Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

Olá, sou Mike Dustin do Instituto Geral e da Escola de Medicina da Universidade de Nova York. Hoje, vou guiá-lo pelo procedimento de formação de bicamadas planares suportadas para o estudo da sinapse imunológica. Então, vamos começar.

Para formar a bicamada lipídica, preparamos uma solução contendo 20% de lipídio quelante de níquel e 80% de fosfatidilcolina em quantidades apropriadas em um tubo de vidro com um a dois mililitros de clorofórmio-metanol. O primeiro passo é evaporar o solvente sob um fluxo de gás nitrogênio em um banho-maria aquecido a 30 a 37 graus Celsius. Isso geralmente leva cerca de 15 minutos.

Em seguida, remova qualquer solvente remanescente sob vácuo elevado utilizando um liofilizador por 90 minutos. Depois, dissolva os lipídios em tampão salino com detergente octil glucosídeo 2% N para obter uma concentração final de 0,4 milimolar. Isso cria uma solução de micelas mistas de detergente e fosfolipídios para formar lipossomos.

Você realiza a diálise desta solução contra três mudanças de solução salina de tris para remover o detergente e formar lipossomos. Normalmente trabalhamos com volumes da ordem de um mililitro, utilizando tubos com diâmetro de seis milímetros e corte em torno de 10 quilodaltons, tomando cuidado para excluir quaisquer bolhas de ar ao prender o tubo. Filtramos esterilmente esta solução e realizamos a diálise em condições limpas, manipulando-a com luvas esterilizadas em etanol 70%.

Esta solução deve ser cristalina e é armazenada sob gás argônio para prevenir oxidação. Se a solução estiver turva, então você gerou vesículas multilamelares e precisa recomeçar. Para montar o experimento, precisamos primeiro determinar quanto ICAM um e MHC são depositados numa área superficial específica de uma bicamada com níquel quelante, numa concentração determinada de proteína solúvel.

Para fazer isso, depositamos bicamadas em esferas de vidro com diâmetro de cinco micrômetros. Incubamos as esferas de vidro com soluções proteicas em condições que se aproximam das utilizadas nas células de fluxo empregadas para imageamento, e então determinamos a densidade de proteína ligada por meio de um ensaio imunofluorométrico de fluxo. Anticorpos marcados com FSI, contendo números conhecidos de fluoresceína por molécula, são utilizados para detectar as proteínas ligadas à superfície, e esferas-padrão de fluoresceína são usadas para calibrar o microfluorímetro de fluxo.

Iremos estabelecer condições que aproximam aquelas encontradas em células apresentadoras de antígenos, com 200 moléculas por micrômetro quadrado de ICAM-1 e de 0,2 a 20 moléculas por micrômetro quadrado de I-E-K-M-C-C 91 1 0 3. Bicamadas planares complexas formam-se espontaneamente quando os lipossomos fundem-se ao vidro, mas somente se este estiver adequadamente limpo. Utilizamos solução de piranha, uma mistura recém-preparada de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio a 30%, que destrói todo material orgânico e também deixa a superfície do vidro altamente hidrofílica.

Ao manipular a solução de piranha, usamos roupas de proteção completas, incluindo um avental resistente a ácidos e luvas grossas resistentes a ácidos. Os resíduos precisam ser cuidadosamente separados dos resíduos orgânicos e descartados adequadamente. Para preparar a solução ácida de piranha, adicione 75 mililitros de ácido sulfúrico concentrado a um béquer seco e, em seguida, adicione cuidadosamente 25 mililitros de peróxido de hidrogênio a 30%.

A solução aquece rapidamente a mais de 100 graus Celsius; em seguida, mergulhe as lamínulas secas na solução por 15 minutos. Após essa incubação na solução piranha, mergulhe as lamínulas em água purificada e depois enxágue por um minuto em cada lado. Em seguida, seque as lamínulas utilizando uma fonte de vácuo para drenar a água purificada.

Deixe a solução de piranha esfriar e adicione ao recipiente de resíduos de piranha, que permanece com a tampa solta, bem identificado na capela, para formar as bicamadas. Nosso laboratório utiliza duas câmaras bi FCS, que apresentam a vantagem de aquecimento integrado. O sistema FCS dois está montado sobre uma base de aço inoxidável que prende um manifold microfluídico com uma junta superior de 0,5 milímetro, um lâmina de microaqueduto revestida com óxido de índio-estanho para aquecimento em uma superfície e com um canal fluídico no lado oposto.

Uma junta livre de poeira de 0,25 milímetro que define a altura da câmara de fluxo e a lamínula redonda de 40 milímetros limpa com piranha sobre a qual o bicamada é formada para montar a célula de fluxo e formar bicamadas planares. Coloque o coletor com os tubos voltados para cima sobre uma superfície plana. Em seguida, coloque a junta de 0,5 milímetro com orifícios posicionados sobre os tubos fluidicos e certifique-se de que esta esteja assentada plana.

Coloque suavemente a lâmina de microaqueduto com os canais fluidicos voltados para cima e certifique-se de que ela assente plana, sem aplicar qualquer pressão descendente, até verificar se os orifícios da lâmina estão alinhados com os tubos microfluídicos. Em seguida, posicione a junta livre de poeira de 0,25 milímetro, com um recorte retangular, sobre a lâmina de microaqueduto, de modo que o canal fique alinhado com os canais fluidicos e não haja grandes espaços de ar. Coloque até cinco gotas de suspensão de lipossomos de um microlitro na superfície da lâmina de microaqueduto, dispostas de forma que a distância de centro a centro entre cada gota seja de 2,5 milímetros. As cinco gotas de lipossomos podem ter composições diferentes, mas neste caso formaremos apenas duas bicamadas: uma sem lipídios quelantes de níquel e outra com 10% de lipídios quelantes de níquel.

Uma vez que essas gotas estejam posicionadas, coloque cuidadosamente a lamínula sobre a superfície em um único movimento e prenda-a à base o mais rapidamente possível. As gotas de lipossomos devem entrar em contato com a lamínula. Esse contato não deve ser interrompido, pois as bicamadas provavelmente já se formaram e quaisquer perturbações podem resultar em bicamadas defeituosas.

Neste momento, é importante lembrar de marcar as posições das bicamadas com alguns pequenos pontos de tinta no lâmina para auxiliar no posicionamento da lamínula no microscópio. Aguarde 20 minutos para garantir que o sistema tenha atingido o equilíbrio, e transfira todas as soluções utilizando uma seringa de 20 mililitros conectada a cerca de 20 centímetros de tubo flexível e uma torneira de três vias. Outra porta da torneira é então conectada à célula de fluxo por um pequeno trecho de tubo, a fim de minimizar o volume morto entre a torneira e a célula de fluxo.

Encha a seringa com solução salina tamponada contendo cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, glicose e albumina sérica humana. Purge o tubo e a torneira de modo que não haja bolhas de ar. Em seguida, conecte ao fluxo de células e empurre cinco mililitros de uma só vez, observando para garantir que nenhuma bolha de ar passe pela bicamada.

Agora você terá suas bicamadas para introduzir as proteínas marcadas com hiss na bicamada. Primeiro, ela deve ser bloqueada com caseína e carregada com níquel. Encha uma seringa de um mililitro com a solução de íons níquel-caseína e conecte-a ao orifício lateral sem aprisionar bolhas de ar.

Após injetar a solução, aguarde 20 minutos para permitir o bloqueio completo. Em seguida, lave a solução de bloqueio com H-B-S-H-S-A a partir da seringa de 20 mililitros. Agora injete 0,5 mililitros da solução de H-B-S-H-S-A contendo a ICAM com marcação polihistidina e IEK.

Neste experimento, o ICAM um é marcado com SCI cinco. Assim, as interações entre LFA um e ICAM um podem ser acompanhadas por meio da imagem da reorganização do ICAM um na bicamada. Aguarde 30 minutos para que a proteína se ligue à bicamada carregada com níquel enquanto a proteína adere à bicamada. Prenda a célula de fluxo ao microscópio invertido utilizando um adaptador personalizado para a platina.

Em seguida, conecte a eletrônica de aquecimento para permitir que o sistema equilibre a 37 graus Celsius. Use as marcas feitas anteriormente para posicionar a câmara de fluxo de modo que o objetivo esteja alinhado com uma das bicamadas e utilize microscopia de reflexão por interferência para localizar o plano focal, focando na imagem de luz refletida do diafragma de campo. Por fim, remova por lavagem a ICAM-1 não ligada das câmaras de fluxo.

Adquira imagens de fluorescência da bicamada no canal ICAM um nos modos turf M e widefield. Isso serve para confirmar a ligação do ICAM um na bicamada revestida com níquel em relação à bicamada livre de níquel. A célula de fluxo está agora pronta para receber as células.

Para esta demonstração, utilizaremos células T transgênicas para o receptor de células T do tipo ND que foram transduzidas com um retrovírus que codifica a GFP ligada ao Zap-70, lavaremos as células uma vez com H-B-S-H-S-A e, em seguida, incubaremos as células com um FAB marcado com Alexa 568 direcionado ao receptor de células T, para que possamos rastrear os microagregados do TCR. Após 15 minutos, dilua as células na proporção de 1 para 10. Isso dilui o anticorpo H-57 o suficiente para que ele não interfira na imagem do turf M, mas mantém a saturação do receptor de células T à medida que o fab inicialmente ligado começa a se dissociar, e então injete-as na câmara de fluxo.

Nós imageamos a sinapse imunológica em modo turf M de três cores. Isso inclui a formação da interação LFA-1, ICAM-1, a formação de agregados de TCR e do C smac e a formação sustentada de microagregados de TCR, que recrutam GFP ZAP-70. Alguns desses resultados são evidentes durante a aquisição, enquanto outros exigirão análise pós-processamento para serem plenamente apreciados.

Ok, acabamos de mostrar como usar bicamadas planares suportadas para estudar a sinapse imunológica. É muito importante, para o sucesso desses experimentos, que os linfócitos T estejam em boas condições e que a solução salina tamponada com PPS não seja utilizada para cultivo prolongado de linfócitos T. Assim, você deve retirar as células do cultivo, colocá-las nesse meio e usá-las rapidamente.

Se você precisar realizar experimentos de longa duração, existem algumas formulações excelentes de meios livres de soro que podem ser substituídas ao salino tamponado com hepe. Isso manterá as células vivas por um período muito mais longo, caso deseje realizar pontos finais prolongados, como a produção de citocinas ou a proliferação de linfócitos T. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.