Name: Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade utilizando neurônios derivados de células progenitoras neurais humanas. Este método oferece alta relevância fisiológica para triagem de fármacos.

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Esta pesquisa foi financiada pela nimad research grant (940714) concedida à MAF.

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<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li>
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Todos os autores não indicam potenciais conflitos de interesse.

Este protocolo é um dos poucos artigos publicados que descrevem o teste para o comprimento de neurite após o tratamento com compostos de teste. Além disso, descrevemos como usar hNPCs para um ensaio de crescimento de neurito e avaliação da neurotoxicidade. Utilizando este ensaio de crescimento neurite e avaliação neurotoxicidade em neurônios derivados de hNPCs, o potencial neurogênico de uma categoria de compostos epigenéticos de pequenas moléculas, inibidores de HDAC, na indução do crescimento de neurite é demonstrado<s...

O crescimento da neurita é um processo fundamental para a formação da rede neuronal e da regeneração nervosa1,2. Após uma lesão, o crescimento de neurite desempenha um papel fundamental na regeneração do sistema nervoso. O crescimento da neurita também é um elemento importante da sinalização extracelular na indução de atividades regenerativas neuronais para melhorar os desfechos para distúrbios neurodegenerativos e lesões neuronais3,,4,,5,6.
Mantendo seu potencial de diferenciação na produção de várias linhagens neurais, as células progenitoras neurais humanas (hNPCs) poderiam fornecer um sistema modelo para estudos da função e desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC)7,,8,,9. Alto potencial translacional e relevância fisiológica dos hNPCs como modelo primário de células humanas oferecem uma vantagem considerável nos exames de descoberta de drogas relacionados ao crescimento de neurite. No entanto, a manutenção e o dimensionamento dos modelos de células primárias para ensaios de alto rendimento podem ser demorados e intensivos em mão-de-obra10,11,,12,13.
Além da aplicação do método apresentado em estudos de crescimento de neurite, a avaliação da neurotoxicidade é outra aplicação utilizando os neurônios derivados do hNPC. Existem milhares de compostos químicos comerciais que não são examinados ou com potencial de neurotoxicidade mal compreendido. Portanto, experimentos de triagem mais confiáveis e eficazes para avaliar, distinguir e classificar compostos com base em seu potencial para obter neurotoxicidade do desenvolvimento está em alta demanda14. O aumento da prevalência e incidência de distúrbios neurológicos, juntamente com a abundância de compostos não testados no ambiente, requer o desenvolvimento de experimentos mais confiáveis e eficientes para identificar compostos ambientais perigosos que possam representar neurotoxicidade15.
O método aqui apresentado pode ser utilizado para testar a capacidade dos compostos de induzir o crescimento e neurotoxicidade neurita, aproveitando-se dos neurônios derivados de células progenitoras neurais humanas, um modelo celular que representa de perto a biologia humana.

<table><tbody><tr><td>Corrediças de Câmara de Vidro de 4 poços</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta;-Tubulina III</td><td>Thermo</td><td>MA1-118X</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td></td><td></td>17504001</tr><tr><td>B27 - menos vitamina A</td><td>Thermo</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning</td><td>432000</td><td>Recipientes de congelamento de células garantindo taxa controlada padronizada -1&#176; Congelamento de células C / minuto em um -80 &# 176; C freezer</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td>Meio de criopreservação contendo 10% DMSO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG6015</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Thermo</td><td>FB002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanil-L-glutamina suplemento Soro</td></tr> de <tr><td>cabra</td><td>Thermo</td><td>50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Calbiochem</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A92902-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos não essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5854</td><td>Meio de criopreservação sem soro projetado para a criopreservação de células-tronco pluripotentes embrionárias humanas e induzidas</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Médio</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-Well Poliestireno Branco Microplacas</td><td>Thermo</td><td>164610</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Retinóico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Reagente de dissociação celular contendo enzimas proteolíticas e colagenolíticas</td></tr><tr><td>Sinaptofisina</td><td>Thermo</td><td>MA5-14532</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

O ensaio de crescimento de neurita e a avaliação da neurotoxicidade são dois estudos importantes que podem ser realizados utilizando o método aqui apresentado. Este protocolo fornece uma análise confiável da morfologia neuronal juntamente com medições quantitativas de modificações no comprimento do neurite e localização de proteína sináptica e abundância após o tratamento com pequenos compostos de moléculas. Além da aplicação do método apresentado em estudos de crescimento de neurite, a avaliação da neurotoxicidade pode ser realizada para avaliar, distinguir e classificar compostos químicos comerciais com base em seu potencial efeito neurotoxicidade no desenvolvimento.
Embora as linhas celulares sejam hoje amplamente utilizadas em ensaios de triagem composta em neurociência, elas geralmente diferem geneticamente e fenotipicamente de sua origem tecidual. As células primárias, por outro lado, mantêm marcadores e funções importantes observados in vivo. Portanto, devido ao potencial de tradução e relevância fisiológica que essas células poderiam oferecer ensaio de crescimento neurite e avaliação da neurotoxicidade pode beneficiar consideravelmente do uso de células progenitoras neurais humanas (hNPCs) como o modelo primário de células humanas.
O método aqui apresentado pode ser utilizado para testar a capacidade dos compostos de induzir o crescimento e neurotoxicidade neurita, aproveitando-se dos neurônios derivados de células progenitoras neurais, um modelo celular que representa de perto a biologia humana."

O protocolo apresentado no manuscrito foi utilizado com sucesso em dois artigos publicados recentemente22,23. A Figura 3 demonstra o uso de neurônios derivados de hNPCs na análise do efeito dos inibidores de HDAC como compostos epigenéticos na extensão dos neurites como um marcador para o crescimento de neurite e subsequente capacidade neurogênica de compostos de pequenas moléculas.
Além disso, na <strong ...

O protocolo apresentado descreve um método para um ensaio de crescimento de neurite e avaliação neurotoxicidade de compostos de moléculas pequenas.

Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

O protocolo apresentado descrevendo o ensaio de crescimento de neurite que é altamente relevante para a biologia humana e a avaliação neurotoxicidade de um pequeno composto de moléculas. Alto potencial translacional e relevância fisiológica das células progenitoras neurais humanas como modelo primário de células humanas oferecem uma vantagem considerável na triagem de descoberta de drogas relacionada ao crescimento de neurite e avaliação da neurotoxicidade. Utilizando o protocolo apresentado, células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem e neurônios derivados de células-tronco embrionárias humanas também podem ser usados como fontes celulares alternativas para o ensaio de crescimento de neurite e avaliação da neurotoxicidade.Comece coletando a mídia com neuroesferas flutuantes e transferindo-a para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o tubo a 300 a 400 vezes g por três minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o supernaspe.e resuspensar as esferas em 500 microlitros de reagente de dissociação celular descongelada. Incubar as esferas a 37 graus Celsius por cinco a 15 minutos. Em seguida, adicione cinco a 10 mililitros de mídia de cultura pré-aquecida e centrifugar o tu

a-neurite-outgrowth-assay-neurotoxicity-assessment-with-human-neural

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este artigo descreve um protocolo de romance e de reagente conjunto projetado para a medição sensível de efeitos neurotóxicos de compostos e tratamentos em co-culturas de neurônios e astrócitos usando análise de conteúdo de alta. Resultados demonstram que a análise de conteúdo de alta tecnologia representa um romance empolgante para a avaliação de neurotoxicidade.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Este protocolo de vídeo demonstra um novo método para a geração e subsequente purificação de células progenitoras neuronais a partir de uma fonte renovável de células estaminais neurais (NSCs) com base na sua (granulosidade tamanho e interno) física e propriedades fluorescentes usando tecnologia de citometria de fluxo.

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Este vídeo demonstra o ensaio de migração da neuroesfera de células precursoras neurais - um ensaio in vitro para estudar a resposta migratória de células precursoras neurais da neuroesfera - por meio de análise microscópica.

Ensaio de Neuroesfera NPC: Um Ensaio In Vitro para Avaliar a Resposta Migratória de Células Precursoras Neurais da Neuroesfera

Neste vídeo, descrevemos um método baseado em luminescência para avaliar a neurotoxicidade de compostos de pequenas moléculas promotores de crescimento de neuritos na viabilidade de neurônios derivados de hNPC. O ensaio mede o nível de ATP intracelular, um indicador da viabilidade celular, para avaliar a neurotoxicidade após o tratamento com o composto de teste.

Ensaio baseado em luminescência para avaliar a neurotoxicidade de compostos de teste em neurônios

Com a intenção de caracterizar mudanças em miRNAs em células-tronco neurais humanas diferenciadas (hNSCs), descrevemos a diferenciação de hNSC em um sistema tridimensional, a avaliação de mudanças na expressão de microRNAs por matriz de PCR de miRNA e análise computacional para predição de alvos de miRNAs e sua validação por ensaio de luciferase dupla.

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

É fundamental em neurobiologia e neurovirologia ter um sistema in vitro confiável e replicável que sirva como um modelo translacional para o que ocorre in vivo em neurônios humanos. Este protocolo descreve como cultivar e diferenciar células de neuroblastoma humano SH-SY5Y em neurônios viáveis para uso em aplicações in vitro.

A diferenciação da linha celular SH-SY5Y humanas de neuroblastoma

As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) são consideradas uma ferramenta poderosa para a triagem de drogas e substâncias químicas e para o desenvolvimento de novos modelos in vitro para testes de toxicidade, incluindo neurotoxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a diferenciação de hiPSCs em neurônios e glia é descrito.

Protocolo para a Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Culturas Mistas de Neurônios e Glia para Teste de Neurotoxicidade

Desenvolvimento neurológico processos tais como consequência natural do axônio, migração e proliferação são frequentemente perturbadas em doenças neuropsiquiátricas. Assim, apresentamos protocolos para rapidamente e reproducibly avaliar estes processos de desenvolvimento neurológico em NPCs de iPSC-derivado humanos. Estes protocolos permitem também a avaliação dos efeitos da terapêutica e fatores de crescimento relevantes no desenvolvimento do NPC.

Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para ressusciar e cultivar os neurônios derivados humanos da pilha de haste que foram diferenciados previamente dos progenitores neural in vitro por semanas múltiplas. O procedimento facilita os ensaios com base em imagens de neuritos, sinapses e marcadores neuronais de expressão tardia em um formato compatível com microscopia de luz e triagem de alto conteúdo.

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo simples para estudar o conseqüência do neurite em neurônios corticais do rato embrionário cotransfecting com EGFP e a proteína do interesse.

Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários

Aprenda a realizar ensaios de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade utilizando neurônios derivados de células progenitoras neurais humanas. Este método oferece alta relevância fisiológica para triagem de fármacos.

Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

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