Name: Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda a criar bicamadas planares suportadas para estudar sinapses imunológicas usando microscopia TIRF. Este método permite visualizar dinamicamente a formação de sinapses e interações moleculares em células imunes.

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1. Preparar os lipídios <ol><li> A fim de ligar proteínas para o folheto superior de uma bicamada, usamos Ni 2 + lipídios quelante, que escora proteínas recombinantes com poli-histidina tags. Certos tipos de células podem aderir não especificamente para bicamadas + revestido Ni 2, mas as células T, geralmente, não, tornando este método ideal para estudar a ativação de células T. </li><li> A solução bicamada lipídica é feita através da preparação de uma solução de Ni 2 + 20% de lipídios e 80 quelante fosfatidilcolina% no montante adequado a um tubo de vidro com 1-2 ml de clorofórmio-metanol. <ol><li> Evaporar o solvente sob um fluxo de gás nitrogênio em um ambiente aconchegante (30-37 ° C) em banho maria. Isso normalmente leva cerca de 15 minutos. </li><li> Remover qualquer traço do solvente sob alto vácuo, usando um liofilizador por 90 minutos. </li></ol></li><li> Dissolver os lipídios em 2% N-octil-glucoside detergente em tampão Tris-salina, o que cria uma solução de mistura detergente / fosfolipídio micelas. A concentração de fosfolipídios final deve ser 0,4 mM. Para formar os lipossomas, diálise esta solução com três mudanças de Tris-salina para remover lipossomas detergente e forma. Costumamos trabalhar com volumes da ordem de 1 ml com 6 mm de diâmetro Spectra / por # 2 tubos com um corte em torno de 10 kDa. Temos o cuidado de excluir qualquer bolha de ar quando s de fixação da tubulação. Nós normalmente estéril-filtro esta solução e fazer a diálise em condições limpas, manuseá-lo usando luvas de etanol 70% esterilizados. </li><li> Esta solução deve ser cristalina. Ela é armazenada sob gás argônio para evitar a oxidação. Se a solução estiver turva, então multi-walled vesículas foram gerados, e você terá que começar novamente. </li></ol> 2. Determinar a quantidade de ICAM-1 e MHC são depositados no bicamada planar <ol><li> , A fim de configurar o experimento, é necessário primeiro determinar o quanto ICAM-1 e MHC são depositados em uma área determinada superfície de Ni 2 + quelante bicamada em uma dada concentração de proteína solúvel. Para fazer isso, bicamadas depósito em 5 micrômetros de diâmetro contas de vidro, incubar as esferas de vidro com soluções de proteínas em condições que se aproximem daquelas nas células de fluxo usado para geração de imagens, e ler a densidade de proteínas ligadas por um fluxo de ensaio imunofluorométrico. </li><li> Anticorpos marcados com FITC-número conhecido de fluoresceína por molécula são usados ​​para detectar as proteínas de superfície-bound. Contas de fluoresceína padrão são usados ​​para calibrar o fluxo de microfluorimeter. </li><li> Vamos estabelecer as condições que se aproximem daquelas em células apresentadoras de antígenos, com 200 molecules/μm2 de ICAM-1 e 0,2-20 molecules/μm2 de I-Ek-MCC91-103 complexos. </li></ol> 3. A limpeza da lamínulas de vidro para a formação de bicamadas planar <ol><li> Bicamadas planas formam espontaneamente quando o lipossomas fusível de vidro, mas só se o copo está devidamente limpo. </li><li> Ao trabalhar com Piranha, usamos roupas de proteção total, incluindo um avental de ácido e pesado, ácido luvas resistentes. Cuidadosamente segregar os resíduos a partir de resíduos orgânicos e descartar adequadamente. </li><li> Para preparar a solução de ácido Piranha, adicione 75 ml de ácido sulfúrico concentrado a um recipiente seco e, cuidadosamente, adicionar 25 ml de peróxido de hidrogênio 30%. A solução rapidamente se aquece para mais de 100 ° C. </li><li> Mergulhe as lamelas seco na solução por 15 minutos. Remover da solução e enxaguar em água purificada por um minuto em cada lado. Seca as lamelas utilizando uma fonte de vácuo para drenar a água purificada. Permitir que a solução Piranha para esfriar, e adicionar ao recipiente de resíduos Piranha, que fica com a tampa solta, bem marcado na capela. Quando todos os lipossomas, lamínulas, e as proteínas são preparados, a sinapse imunológica está pronto para ser formado. </li></ol> 4. Formando o bicamadas <ol><li> Para formar a bicamadas, nosso laboratório utiliza Bioptechs FCSII câmaras, que têm as vantagens de aquecimento integrado. O sistema FCSII está em uma base de aço inoxidável que grampos em conjunto um coletor microfluídicos com uma junta de 0,5 mm de topo, um slide microaqueduct revestido com óxido de índio e estanho para o aquecimento em uma superfície, com sulco fluídico do outro lado, um livre de poeira 0,25 milímetros junta que define a altura da câmara de fluxo ea Piranha limpos lamela 40 mm redondo em que a bicamada é formada. </li><li> Enquanto a lamínula, em que a bicamada é formada, precisa ser altamente hidrofílico e limpo, o slide microacqueduct realmente funciona melhor se é mais hidrofóbica. Tornando o mais hidrofóbico microaqueduct é alcançada após o tratamento com HSA 1% por 60 minutos em temperatura ambiente, em seguida, lavar com água pura e secagem completamente após este processo de condicionamento, bem como entre os usos. O revestimento de proteínas desnaturadas deixadas por este procedimento permite que 1 ml de suspensão de lipossomas para formar um círculo, hemispherical gota que é&gt; 0,25 mm de altura. </li><li> Para montar a célula de fluxo e formar bicamadas planar, coloque o manifold, com os tubos direccionado para cima, em cima de uma superfície plana. Então, coloque a 0. 5 junta mm com furos posicionado sobre os tubos fluídico, certificando-se que ele esteja bem encaixada. Delicadamente, coloque o lado microaqueduct para a junta com os canais fluídicos voltada para cima, e certifique-se que assentos lisos sem aplicar qualquer pressão para baixo, até verificar que os buracos no slide se alinham com os tubos microfluídicos. Coloque o livre de poeira junta 0,25 mm com um corte retangular no topo do slide microaqueduct para que o canal está alinhado com os canais fluídicos e que não existem espaços de ar maiores. </li><li> Coloque até 5 x 1 gotas mL de suspensão de lipossomas na superfície da lâmina microaqueduct em um padrão tal que a distância de centro a centro entre cada gota é de 2,5 mm. A 5 gotas lipossomas podem ter composições diferentes, mas neste caso só vamos formar duas bicamadas, um sem Ni 2 + + lipídios quelante e um com 10% Ni 2 + + lipídios quelante. </li><li> Uma vez que estas gotas estão no lugar, coloque cuidadosamente a tampa de deslizamento sobre a superfície em um movimento. Pinça para a base o mais rápido possível. As gotas lipossomas devem fazer contato com a lamínula. Este contato não deve ser quebrado, já que o bicamadas provavelmente já formado; qualquer interrupção pode resultar em bicamadas com defeito. </li><li> É importante lembrar para marcar as posições das bicamadas com algumas pequenas manchas de tinta no slide microacqueduct para auxiliar na colocação da lamela no microscópio. Esperar 20 minutos para se certificar de que o sistema tenha equilibrada. Transferência de todas as soluções usando uma seringa de 20 ml conectada a cerca de 20 cm de tubos flexíveis e uma torneira de 3 vias. Conectar outra porta da torneira para a célula de fluxo por um curto período de tubulação para minimizar o volume morto entre a torneira ea célula de fluxo. Encha a seringa com HEPES-salina tamponada contendo 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 5 mM de glicose e 1% albumina sérica humana. </li><li> Primeiro-tubo e torneira para que não haja bolhas de ar. Conecte-o ao fluxo de células e empurrar a 5 ml em um movimento, enquanto observa a certeza de que nenhuma bolha de ar passar sobre a bicamada. Agora, você terá a sua bicamadas. </li></ol> Este artigo de vídeo suporta &quot;Hunter Gatherer e para trás: Sinapses imunológicas e Kinapses como variações sobre o tema da Locomotion Amoeboid&quot; por <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">Michael L. Dustin</a> , <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">Revisão Anual de Biologia Celular e do Desenvolvimento</a> , Volume 24, 2008.

suportados bicamadas planar para a formação do estudo da sinapses imunológicas e kinapse

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Suportados bicamadas planar são ferramentas poderosas que podem ser usados ​​para modelar as interações moleculares em uma sinapse imunológica. Para simular as interações entre linfócitos e células apresentadoras de antígenos, usamos Ni2 +-quelante lipídios para ancorar adesão celular e proteínas recombinantes MHC o folheto superior de uma bicamada com poli-histidina tags. Bicamadas planas são gerados através da preparação de lipídios, o tratamento de superfícies de vidro, onde a bicamada formará, e então formar a bicamada em uma câmara especializada contendo uma célula de fluxo onde os linfócitos serão adicionados. Então, bicamadas são acusados ​​de Ni e sua marcadas proteínas recombinantes são adicionados. Finalmente, os linfócitos são injetados na célula de fluxo e microscopia TIRF pode ser usado para formação da imagem sinapse e os mecanismos que controlam a locomoção de células T, sites de classificação receptor, e os locais de degradação receptor.

Suportados bicamadas planar são ferramentas poderosas que podem ser usados ​​para modelar as interações moleculares em uma sinapse imunológica. Aqui, vamos mostrar os métodos de ancoragem de proteínas de adesão celular que modula a formação de sinapses para o folheto superior do bilyer lipídico e visualize a formação de sinapses através de microscopia TIRF.

Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

Bicamadas planares suportadas são ferramentas poderosas que podem ser utilizadas para modelar as interações moleculares em uma sinapse imunológica. Para mimetizar as interações...

Olá, sou Mike Dustin do Instituto Geral e da Escola de Medicina da Universidade de Nova York. Hoje, vou guiá-lo pelo procedimento de formação de bicamadas planares suportadas para o estudo da sinapse imunológica. Então, vamos começar.Para formar a bicamada lipídica, preparamos uma solução contendo 20% de lipídio quelante de níquel e 80% de fosfatidilcolina em quantidades apropriadas em um tubo de vidro com um a dois mililitros de clorofórmio-metanol. O primeiro passo é evaporar o solvente sob um fluxo de gás nitrogênio em um banho-maria aquecido a 30 a 37 graus Celsius. Isso geralmente leva cerca de 15 minutos.Em seguida, remova qualquer solvente remanescente sob vácuo elevado utilizando um liofilizador por 90 minutos. Depois, dissolva os lipídios em tampão salino com detergente octil glucosídeo 2% N para obter uma concentração final de 0,4 milimolar. Isso cria uma solução de micelas mistas de detergente e fosfolipídios para formar lipossomos.Você realiza a diálise desta solução contra três mudanças de solução salina de tris para remover o detergente e formar lipossomos. Normalmente trabalhamos com volumes da ordem de um mililitro, utilizando tubos com diâmetro de seis milímetros e

supported-planar-bilayers-for-formation-study-immunological-synapses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Este vídeo demonstra uma técnica para visualizar a formação da sinapse imunológica em células natural killer (NK) em uma bicamada lipídica (SLB) suportada. O SLB é primeiro marcado com um ligante do receptor ativador de células NK marcado com fluoróforo, seguido de incubação com células NK. Posteriormente, as células são coradas para actina polimerizada e grânulos líticos positivos para perforina. Essa abordagem permite a visualização da formação de sinapses usando microscopia de depleção de...

Imagem de super-resolução da formação de sinapses imunológicas de células NK em uma bicamada lipídica suportada

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estudar a formação de sinapses imunes entre células T humanas primárias e bicamadas lipídicas suportadas (SLB). As proteínas da superfície das células T interagem com os respectivos ligantes imobilizados no SLB para formar uma sinapse imune, seguida pelo movimento dos grânulos líticos em direção à sinapse, que é visualizado por meio de microscopia de fluorescência.

Uma técnica in vitro para estudar a interação de células T com bicamadas lipídicas planares suportadas

Este vídeo demonstra imagens de células vivas da topologia de sinapses imunológicas, investigando as interações entre linfócitos T e células epiteliais que carregam antígenos fluorescentes. A microscopia de fluorescência revela deslocamento do citoplasma vermelho e anéis de membrana amarela nas células endoteliais, indicando a formação de sinapses imunológicas.

Avaliação da topologia imunológica de sinapses por meio de imagens de células vivas

Descrevemos aqui uma combinação da técnica de bicamada lipídica suportada em vidro de formação de sinapses imunológicas com a técnica de imagem de super-resolução de microscopia de depleção por emissão estimulada (STED). O objetivo deste protocolo é fornecer aos usuários as instruções necessárias para realizar com sucesso essas duas técnicas.

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

A preparação de bicamadas lipídicas planares com suporte de vidro funcionalizadas por proteínas, determinação da mobilidade de proteínas e medição de densidades de proteínas é mostrada aqui. Um roteiro para a construção de um microscópio de reflexão interna total com redução de ruído é delineado, o que permite visualizar fluorocromos residentes em uma única camada com alta resolução espaço-temporal.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

A imunidade adaptativa é controlada por 'sinapses imunológicas' dinâmicas formadas entre células T e células apresentadoras de antígenos. Este protocolo descreve métodos para investigar células endoteliais como APCs fisiológicas pouco estudadas e como um novo tipo de 'modelo de APC celular planar'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Nisto nós descrevemos duas aproximações para caracterizar eventos da polarização da pilha em linfócitos de B durante a formação de um IS. O primeiro, envolve a quantificação do recrutamento organela e rearranjos de citoesqueleto na membrana sináptica. A segunda é uma abordagem bioquímica, para caracterizar as mudanças na composição do centrosome, que sofre polarização para a sinapse imune.

Estudando a dinâmica organelle em células B durante a formação de sinapse imune

Este protocolo images a formação imunológica da sinapse e o tráfego polarizado subseqüente do secretry para a sinapse imunológica. Conjugados celulares foram formados entre uma célula Raji com pulso de superantígeno (agindo como uma célula de apresentação de antígeno) e um clone de Jurkat (agindo como um linfocito auxiliar de efetoreto T).

Imagem da Sinapse Imunológica Humana

Aqui apresentamos o protocolo para a reconstituição stepwise de células que apresentam antígenos sintéticos usando Bicamadas lipídicas apoiadas por contas e seu uso para interrogar a saída sináptica de células T ativadas.

Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

Um protocolo experimental é apresentado para montar, estimular eletricamente e analisar bicamadas de interface de gotículas dopadas com gramicidina A. As relações estrutura-função lipídio-proteína são quantificadas medindo mudanças na área da membrana, fluxo iônico e condutância de canal único, e relacionando essas respostas a mudanças semelhantes à plasticidade na condução iônica em um modelo de membrana inspirado em sinapses elétricas.

Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Aprenda a criar bicamadas planares suportadas para estudar sinapses imunológicas usando microscopia TIRF. Este método permite visualizar dinamicamente a formação de sinapses e interações moleculares em células imunes.

Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

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