Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

Olá, sou Mike Dustin, do Instituto Geral e da Escola de Medicina da Universidade de Nova York. Hoje vou levá-lo através do procedimento de formação de Biolay planar de suporte para estudo da sinapse imunológica. Então vamos começar.

Para fazer a bicamada lipídica, preparamos uma solução de 20% de níquel, lipídio quelante e 80% de fosfatidilcolina nas quantidades apropriadas em um tubo de vidro com um a dois mililitros de clorofórmio metanol. O primeiro passo é evaporar o solvente sob uma corrente de gás nitrogênio em um banho-maria quente de 30 a 37 graus Celsius. Isso geralmente leva cerca de 15 minutos.

Em seguida, remova qualquer solvente restante sob alto vácuo usando um liofilizador por 90 minutos. Em seguida, dissolva os lipídios em tampão salino de interesse de detergente glucocida octal 2% N até uma concentração final de 0,4 milimolar. Isso cria uma solução de mistura de células fosfolipídicas em detergente para formar lipossomas.

Você dialisa esta solução contra três mudanças de solução salina para remover o detergente e formar lipossomas. Costumamos trabalhar com volumes da ordem de um mililitro com tubos de seis milímetros de diâmetro com um corte em torno de 10 kilodaltons e temos o cuidado de excluir quaisquer bolhas de ar durante a fixação do tubo. Filtramos esta solução e fazemos a diálise em condições limpas e a manuseamos com luvas esterilizadas com etanol a 70%.

Esta solução deve ser cristalina e é armazenada sob gás Argonne para evitar a oxidação. Se a solução for turva, você gerou vesículas de paredes múltiplas e precisa começar de novo. Para iniciar o experimento, precisamos primeiro determinar quanto ICAM um e MHC são depositados em uma determinada área de superfície da bicamada quelante de níquel em uma determinada concentração de proteína solúvel.

Para fazer isso, depositamos bicamadas em velocidades de vidro de cinco micrômetros de diâmetro. Incube as esferas de vidro com soluções de proteína sob condições que se aproximem das células de fluxo usadas para imagens e, em seguida, leia a densidade da proteína ligada por um ensaio imunométrico de fluxo. Anticorpos marcados com FSI com números conhecidos de fluoresceína por molécula são usados para detectar as proteínas ligadas à superfície e grânulos padrão de fluoresceína são usados para calibrar o microfluorímetro de fluxo.

Estabeleceremos condições que se aproximam daquelas em células apresentadoras de antígenos com 200 moléculas por micrômetro quadrado de ICAM um e 0,2 a 20 moléculas por quadrado. Micrômetro de I-E-K-M-C-C 91 1 0 3, bicamadas planares complexas se formam espontaneamente quando os lipossomas se fundem ao vidro, mas somente se for devidamente limpo para limpar o vidro. Usamos solução ácida de pana, uma mistura recém-preparada de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio a 30%, que destrói todo o material orgânico e também deixa a superfície do vidro muito hidrofílica.

Ao trabalhar com piranha, usamos roupas de proteção completas, incluindo um avental ácido e manoplas resistentes a ácidos pesados. Os resíduos precisam ser cuidadosamente separados dos resíduos orgânicos e descartados adequadamente. Para preparar a solução ácida de piranha, adicione 75 mililitros de ácido sulfúrico concentrado a um béquer seco e, em seguida, adicione cuidadosamente 25 mililitros de peróxido de hidrogênio a 30%.

A solução aquece rapidamente até mais de 100 graus Celsius e, em seguida, mergulhe as lamínulas secas na solução por 15 minutos. Após esta incubação em piranha, mergulhe as lamelas em água purificada e depois enxágue-as por um minuto de cada lado. Em seguida, seque as lamínulas usando uma fonte de vácuo para drenar a água purificada.

Deixe a solução de piranha esfriar e adicione ao recipiente de resíduos de piranha, que fica com uma tampa solta, bem marcada na hotte para formar as bicamadas. Nosso laboratório usa duas câmaras bi FCS, que têm as vantagens de aquecimento integrado. O sistema FCS dois está em uma base de aço inoxidável que prende um coletor microfluídico com uma junta superior de 0,5 milímetro, uma corrediça de microaqueduto revestida com óxido de índio e estanho para aquecimento em uma superfície e com uma ranhura fluídica no outro lado.

Uma junta de 0,25 milímetros livre de poeira que define a altura da câmara de fluxo e a piranha limpou a lamínula redonda de 40 milímetros na qual a bicamada é formada para montar a célula de fluxo e formar bicamadas planas. Coloque o coletor com os tubos direcionados para cima em uma superfície plana. Em seguida, coloque a junta de 0,5 milímetro com orifícios posicionados sobre os tubos fluídicos e certifique-se de que esteja assentada.

Coloque suavemente a lâmina do microaqueduto com os canais fluídicos voltados para cima e certifique-se de que ela fique plana sem aplicar nenhuma pressão para baixo até verificar se os orifícios na lâmina alinham os tubos microfluídicos. Em seguida, coloque a junta de 0,25 milímetro livre de poeira com um recorte retangular no topo da corrediça do microaqueduto, de modo que o canal fique alinhado com os canais fluídicos e não haja grandes espaços de ar, coloque até cinco gotas de um microlitro de suspensão de lipossomas na superfície da lâmina do microaqueduto em um padrão tal que a distância de centro a centro entre cada gota seja de 2,5 milímetros. As cinco gotas de lipossomas podem ter composições diferentes, mas neste caso formaremos apenas duas bicamadas, uma sem lipídios quelantes de níquel e outra com lipídios quelantes de níquel a 10%.

Uma vez que essas gotas estejam no lugar, coloque cuidadosamente a lama de cobertura na superfície em um movimento, prenda na base o mais rápido possível. As gotas de lipossomas devem entrar em contato com a lamínula. Este contato não deve ser quebrado, pois as bicamadas provavelmente já se formaram e qualquer interrupção pode resultar em bicamadas defeituosas.

Neste ponto, é importante lembrar de marcar as posições das bicamadas com alguns pequenos pontos de tinta na lâmina para ajudar no posicionamento da lamínula no microscópio. Aguarde 20 minutos para se certificar de que o sistema está equilibrado, transfira todas as soluções usando uma seringa de 20 mililitros conectada a cerca de 20 centímetros de tubo flexível e uma torneira de parada de três vias. Outra porta da torneira de parada é então conectada à célula de fluxo por um pequeno comprimento de tubulação para minimizar o volume morto entre a torneira e a célula de fluxo.

Encha a seringa com solução salina tamponada com heis contendo cloreto de magnésio, cloreto de cálcio glicose e albumina sérica humana. Prepare a tubulação e pare a torneira para que não haja bolhas de ar. Em seguida, conecte-o às células de fluxo e empurre cinco mililitros em um movimento enquanto observa para garantir que nenhuma bolha de ar passe sobre a bicamada.

Agora você terá suas bicamadas para introduzir as proteínas marcadas com chiado na bicamada. Deve primeiro ser bloqueado com casena e carregado com níquel. Encha uma seringa de um mililitro com a solução de íons de níquel caseno e conecte-a à porta lateral sem reter bolhas de ar.

Depois de injetar a solução, aguarde 20 minutos para permitir o bloqueio completo. Em seguida, lave a solução de bloqueio com H-B-S-H-S-A da seringa de 20 mililitros. Agora injete 0,5 mililitros de solução H-B-S-H-S-A contendo o ICAM marcado com polihis um e IEK.

Neste experimento, o ICAM é rotulado com SCI cinco. Assim, as interações LFA um ICAM podem ser seguidas por imagens do rearranjo ICAM um na bicamada, permitindo 30 minutos para a proteína se ligar à bicamada carregada de níquel enquanto a proteína está aderindo à bicamada. Prenda a célula de fluxo ao microscópio invertido usando uma inserção de platina personalizada.

Em seguida, conecte a eletrônica de aquecimento para permitir que o sistema se equilibre a 37 graus Celsius. Use as marcas feitas anteriormente para posicionar a célula de fluxo de forma que a objetiva fique alinhada com uma das bicamadas e use a microscopia de reflexão de interferência para localizar o plano focal focalizando a imagem de luz refletida do diafragma de campo. Finalmente, lave o ICAM não ligado das células de fluxo.

Adquira imagens de fluorescência da bicamada no canal ICAM em relva M e modos de campo amplo. Isso é para confirmar a ligação ICAM um na bicamada revestida de níquel em relação à bicamada livre de níquel. A célula de fluxo agora está pronta para receber células.

Para esta demonstração, usaremos células T transgênicas do receptor de células T ND que foram transduzidas com um revestimento de retrovírus ENC GFPs P zap 70, lavaremos as células uma vez com HBSH e depois incubaremos as células com um Alexa 5 68 marcado como FAB para o receptor de células T para que possamos rastrear os micro clusters TCR. Após 15 minutos, dilua as células de um a 10. Isso dilui o anticorpo H 57 o suficiente para não interferir na imagem M do gramado, mas mantém a saturação do receptor de células T à medida que o fab inicialmente ligado começa a se dissociar e, em seguida, injetá-los na célula de fluxo.

Visualizamos a sinapse imunológica no modo M de grama de três cores. Isso inclui a formação da interação LFA, ICAM um, a formação de clusters TCR e C smac e a formação sustentada de microclusters TCR, que recrutam GFP ZAP 70. Alguns desses resultados são óbvios durante a aquisição, enquanto outros exigirão análise de pós-processamento para serem totalmente apreciados.

Ok, acabamos de mostrar como usar bicamadas planares suportadas para estudar a sinapse imunológica. É muito importante para que esses experimentos funcionem que as células T estejam em muito boa forma e a solução salina tamponada com PPS não seja muito adequada para cultura de células T de longo prazo. Então você quer tirar as células da cultura, colocá-las nessa mídia e usá-las muito rapidamente.

Se você achar que deseja fazer experimentos de longo prazo, existem algumas formulações de meios livres de soro muito boas que você pode substituir pela solução salina tamponada. Isso manterá as células vivas por muito mais tempo se você quiser fazer um ponto final mais longo, como a produção de citocinas ou a proliferação das células T. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.