Isolando Myofibrils de Biópsias musculares esqueléticas e determinando função contractile com um transdutor de força de resolução nano-Newton

Avaliar as propriedades contratuais de miofibrils isolados do músculo estriado pode ser usado para determinar se a disfunção do sarcomere é a principal causa de fraqueza muscular devido a mutações em proteínas sarcomeric. Esta técnica pode ser usada para adquirir dados com uma relação sinal-ruído muito alta com resolução de nanonewton. Este protocolo também é adequado para medir a contrativismo em cardiomiócitos permeabilizados.

Tenha em mente que o transdutor de força é muito frágil. Então, ao remover a cola da agulha de montagem ou ao colar um myofibril, você precisa ter uma mão firme, muita prática, e muita paciência. Antes de montar o tecido, coloque uma haste homogeneizadora no tubo contendo o tecido muscular.

Mantendo o tubo no gelo, gire o rotor por 15 segundos na velocidade cinco. Ao final da homogeneização, transfira 50 microliters da suspensão myofibril resultante e 250 microliters de solução relaxante para um slide revestido de poli-HEMA em um banho de tecido. Cubra o banho com uma tampa para proteger a mistura do pó e espere de 5 a 10 minutos para permitir que os myofibrils afundem até o fundo da gota.

Durante o naufrágio dos myofibrils, aqueça Shellac uma cola de etanol a 65 graus Celsius por 30 a 60 segundos antes de adicionar cerca de seis microliters de cola em um escorregador de vidro não revestido. Mergulhe repetidamente a ponta de cada agulha de montagem na cola até que uma camada de cola seja visível. Em seguida, use micro-manipuladores para mover a sonda e piezo verticalmente para abrir espaço para o banho de tecido no estágio do microscópio e remover a lâmina de vidro contendo a cola.

Depois de montar os myofibrils, para medir o comprimento do sarcomere, mova o piezo e/ou a sonda de força para definir o comprimento inicial de sarcomere do myofibril para 2,5 micrômetros. Usando a função do vaso do software do controlador do sistema, meça o comprimento e largura do myofibril. Use o estágio do microscópio para posicionar o myofibril no centro da imagem de vídeo e esticar um retângulo de um lado do myofibril para o outro, tomando o cuidado de incluir a borda escura das gotículas de cola.

Para começar a gravar os dados, clique em iniciar. Após cinco segundos, clique em pausa. O comprimento terá sido gravado.

Para medir a largura, gire a câmera 90 graus para ver o contraste da borda do próprio myofibril. Ajuste o retângulo e clique em iniciar a gravação dos dados. Após cinco segundos, clique em pausa.

A largura terá sido registrada. Para posicionar o vidro, use a ocular e o manipulador para mover cuidadosamente o vidro em direção ao myofibril. Alinhe o canal superior do vidro com o myofibril e realize um passo rápido para verificar a posição.

Ligue o fluxo relaxante de fundo para verificar o alinhamento do vidro theta e use uma alavanca de válvula Luer para ligar a entrada da câmara de fluxo. Em seguida, para começar a drenar a câmara de fluxo e evitar o transbordamento da câmara de fluxo, ajuste a válvula de bomba de saída para a válvula de banho dois, o modo micro passo para micro, o alvo do êmbolo para 48.000, e a velocidade do êmbolo para 38 a 40. Para medir a taxa de reurbanização da tensão, calcule o movimento piezo necessário para afrouxar o myofibril em 15% e inserir esse valor no gerador de sinal.

Clique em retomar para continuar registrando os dados e abrir válvulas um e seis para iniciar os fluxos da solução relaxante e as diferentes concentrações de cálcio através do vidro, respectivamente. Selecione o intervalo de reset no interferômetro para redefinir o intervalo do interferômetro para que a força da linha de base seja zero volts. Quando o traço de força estiver estável, realize o vidro passo rápido com um tamanho de passo de 100 micrômetros.

Quando o planalto de força for atingido, realize o encurtamento reesticuante com o piezo. Um traço de relaxamento de ativação será gravado. Clique em pausa.

Para executar um trecho em forma de passo, clique em iniciar e redefinir o alcance do interferômetro para que a força da linha de base seja zero volts. Realize um trecho em passo com o gerador de sinal. Quando o trecho estiver pronto, use o piezo para encurtar o miofibril ao comprimento da folga.

Em seguida, pressione pausar e parar e salvar os dados. Aqui, traços de força de um experimento de força ativa com um myofibril isolado de músculos do quadríceps humanos saudáveis são mostrados. O myofibril foi ativado cinco vezes com soluções com concentrações variadas de cálcio, com uma força máxima média de todos os myofibrils de aproximadamente 123 mililitros por milímetro quadrado.

A construção de uma curva de concentração de cálcio de força das forças do planalto alcançada durante cada ativação em cada uma das cinco curvas de cálcio permite o cálculo da concentração de cálcio em 50% da produção de força máxima. Como ilustrado nesta análise representativa, os myofibrils podem ser tratados com múltiplos compostos em um único experimento para responder a perguntas adicionais sobre o tipo myofibril. A força ativa e o comprimento do sarcomere também podem ser medidos para permitir o cálculo das taxas de redesenvolvimento, ativação e relaxamento.

A subida acentuada mostrada na caixa vermelha pontilhada é causada tanto pela viscosidade quanto pela elasticidade. O planalto se assemelha apenas ao componente elástico. Como a viscosidade resiste à tensão linearmente, a força caiu depois que a cepa foi removida.

Ao posicionar o vidro, certifique-se de alinhá-lo corretamente com o miofibril. Caso contrário, a solução de ativação pode vir entre a fibra óptica e o cantilever da sonda de força e isso faz com que artefatos ocorram em seus dados. Além disso, o myofibril pode não ser ativado corretamente.

Este método de perfusão também é adequado para determinar o tipo de fibra muscular do miofibril. Por exemplo, você pode primeiro perfumar o myofibril com uma solução normal de cálcio seguida de perfusão dessa mesma solução, mas depois adicionar um composto específico de aumento de força do tipo fibra muscular.