Name: Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a medir massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria de fluxo. Este método permite analisar populações raras e avaliar a funcionalidade celular.

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Agradecemos ao Unil Flow Cytometry Core Facility pelo seu apoio, especialmente o Dr. Romain Bedel. Este trabalho foi apoiado pela concessão da fundação Kristian Gerhard Jebsen para n.v e o.n.

Todos os experimentos descritos no manuscrito seguem as diretrizes de nossa instituição e foram realizados de acordo com a lei suíça para experimentação animal (Autorização: VD3194) e para pesquisas envolvendo amostras humanas (Protocolo: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Extração hematopoiética de células-tronco
<ol><li>Compre ratos C57BL6/J do tipo selvagem e mantenha-os na casa animal no mínimo uma semana para reduzir o esforço transporte-associado.</li>
	<li>No dia do experimento, eutanásia o mouse usando asfixia CO2.</li>
	<li>Pulverizar o rato com 70% de etanol para esterilizar a pele e abrir o rato na barriga usando ferramentas cirúrgicas padrão, como tesouras de dissecação e fórceps, para cortar os ossos do fêmur e tíbia das pernas traseiras.</li>
	<li>Retire os músculos ligados ao fêmur, tíbia e a pélvis usando uma toalha de papel macia e coloque os ossos limpos em um tubo de 50 mL contendo PBS com 1 mM EDTA (buffer) no gelo.</li>
	<li>Pulverizar um almofariz e pilão com 70% de etanol e colocá-lo em um capuz de cultura celular. Esterilizá-lo com UV por 30 minutos. Pós esterilização enxaguar a argamassa e pilão com tampão para remover vestígios de etanol.</li>
	<li>Coloque os ossos limpos com algum buffer (~ 10 mL) na argamassa e esmagá-los suavemente para obter a medula óssea para fora em suspensão. Agora, recolher a suspensão celular e passá-lo através de um filtro de célula de 70 μm em um tubo de 50 mL para obter uma única suspensão celular.</li>
	<li>Repita o passo 1.6 até que toda a medula óssea tenha sido extraída e os detritos ósseos fiquem brancos.</li>
	<li>Coloque o tubo de 50 mL (s) contendo a suspensão de célula única medula óssea em uma centrífuga. Executar a centrífuga a 300 x g por 10 min a 4 °C para pelotas das células.</li>
	<li>Enquanto isso, prepare 10 mL de 1x RBC lysis buffer em água destilada autocllavada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Recolher o tubo de amostra da centrífuga e decantar o supernatant. Pipeta o tampão de lyse 1x RBC(Tabela de Materiais)na pelota celular. Desalojar a pelota e preparar uma solução homogênea por pipetting cima e para baixo algumas vezes. Permita que o tubo esteja à temperatura ambiente por 1-2 min para a lyse RBC ocorrer. Pare o processo de lyse enchendo o tubo com o buffer.</li>
	<li>Coloque o tubo em uma centrífuga e gire a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota adicionando 10 mL de buffer e filtre a solução em um novo tubo de 50 mL através de um filtro de célula de 70 μm para remover os detritos devido à lyse RBC.</li>
	<li>Centrífuga do tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 500 μL de buffer.</li>
	<li>Retire um alíquot de 100 μL e mantenha-se em um tubo separado de 1,5 mL. Adicione 50 μL de coquetel de anticorpos de esgotamento da linhagem de biotina do kit de enriquecimento progenitor(Mesa de Materiais)aos 450 μL restantes de suspensão celular. Incubar a 4 °C em uma coqueteleira por 15 min.</li>
	<li>Adicione 15 mL de buffer e centrífuga o tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 460 μL de buffer. Retire um alíquot de 10 μL e mantenha-se em um tubo separado de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione 50 μL de contas magnéticas de streptavidin do kit de enriquecimento de progenitor(Tabela de Materiais),à suspensão celular restante de 450 μL. Incubar a 4 °C em uma coqueteleira por 15 min.</li>
	<li>Adicione 15 mL de buffer e centrífuga o tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C. Recolher o tubo da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 5 mL de buffer e transfira a solução para um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Leve o tubo para um separador de células automatizado(Tabela de Materiais). Executar um programa de lavagem para enxaguar e preparar a tubulação do separador celular. Coloque a amostra e dois tubos de coleta no suporte do tubo. Realizar a separação usando o programa"Esgotar". Colete as frações positivas e negativas do separador de células automatizado uma vez que a corrida tenha terminado. Nota: Na ausência de um separador automático de células, os usuários podem usar colunas magnéticas manuais e ímãs correspondentes, de acordo com o manual do usuário. Os usuários devem ter em mente que o processo de separação manual é mais lento do que o automatizado. Além disso, as colunas manuais são mais propensas a entupimento. Portanto, os usuários são aconselhados a diluir a amostra e carregar na coluna lentamente.</li>
	<li>Descarte a fração positiva. Encha o tubo de fração negativa com tampão. Centrífuga do tubo a 300 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Enquanto isso, prepare a mistura de anticorpos em 1 mL de solução de volume final e os controles de cor única em 200 μL de solução de volume final, conforme descrito na Tabela de Materiais e tabela 1. Nota: Se o TMRM e a mancha mitocondrial fluorescente verde devem ser combinados com a coloração do marcador da pilha de haste, substitua então CD150-PE com CD150-PEcy5 e vermelho de Streptavidin-Tx com laranja de Streptavidin-Pac.</li>
	<li>Recolher o tubo de amostra da centrífuga e decantar o supernatant. Resuspenda a pelota em 1 mL de mistura de anticorpos. Adicione 10 μL de células (a partir do passo 1.13) em cada um dos tubos de controle de cor única (exceto linhagem). Adicione 10 μL de células (a partir do passo 1.14) no tubo de cor única linhagem.</li>
	<li>Incubar a amostra e tubos de controle de cor única a 4 °C em uma coqueteleira por 45 minutos. Cubra o balde de gelo com uma tampa ou folha de alumínio.</li>
	<li>Encha todos os tubos com tampão e centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatant e resuspenda a amostra em 1 mL de controles de buffer e de cor única em 200 μL de buffer.</li>
	<li>Transfira a amostra e os controles de cor única para tubos FACS topos do filtro 5 mL.</li>
	<li>Leve os tubos para a máquina de classificação e classificar a população HSC (estratégia gating na Figura 1A)em tubos de 1,5 mL contendo 400 μL de meio de expansão de células-tronco.</li>
</ol>2. Ex Vivo Cultura de Células-Tronco Hematopoiéticas
<ol><li>Coletar tubos contendo células classificadas (ver seção 1 para extração celular). Centrífuga s os tubos a 300 x g por 5 min a 4 °C. Remova delicadamente a maioria do supernatant sem desalojar a pelota e deixe 50-80 μL sobre a pelota da pilha. Isso minimiza a perda celular.</li>
	<li>Resuspende a pelota celular na expansão de células-tronco média a um volume final dependente do número de condições a serem testadas (contagem de 100 μL por poço/condição de cultura).</li>
	<li>Prepare um meio de cultura 2x contendo fator de expansão de células-tronco, fator de células-tronco (200 ng/mL), ligand FLT3 (4 ng/mL) e antibióticos de pen-strep (1%) (2x médio basal; Tabela de Materiais).</li>
	<li>Pegue uma cultura de tecido estéril tratado 96 U-bottom placa bem(Tabela de Materiais)e identificar os poços onde as células serão cultivadas (design da placa na Figura 1B). Nota: Os usuários são aconselhados a evitar poços marginais, pois são mais suscetíveis à evaporação.</li>
	<li>Coloque 100 μL de 2x médio basal previamente preparado na etapa 2.3 nestes poços. Na NR marcada bem adicionar 2 μL de uma solução 100x NR(Tabela de Materiais). Reabastecer NR a cada 24 h. Nota: O reabastecimento é específico para a NR. Outros moduladores metabólicos podem ou não precisar de reposição.</li>
	<li>Semente 100 μL das pilhas preparadas na etapa 2.2 sobre os poços que contêm o meio basal de 2x. Neste experimento, o número de HSCs semeados por poço estava entre 800-1.000 células.</li>
	<li>Prepare cinco poços extras contendo 2x médio basal. Em cada uma delas adiciona 100.000 células inteiras de medula óssea (do passo 1.13) resuspendidas em 100 μL de meio de expansão de células-tronco para serem usadas como controles de coloração para análise de citometria pós-cultura. Nota: Se os usuários quiserem combinar marcadores de células-tronco e marcadores mitocondriais para análise pós-cultura, recomenda-se, adicionalmente, classificar a população de progenitores (células Ckit+ ou células LKSCD150). Semente estes progenitores classificados nos poços de controle de coloração para análise de citometria pós-cultura. Prepare um poço por única cor de mancha.</li>
	<li>Coloque 200 μL de água autocllavada em todos os poços circundantes para reduzir a evaporação de poços contendo células. Deixe a placa intacta em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2 para a duração do período de cultura (72 h). Retire a placa para reabastecer NR a cada 24 h e colocá-lo de volta na incubadora.</li>
</ol>3. Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana
<ol><li>Ao final do período cultural, prepare uma solução 100x de TMRM (20 μM) e Mitotracker verde (10 μM) (mancha fluorescente verde) no meio de expansão de células-tronco(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adicione 2 μL da solução TMRM 100x e 2 μL de 100x solução de mancha fluorescente verde em cada um dos poços de teste. Adicione 2 μL de 100x TMRM no poço de controle TMRM. Adicione 2 μL de 100x mancha fluorescente verde no controle Mitotracker bem. Coloque a placa de volta em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2 para 45 min. Cubra a parte superior da placa com papel alumínio. Nota: Um controle adicional com Verapamil (inibidor da bomba ABC) pode ser preparado se a bomba ABC mediado dintileflux tineflux precisa ser testado. Para isso, adicione 50 μM Verapamil em um dos poços de teste 1 h antes de colorir para TMRM e mancha fluorescente verde.</li>
	<li>Retire a placa da incubadora e centrífuga-lo a 300 x g por 5 min. Invert a placa para remover o supernatant. Adicione 200 μL de buffer FACS padrão (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), centrífuga a placa em 300 x g por 5 min. Retire o supernatant. Repita este passo de lavagem 3x. Os usuários devem garantir que a placa seja sempre coberta com papel alumínio, para fornecer exposição mínima à luz direta. Nota: Se os usuários precisarem combinar a coloração mitocondrial com coloração de células-tronco, a amostra precisará ser incubada com uma mistura de anticorpos de todos os marcadores de células-tronco e os controles de cor única precisarão ser manchados com anticorpos individuais separadamente a 4 °C por 30-45 min. Nota: Em todas as etapas os usuários devem manter a placa coberta com folha de alumínio. Os usuários devem notar que esta etapa de coloração adicional e etapas de lavagem subsequentes podem resultar em perda adicional de células.</li>
	<li>Resuspenda as células em 200 μL de buffer FACS e transfira para tubos FACS.</li>
	<li>Executar as amostras no citometro de fluxo (ver Figura 1). Os tubos de cor simples que contêm WBM incluem: (1) Unstained; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) mancha fluorescente verde (FITC); (5) Mancha total (PE e FITC).</li>
	<li>Primeiro adquirir os controles de cor única para configurar a máquina. Use o software de execução na máquina para calcular a compensação. Uma vez aplicada uma compensação, adquirir a amostra HSC e registrar tantos eventos quanto possível. Nota: Se as células-tronco e marcadores mitocondriais são combinados, os usuários precisam ser particularmente cuidadosos com a compensação entre TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) e Sca-1 (APC). Além disso, as amostras devem ser executadas imediatamente após a coloração.</li>
	<li>Exportar os arquivos FACS do citometro e analisar os dados em um software de análise(Tabela de Materiais).<ol>
<li>Para a análise, abra o arquivo sobre o software de análise. Usando FSC-A e SSC-A gating identificar a população celular. Identifique as anotações nos portões ao lado antes de traçar a fração negativa da DAPI (células vivas). No portão celular ao vivo fazer um lote de contorno no TMRM e canal mancha fluorescente verde para medir Δ 'm e massa, respectivamente (Figura 2A). Exportar a intensidade média da fluorescência (MFI) destes dois canais na porta viva da pilha.</li>
		<li>A porta baixa de TMRM é ajustada baseada na população do ombro na canaleta de TMRM. O controle de cor única TMRM pode ser usado para identificar essa população de ombro para definir o portão. Exportar a proporção de células vivas no portão baixo TMRM em seu controle e amostras de teste para conspirar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li>
<li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li>
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<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li>
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<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405(2019).</li>
<li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+a+retrospective+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li>
<li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li>
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<li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li>
<li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
<li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li>
<li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8%2B+T+cell+memory+and+antitumor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li>
</ol>

Alguns elementos deste trabalho foram apresentados como pedido P1828EP00 ao Instituto Europeu de Patentes.

Uma regulamentação rigorosa da função do HSC é importante para manter a hematopoiese estável durante a vida de um organismo. Como vários outros tipos de células no corpo, um componente-chave que contribui para a regulação da função HSC é o metabolismo celular. Estudos anteriores do nosso laboratório9 e outros2,3 implicaram a importância das mitocôndrias na manutenção de um estado metabólico distinto em HSCs. Devido ao número extremamente b...

As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são uma pequena população de células que residem na medula óssea, garantindo a produção sanguínea e a homeostase ao longo da vida útil de um organismo. HSCs mediar este processo, dando origem a progenitores que, por sua vez, produzem linhagens de células sanguíneas maduras diferenciadas terminalmente através de várias rodadas de divisão celular e passos de diferenciação bem orquestrada1. É importante ressaltar que os HSCs produzem sua energia através da glicolíse anaeróbica. Em contraste, progenitores hematopoiéticos mais comprometidos e ativos mudam seu metabolismo para o metabolismo mitocondrial2,3,4. Acredita-se que este estado metabólico distinto proteja os HSCs de danos celulares infligidos por espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas por mitocôndrias ativas, mantendo assim sua função in vivo de longo prazo5,6,7,8. A medição direta do estado metabólico do HSC é desafiadora e muitas vezes baixa taxa de rendimento devido aos seus números limitados. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em citometria de fluxo para a medição robusta do potencial da membrana mitocondrial (Δ Já demonstramos anteriormente que o baixo Δém é um marcador funcional de boa-fé de HSCs altamente purificados9 e moduladores metabólicos capazes de reduzir a função de MSCs9,10. Aqui propomos o uso de nosso método no perfil mitocondrial de HSCs como estratégia para identificar novas moléculas capazes de melhorar o potencial de reconstituição do sangue a longo prazo dos HSCs.
Como exemplo, demonstramos que este ensaio mede de forma confiável a redução do HSC Δm após a exposição à vitamina B3 analógico nicotinamida ribosía (NR). Assim, em nosso estudo recentemente publicado, demonstramos que a NR melhora fortemente o pós-transplante de recuperação do sangue em ambos os sistemas de camundongos de camundongos e de camundongos humanizados, melhorando diretamente o tronco hematopoiético e as funções progenitoras10. A capacidade de tais moduladores metabólicos é de grande valor clínico, considerando que uma taxa de mortalidade de 25% está ligada ao atraso no sangue e recuperação imunológica em pacientes pós-transplantados11,12.
Além disso, fornecemos evidências de que essa metodologia pode ser aplicada para a caracterização do perfil metabólico e função das células T humanas. Nos últimos anos, o desenvolvimento da terapia celular adotiva (ACT) usando tumor autólogo infiltrando linfócitos (TILs) tornou-se a abordagem mais eficaz para certos tipos de câncer avançado com prognóstico extremamente desfavorável (por exemplo, melanoma metastático, onde >50% dos pacientes respondem ao tratamento e até 24% dos pacientes têm regressão completa)13. No entanto, TILs que abrigam atividade antitumoral suficiente são difíceis de gerar14. A proliferação extensa e estimulação que as TILs sofrem durante a expansão ex vivo causam exaustão e senescência das células T que prejudicam drasticamente a resposta antitumoral de células T15. Importante, a capacidade antitumoral dos TILs é lig firmemente a seu metabolismo16,17 e as aproximações visadas modular o metabolismo com a inibição do caminho de PI3K/Akt produziram resultados encorajadores18,19. Por esta razão, comparamos o Δ, de células T derivadas de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) e TILs de operários do paciente, e mostramos que as células T derivadas de PBMC menos diferenciadas têm menor massa de δe e mitocondrial em comparação com TILs terminalmente diferenciadas.
Nós imaginamos que este ensaio pode ser usado para identificar os moduladores metabólicos novos que melhoram a função da pilha de HSC e de T através da modulação de Δ.

<table><tbody><tr><td>Tubos FACS de 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Preparação de amostras</td></tr><tr><td>Placa inferior em 96-U</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>AutoMACS pro separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>Separação automática de células</td></tr><tr><td>BD FACS AriaIII</td><td>Becton e Dickinson</td><td></td><td>Classificação de células</td></tr><tr><td>BD Kit de enriquecimento de células progenitoras hematopoiéticas de camundongo IMag</td><td>BD</td><td>558451</td><td>Depleção de linhagem</td></tr><tr><td>BD LSRII</td><td>Becton e Dickinson</td><td></td><td>Máquina de aquisição FACS</td></tr><tr><td>BD-DIVA</td><td>Becton e Dickinson</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>de aquisição CD150 PE</td><td>Biolegend</td><td>115904</td><td>Mistura de coloração de anticorpos</td></tr><tr><td>CD150 PE-Cy5</td><td>Biolegend</td><td>115912</td><td>Mistura de coloração de anticorpos</td></tr><tr><td>CD48 PB</td><td>Biolegend</td><td>103418</td><td>Mistura de coloração de anticorpos</td></tr><tr><td>Centrífuga- 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Centrifugação</td></tr><tr><td>Ckit PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>105814</td><td>Mistura de coloração de anticorpos</td></tr><tr><td>Fluxo para</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>FACS Software de análise</td></tr><tr><td>GraphPad-Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Plotagem de dados em gráficos</td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>Coloração mitocondrial verde-fluorescente para medir a massa mitocondrial; concentração de trabalho = 100 nM; concentração de estoque = 1 mM</td></tr><tr><td>Ribosídeo de Nicotinamida (NR)</td> <td>Sintetizado sob medida em casa</td><td></td><td>Modulador metabólico; concentração de trabalho = 500 &micro; M; concentração de estoque = 50 mM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>CHUV</td> 1000324 <td></td><td>Preparação do tampão; concentração de trabalho = 1x; concentração de estoque = 1x</td></tr><tr><td>Pen-Strep (P/S)Tecnologias de</td> <td>vida</td><td>15140122</td><td>cultura Ex vivo; concentração de trabalho = 1x; concentração de estoque = 1x</td></tr><tr><td>tampão de lise de hemácias</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>Lysing Glóbulos vermelhos; concentração de trabalho = 1x; concentração de estoque = 10x</td></tr><tr><td>Ligante Flt-3 de camundongo recombinante (FLT3)</td> <td>RnD</td><td>427-FL-005 / CF</td><td>Cultura ex vivo; concentração de trabalho = 2 ng / mL; concentração de estoque = 10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Fator recombinante da pilha estaminal do rato (SCF)</td> <td>RnD</td><td>455-MC-010/CF</td><td>Cultura ex vivo; concentração de trabalho = 100 ng/mL; concentração conservada em estoque = 50 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>Sca1 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5981-82</td><td>Mistura de coloração de anticorpos</td></tr><tr><td>StemlineII Meio de expansão de células-tronco hematopoiéticas</td><td>SIGMA</td><td>S0192</td><td>Cultura ex vivo</td></tr><tr><td>Estreptavidina Pac laranja</td><td>Life Technologies</td><td>S32365</td><td>Mistura de coloração de anticorpos</td></tr><tr><td>Estreptavidina Tx vermelha</td><td>Life Technologies</td><td>S872</td><td>Mistura</td></tr> <tr><td>de coloração de anticorposTMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>Potencial de coloração da membrana mitocondrial; concentração de trabalho = 200 nM; concentração de estoque = 10 mM</td></tr><tr><td>EDTA ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Preparação do tampão; concentração de trabalho = 0,5 M; concentração de estoque = 1 mM</td></tr></tbody></table>

medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células t por citometria flow

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Um bom equilíbrio de quiescência, auto-renovação e diferenciação é fundamental para preservar a piscina de células-tronco hematopoiéticas (HSC) e manter a produção ao longo da vida de todas as células sanguíneas maduras. Nos últimos anos, o metabolismo celular emergiu como um regulador crucial da função hsc e destino. Nós demonstramos previamente que a modulação do metabolismo mitocondrial influencia o destino de HSC. Especificamente, ao desacoplado quimicamente a cadeia de transporte de elétrons, fomos capazes de manter a função HSC em condições culturais que normalmente induzem a diferenciação rápida. No entanto, limitar os números do HSC muitas vezes impede o uso de ensaios padrão para medir o metabolismo do HSC e, portanto, prever sua função. Aqui, relatamos um ensaio de citometria de fluxo simples que permite a medição confiável do potencial da membrana mitocondrial e massa mitocondrial em células escassas, como HSCs. Discutimos o isolamento de HSCs da medula óssea do rato e a medição da massa mitocondrial e da cultura pós-vivo potencial de membrana. Como exemplo, mostramos a modulação desses parâmetros em HSCs por meio de tratamento com modulador metabólico. Além disso, ampliamos a aplicação dessa metodologia sobre células T derivadas do sangue periférico humano e linfocitos infiltrados de tumores humanos (TILs), mostrando diferenças dramáticas em seus perfis mitocondriais, possivelmente refletindo diferentes células T Funcionalidade. Acreditamos que este ensaio pode ser empregado em exames para identificar moduladores do metabolismo mitocondrial em vários tipos de células em diferentes contextos.

Na Figura 1 mostramos a estratégia de gating para o isolamento das células-tronco hematopoiéticas da medula óssea do rato e o layout da placa para sua cultura ex vivo. A Figura 1A mostra a identificação da fração de linfócitos na trama do SSC-A/FSC-A. Os doublets foram removidos na porta do singlet seguida pela identificação de pilhas vivas pela ausência do sinal de DAPI. A população de LKS, definida pela linhagem- Sca1+cKit+</su...

Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Este protocolo é um simples ensaio baseado em citometria de fluxo que permite a medição do potencial da membrana mitocondrial e da massa mitocondrial em células vivas. Ensaios metabólicos padrão falham quando se trabalha com populações raras, como as células-tronco hematopoiéticas. Este método permite aos usuários traçar perfis de membrana mitocondrial ao trabalhar com baixo número de células e determinar novos moduladores metabólicos de células como os HSCs.Além disso, você pode combiná-lo com ensaios funcionais a jusante, como transplante de medula óssea ou ensaios de formação de colônias para determinar a funcionalidade de suas células pós-cultura. Nossa técnica pode ser explorada para a identificação de novas moléculas capazes de melhorar a função HSC no contexto do transplante de medula óssea e recuperação imunológica hematopoiética após terapias ablativas. Como descrito em nosso protocolo, nosso método pode ser usado para avaliar a aptidão metabólica das células T imunes.É muito importante que as células tenham exposição mínima à luz após a coloração. Além disso, o uso do inibidor da bomba verapamil deve ser incluído para avaliar a contribuição da bomba efflux. No entanto, os usuários devem estar cientes de que verapamil perturba profundamente o equilíbrio iônico e não pode ser usado para avaliar o efeito de um modulador metabólico no potencial da membrana mitocondrial.A demonstração visual deste método é extremamente importante porque existem algumas etapas críticas que é preciso ter em mente ao trabalhar com baixo número de células, e essas etapas são muitas vezes ausentes nos artigos regulares que os usuários lêem no PubMed. Para a classificação FAC, identifica-se a população LKS, definida pela linhagem negativa, Sca1 positiva, cKit positive. Células-tronco hematopoiéticas de cerca de cinco a 10% das células da população de LKS são identificadas por gating para CD150 positivo, população CD48 negativa, rotulada como HSCs.Após a triagem de células-tronco hematopoiéticas, centrifugar os tubos a 300 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova suavemente a maior parte do supernatante sem desalojar a pelota, e deixe de 50 a 80 microliters em cima da pelota celular. Resuspend a pelota celular em meio de expansão de células-tronco para um volume final de 200 microliters.Prepare uma cultura de tecido estéril tratada 96 placas de poço de fundo U, e identifique os poços onde as células serão cultivadas. Transfira 100 microliters de 2x meio basal previamente preparados nestes poços. No NR marcado bem, adicione dois microliters de uma solução riboside de nicotinamida de 100x.Transfira 100 microliters de meio basal 2x em poços para controle de manchas. Semente 100 microliters de células-tronco hematopoiéticas preparadas em cima dos poços contendo meio basal 2x. Sementes 100 microliters de células inteiras de medula óssea em poços marcados como controles de coloração.Adicione 200 microliters de água autoclavada em todos os poços circundantes para reduzir a evaporação de poços que contêm células. Coloque a placa intacta em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Pegue a placa para repor nicotinamida riboside a cada 24 horas, e coloque-a de volta na incubadora.Ao final do período de cultura, adicione dois microliters de solução 100x TMRM e dois microliters de solução de mancha fluorescente verde de 100x em cada um dos poços de teste. Adicione dois microliters de 100x TMRM no controle de coloração TMRM. Adicione dois microliters de 100x mancha fluorescente verde no poço de controle de manchas MitoTracker.Cubra a parte superior da placa com papel alumínio. e coloque a placa de volta em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 45 minutos. Retire a placa da incubadora e centrífugue a 300 vezes g durante cinco minutos.Inverta a placa para remover o supernascer e adicione 200 microliters de buffer FACS padrão para resuspend. Cubra a placa com papel alumínio. Centrifugar a placa a 300 vezes g por cinco minutos.Repita esta etapa de lavagem três vezes. Resuspense as células em 200 microliters de tampão FACS e transfira para tubos FACS. Para executar as amostras no citómetro de fluxo, primeiro carregue os controles de cor única na máquina e grave pelo menos 5.000 eventos em cada um por um.No software, pressione Adquira e, em seguida, grave no painel para adquirir e gravar controles de cores únicas. Pressione a configuração de compensação e clique em Calcular Compensação para calcular a compensação. Uma vez aplicada a compensação, adquira a amostra hematopoiética das células-tronco e registe o maior número possível de eventos.Exporte os arquivos FACS do ítmetro e abra o arquivo no software de análise. No FlowJo, use dispersão para a frente e dispersão lateral para identificar a população celular. Identifique singlets nos portões seguintes e, em seguida, plote a fração negativa da DAPI representando células vivas.No portão de cela ao vivo, faça um gráfico de contorno no TMRM e canal de manchas fluorescentes verdes para medir o potencial e a massa da membrana mitocondrial, respectivamente. Exporte a intensidade média de fluorescência desses dois canais no portão de cela ao vivo. Em seguida, exporte a proporção de células no portão baixo TMRM em todas as amostras.O tratamento de nicotinamida ribosídeo mostrou um claro aumento na baixa população do TMRM. Também aumentou significativamente a proporção de células no portão baixo TMRM e mostrou uma redução significativa da intensidade de fluorescência TMRM. A massa mitocondrial não mudou após a suplementação riboside nicotinamida.Além disso, a coloração do marcador de células-tronco foi combinada com a coloração mitocondrial pós-cultura. Com a estratégia de gating para identificar células-tronco hematopoiéticas, a exposição à nicotinamida riboside mostrou um aumento significativo na baixa população TMRM e uma diminuição significativa na intensidade de fluorescência TMRM em HSCs fechados. O sinal verde da mancha mitocondrial fluorescente permaneceu inalterado nas duas condições.É importante cobrir a placa de coloração com papel alumínio, a fim de minimizar a exposição da luz a amostras manchadas. Este método pode ser combinado com ensaios a jusante, como transplante de medula óssea e ensaios de formação de colônias para determinar a funcionalidade de suas células-tronco. Assim, esta técnica permite um método simples de triagem para a identificação de novos moduladores metabólicos de HSCs.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a marcação de células neuronais com anticorpos para complexos da cadeia respiratória mitocondrial, proteína associada ao DNA mitocondrial e proteína da membrana externa mitocondrial, seguida de citometria de fluxo para quantificar seus níveis.

Medição de Múltiplos Parâmetros Mitocondriais em Neurônios usando Citometria de Fluxo

Aqui descrito é um método para detectar e quantificar as proteínas da membrana exterior mitocondrial por imunomarcação das mitocôndrias isoladas a partir de tecidos de roedores e de análise por citometria de fluxo. Este método pode ser estendido para avaliar os aspectos funcionais de subpopulações mitocondriais.

Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

Aqui, apresentamos um protocolo que usa JC-1 tintura para avaliar o potencial de membrana mitocondrial das células após serem expostos a hipóxia/reoxigenação com ou sem um agente protetor.

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

A adaptação metabólica é fundamental para as células T, pois dita diferenciação, persistência e citotoxicidade. Aqui, é apresentado um protocolo otimizado para monitorar a respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas ex vivo .

Monitoramento em tempo real da respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Os métodos para estudar a bioenergética mitocondrial sob concentrações de substrato fisiologicamente relevantes em células imunes são limitados. Fornecemos um protocolo detalhado que usa fluorespirometria de alta resolução para avaliar as mudanças na resposta do potencial da membrana mitocondrial à demanda de energia em células T humanas, monócitos e células mononucleares periféricas.

Fluorespirometria de alta resolução para avaliar mudanças dinâmicas no potencial da membrana mitocondrial em células imunes humanas

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Aprenda a medir massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria de fluxo. Este método permite analisar populações raras e avaliar a funcionalidade celular.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

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