Preparação de amostras biológicas para especiação em temperatura criogênica usando espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução

Este protocolo foi padronizado para espécimes celulares, permitindo a comparação de experimentos em diferentes locais síncrotrons. A principal vantagem dessa técnica é um fluxo de trabalho simples e simples que permite uma preservação rápida e confiável da integração química da amostra. Indivíduos novos nessa técnica podem lutar com a pelota de células iteradas congeladas e o carregamento rápido da pelota celular na ordem criosample.

Um desvinculação preciso e rápido de uma amostra em temperatura criogênica é crítico. Como tal, uma demonstração visual é essencial para entender como executar a técnica. Para preparar as pelotas de células de células de câncer de próstata e ovário para a especiação de selênio, semeou o número apropriado de células de cada linha celular em três frascos T-75 por condição no meio de cultura celular apropriada em uma capa de fluxo laminar e colocar os frascos em 37 graus Celsius e incubadora de cultura celular de 5% de dióxido de carbono até que as células sejam 80% confluentes.

Para expor as células cancerígenas ao tratamento de selênio, primeiro sonicato soluções de estoque de nanopartículas recém-preparadas em um banho de água de ultrassom por 30 minutos à temperatura ambiente antes de diluir em série a solução de nanopartículas de selênio em meio de cultura celular completa para as concentrações de trabalho apropriadas. Na coifa de fluxo laminar, lave suavemente as células duas vezes com cinco mililitros de 37 graus Celsius PBS por lavagem e use uma pipeta estéril de 25 mililitros para adicionar cuidadosamente 15 mililitros do tratamento de selênio de interesse ao fundo do frasco. Feche as tampas sem selar completamente o frasco e coloque os frascos horizontalmente na incubadora de cultura celular por 24 horas.

Para preparar as pelotas celulares após a lavagem e reposição do meio de cultura, use um raspador de célula por frasco para desprender suavemente as células. Use o meio para lavar todas as células presas ao frasco no sobrenante e coletar as células dissociadas por centrifugação. Lave as pelotas duas vezes em cinco mililitros de PBS por tubo por lavagem para remover todos os vestígios restantes do tratamento e resuspensar as células em um mililitro de PBS.

Transfira as células para um tubo de polipropileno de 1,5 mililitro e colete as células com outra centrifugação. Em seguida, use uma pipeta de 200 microliter para remover suavemente todo o supernatante e mergulhar a parte inferior de cada tubo de 1,5 mililitro em nitrogênio líquido ao nível da pelota celular. Imediatamente após o congelamento, transfira os tubos para uma de guerra de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

Para espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução, otimize todos os cristais do espectrômetro do analisador de cristal em condições de Bragg em relação à energia de interesse da linha de fluorescência e use uma referência para a qual a posição energética da borda de absorção é conhecida por calibrar a energia do feixe monocromático incidente. Transfira o titular da amostra para um criosta de hélio líquido para amostras biológicas e defina o criostat para 10 graus Kelvin, em seguida, feche a cabana experimental seguindo as regras de segurança síncrotron, e comece a análise. Aqui, espectroscopia de espectroscopia de absorção de raios-X representativos de alta resolução do selênio no estado inicial e em células incubadas a meio nutritivo demonstram que o selênio nas nanopartículas iniciais de selênio estava presente tanto como selenium zero quanto celulite.

Após interações com as células PC3, no entanto, o selênio estava presente principalmente nas células como selênio zero, demonstrando uma mudança de espécies de selênio dentro das células. Para o ferro, espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução apresentam posições distintas dependendo do estado de oxidação do ferro, com espécies reduzidas de ferro deslocadas para baixos valores energéticos. Dois espectros sucessivos coletados na mesma posição de uma pelota diatoma foram semelhantes, indicando que o dano do feixe foi limitado entre duas aquisições ao usar um criosta de hélio em 10 Kelvin.

Além disso, espectros de diferentes posições da pelota diatom eram idênticos, demonstrando que a pelota amostral era homogênea e que os espectros poderiam ser mediados para obter um espectro melhor de relação sinal-ruído. Os passos mais críticos são a preparação da diltuição de nanopartículas, a dotização à temperatura criogênica e a preparação das amostras de referência padrão. Este procedimento pode ser aplicado a outras técnicas analíticas em massa, como ICP-MS ou HPLC-ICP-MS ou outras técnicas espectroscópicas não síncrotrons capazes de serem realizadas de forma criogênica.

Outras questões científicas podem ser exploradas utilizando esse procedimento, particularmente nos campos da biogeologia, da bioquímica, das ciências ambientais ou da pesquisa toxicológica. Compostos de selênio e nanopartículas de selênio podem ser tão árduos para sua saúde e devem ser manipulados em um capuz químico dedicado usando luvas, óculos e uma máscara facial.