr><tr>Ferramenta <td></td><td></td><td>de crimpagem</td><td>Ferramenta geral</td></tr><tr><td>Digispark / ATtiny85</td><td>AZ-Delivery Vertriebs GmbH</td><td>Digispark Rev.3 Kickstarter</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco (Thermo Fisher)</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)/Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de filtro 3&micro; m translúcido</td><td>Greiner Bioone</td><td>662631</td><td></td></tr><tr><td>HIBCPP</td><td></td><td></td><td>Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten</td></tr><tr><td>Decapador</td><td></td><td></td><td>de isolamento Ferramenta geral</td></tr><tr><td>Terminal de brilho Equipamento</td><td></td><td></td><td>geral (genérico)</td></tr><tr><td>Osciloscópio</td><td>HAMEG</td><td>Escopo de armazenamento digital HM 208</td><td></td></tr><tr><td>Plotter</td><td>PHILIPS</td><td>PM 8143 X-Y gravador</td><td></td></tr><tr><td>Software Arduino</td><td>https://www.arduino.cc</td><td>Arduino 1.8.9</td><td></td></tr><tr><td>Ferro</td><td></td><td></td> de solda <td>Ferramenta geral</td></tr><tr><td>Terminais</td><td></td><td></td> de solda <td>Equipamento geral (genérico)</td></tr><tr><td>Cabo telefônico com conector</td><td></td><td></td> RJ14 (6P4C) <td>Equipamento geral (genérico)</td></tr><tr><td>Resistor de teste</td><td>Merck Millicell</td><td>MERSSTX04</td><td></td></tr><tr><td>Multímetros True-RMS</td><td>VOLTCRAFT</td><td>VC185</td><td></td></tr><tr><td>Carregador</td><td></td><td></td> USB <td>Equipamento geral (genérico)</td></tr><tr><td>Cabo</td><td></td><td></td> de extensão USB <td>Equipamento geral (genérico)</td></tr><tr><td>Voltohímetro para medição TEER</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>EVOM</td><td></td></tr><tr><td>Voltohímetro para medição TEER (alternativa)</td><td>Merck Millicell</td><td>ERS</td><td></td></tr><tr><td>Virolas</td><td></td><td></td> de extremidade de fio <td>Equipamento geral (genérico)</td></tr></tbody></table>

uma aproximação simples para executar medidas de teer usando um volt-amperemeter self-made com freqüência programável da saída

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

A resistência elétrica transepielial/endotelial (TEER) tem sido utilizada desde a década de 1980 para determinar a confluência e a permeabilidade dos sistemas de barreira in vitro. Na maioria dos casos, os elétrodos do chopstick são usados para determinar a impedância elétrica entre o compartimento superior e mais baixo de um sistema da inserção do filtro da cultura da pilha que contem monolayers celulares. A membrana do filtro permite que as células aderem, polarizar e interagir construindo junções apertadas. Esta técnica foi descrita com uma variedade de linhas de pilha diferentes (por exemplo, pilhas da barreira do sangue-cérebro, da barreira sangue-cerebrospinal do líquido, ou do intervalo gastrintestinal e pulmonar). Os dispositivos da medida de TEER podem prontamente ser obtidos dos fornecedores diferentes do equipamento de laboratório. No entanto, há soluções mais rentáveis e personalizáveis imagináveis se um voltamômetro apropriado for automontado. O objetivo geral desta publicação é configurar um dispositivo confiável com freqüência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medição TEER.

Para comparar a operação de um voltamômetro automontado com sua contraparte comercialmente disponível, foi registrado um oscilosgrama de tensão de ambos os dispositivos.
Como mostrado na Figura 2a, oinstrumento de referência gerou um sinal de onda quadrada com uma amplitude de 80 MV e um tempo de oscilação de 80 MS, que corresponde a uma frequência de 12,5 Hz, quando operando em carga com um res...

Aqui, demonstramos como configurar um volt-AMPEREMETER barato com frequência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medições de resistência elétrica transepielial/endotelial.

Uma aproximação simples para executar medidas de TEER usando um volt-AMPEREMETER self-made com freqüência programável da saída

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

A medição da impedância elétrica transepitelial tem sido usada desde a década de 1980 para determinar a confluência e a função da barreira das monocamadas epiteliais na cultura celular. A técnica subjacente é um sensor de quatro terminais que usa diferentes pares de eletrodos de transporte de corrente e detecção de tensão para fazer medições mais precisas. Existem vários dispositivos disponíveis comercialmente para medir a impedância transepitelial, mas apesar da facilidade de uso e da alta confiabilidade, há também algumas desvantagens como a frequência de saída não traduzível e sua cara.Assim, representamos como construir um volt-ammeter econômico e programável. No início, queremos mostrar como funciona a medição do TEER com dispositivos disponíveis comercialmente. Para isso, tínhamos cultivado uma camada celular de células de papiloma epitelial plexoidecado em filtros Transwell com um tamanho de poros de três micrômetros.Esta configuração foi descrita por Schroten et al. como modelo in vitro da barreira do fluido sangue-cefalorraquidiano. Agora, um eletrodo de pauzinho está conectado a um volt-ammeter epitelial.O dispositivo está ligado e configurado para medir a resistência. O eletrodo é esterilizado em 80% de etanol e, posteriormente, equilibrado em um meio apropriado. A impedância a ser medida servirá como valor de referência para avaliar a confiabilidade do volt-ammeter que será montado posteriormente.Neste exemplo, registramos uma impedância de 680 ohms. Vamos começar com a montagem de um volt-ammeter de baixo orçamento com frequência de saída programável. Em primeiro lugar, você precisará de um carregador USB padrão, e um cabo de extensão USB como fonte de alimentação de corrente direta de cinco volts.Um microcontrolador de 8 bits em uma placa de desenvolvimento USB será usado para gerar uma corrente de onda quadrada. Quatro cabos com plugues de banana estão conectados a dois multimetros padrão para medir tensão e corrente. Certifique-se de que os multimetros são capazes de medir a corrente em uma gama de alguns microamperes com TrueRMS.Um conector RJ14 feminino pode ser encontrado em cabos telefônicos padrão. Apenas certifique-se de que o conector tem seis pinos dos quais pelo menos os quatro internos estão conectados. Finalmente, você precisará de alguns equipamentos padrão, como nossos cabos, um terminal de brilho, um resistor de 120 kiloohm, e algumas ferramentas como strippers de isolamento, uma ferramenta de atrito, ferrules de extremidade de arame e ferro de solda.O dispositivo é montado exatamente como ilustrado no diagrama de layout. A princípio, a extensão USB está conectada ao microcontrolador. Durante a operação normal, ele é alimentado por um carregador USB DC de cinco volts, que pode ser facilmente conectado a um computador pessoal para programação.Dois cabos são despidos e amassados com ferrules de extremidade de arame de um lado. O outro lado é soldado diretamente para o pino zero e dois do microcontrolador ou para os lugs de solda, que por sua vez são cortados nos respectivos pinos. Em seguida, os cabos de entrega de energia estão conectados a um terminal de brilho.O primeiro multímetro será usado para medir a corrente e está conectado em série com 120 resistor de kiloohm e um corte de corte de corte de corrente. Este arranjo garante que a corrente de saída seja limitada, de modo que a medição não terá impacto na viabilidade celular. Os quatro condutores do cabo de extensão telefônica são desmontados e cortados em ferrules como mostrado anteriormente.Uma vez que o cabo esteja preparado, você terá que testar a continuidade dos condutores e pinos. Em nosso exemplo, o pino três a seis está conectado ao condutor branco, marrom, verde e amarelo. Agora, o pino cinco e seis, que é verde e amarelo, estão conectados ao terminal de brilho para aplicar tensão ao par de eletrodos externos.Por fim, você terá que conectar o segundo ultímetro, que será usado para medir a queda de tensão transepithelial, aos pinos três e quatro, ou seja, em nosso exemplo, ao condutor branco e marrom. Decidimos montar a instalação em um chassi de plástico barato. Antes do primeiro uso, o microcontrolador tem que ser programado.O código-fonte está escrito em C+e pode ser carregado por um USB. Em resumo, pino zero em um modo de saída central. Quando ligado, o loop de função começará a alternar como pinos entre o solo e mais cinco volts com um atraso variável.Em nosso exemplo, usamos um tempo teórico de meia oscilação de 40 milissegundos. Vamos ver como os resultados da medição se comparam aos valores de referência que tínhamos obtido antes. O eletrodo de pauzinho é reposicionado para o recém-montado volt-ammeter.O dispositivo está sendo ligado em três passos. Ou seja, conectar um carregador USB, alternar o mímmetro esquerdo para a medição de tensão CA e mudar o segundo mímetro para microampere. Preste atenção, essa corrente alternada tem que ser selecionada explicitamente.Neste exemplo, a queda potencial no sistema de filtros Transwell é medida como aproximadamente 25 milvolts, enquanto registramos uma corrente de 37,1 microamperes. De acordo com a Lei de Ohm, a impedância elétrica pode ser facilmente calculada em 674 ohms, o que é muito próximo do valor de referência de 680. Mostramos que os valores de medição são confiáveis em uma faixa de zero a 1,8 kiloohms.Assim, o volt-ammeter descrito pode ser usado tanto para experimentos iniciais quanto para estudos posteriores. No entanto, se seus resultados forem publicados, você pode sempre querer apoiar seus dados, medindo o fluxo de moléculas através da respectiva camada celular.

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