Name: Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Aprenda a entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de camundongos e ratos após acidente vascular cerebral isquêmico. Este método permite distribuição ampla e detecção das células por até 30 dias.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo seguinte: Prêmio AHA 14SDG20480186 para LC, equipe de inovação de assuntos da Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 para BZ, e Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust bolsa 14-12A para KES e LC.

Todos os procedimentos sobre os animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Kentucky, e foram tomados cuidados adequados para minimizar o estresse ou a dor associados à cirurgia.
1. Preparação de cateter de injeção e ganchos cirúrgicos
<ol><li>Construa o cateter de injeção(Figura 1). Reúna os materiais necessários, incluindo: MRE010, MRE025 e tubos MRE050, agulhas de injeção de 20 G, 26 G e 27 G(Figura 2A),600 lixa de grão, supercola e epóxi de 5 minutos de dois componentes.<ol>
<li>Corte agulhas de 20 G e 26 G a 1 cm do cubo da agulha e polir a extremidade na lixa(Figura 2B). Lave as agulhas com 10 mL de água dupla destilada para limpar o furo da agulha. NOTA: São utilizados dois desenhos diferentes(Figura 1). O Design 1 tem um único conector e é usado para injeção de soluções ou suspensões. O Design 2 possui conectores de bloqueio Luer de 20 G e 26 G para injeção de células (agulha de 20 G) e descarga do volume morto (agulha de 26 G) para garantir a entrega do volume total da solução contendo NSC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Design 1: Insira um cateter MRE010 de 3-4 cm de comprimento em um cateter MRE025 de 15 cm de comprimento e fixe com supercola.<ol>
<li>Conecte a outra extremidade do tubo MRE025 a um segmento de cateter MRE050 e fixe com supercola. Insira uma agulha de 20 G embotada na extremidade restante do cateter MRE050 e fixe com supercola(Figura 1).</li>
		<li>Reforçar ainda mais os locais de conexão com cola epóxi. Este projeto de cateter é ideal para a injeção de reagentes (como soluções químicas ou medicamentosas ou outros biológicos, como citocinas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Design 2: Insira um cateter MRE010 de 3-4 cm de comprimento em um cateter MRE025 de 15 cm de comprimento e fixe com supercola.<ol>
<li>Conecte a outra extremidade do tubo MRE025 a um segmento de cateter MRE050 e fixe com supercola. Insira uma agulha de 20 G embotada na extremidade restante do cateter MRE050 e fixe com supercola.</li>
		<li>Insira uma agulha de 26 G embotada no tubo MRE050 perto da ponta da primeira agulha, seguindo a direção do fluxo de injeção, e fixe com supercola(Figura 1 e Figura 2C). Reforce as agulhas e o segmento do tubo MRE050 com epóxi claro(Figura 2C). Este projeto permite a injeção de solução veicular através da agulha 2 (26 G) após a injeção de NSC através da agulha 1 (20 G) para liberar o volume morto no cateter para a circulação cerebral, alcançando um controle mais preciso dos volumes de injeção.</li>
		<li>Use uma agulha de 20 G para injeção de NSC, a fim de minimizar os danos aos NSCs, o que poderia afetar negativamente a viabilidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a construção, lave os cateteres com 10 mL de água dupla destilada, seguido de 70% de etanol, e depois mergulhe-os em 70% de etanol durante a noite.</li>
	<li>Antes da cirurgia, retire os cateteres de 70% de etanol e lave com 10 mL de PBS estéril, e coloque-os em uma caixa de ferramentas cirúrgicas autoclavadas para armazenamento e transporte.</li>
	<li>Preparação dos ganchos cirúrgicos<ol>
<li>Corte um eixo de agulha de 1,5- 2 cm de comprimento de uma agulha de 27 G, e polir ambas as extremidades em lixa até ficar maçante. Em seguida, use um pequeno grampo hemostático para dobrar o eixo em um gancho em uma extremidade e uma forma de anel na outra extremidade.</li>
		<li>Insira um cateter MRE025 de 10-15 cm de comprimento através do anel e fixe com fita cirúrgica clara(Figura 2D). Faça mais 2 ganchos usando o mesmo método.</li>
		<li>Mergulhe todos os ganchos e sistemas de cateter em 70% de etanol até usar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação animal: Entrega, habitação, adaptação ambiental
<ol><li>Foram utilizados neste estudo ratos C57BL/6 masculinos e femininos (10-12 semanas, n=10/ponto de tempo) e ratos Wistar (10-12 semanas, n=10).</li>
	<li>Abriga-os em um vivarium animal controlado ambientalmente com comida e água ad libitum.</li>
	<li>Permita que eles se adaptem ao ambiente pelo menos 1 semana antes da cirurgia de derrame. NOTA: Um rato e um rato morreram em 1 d após a cirurgia de derrame e um rato foi eutanizado em 3 d pós-derrame antes da injeção de NSC por razões humanas por causa de paralisia grave.</li>
</ol>3. Cultura de células-tronco neurais de camundongos e ratos (NSCs)
NOTA: Os NSCs foram isolados e cultivados seguindo um protocolo estabelecido20.
<ol><li>Mouse<ol>
<li>Isolador os NSCs (WT) e os NSCs rotulados por GFP do córtex embrionário E18 de camundongos C57BL/6 fêmeas de gravidez cronometrada acasalados com camundongos machos GFP positivos (B6 ACTb-EGFP). Para identificar embriões GFP (+) observem os embriões colhidos em um microscópio de fluorescência usando o canal FITC. Os embriões GFP (+) produzem sinal de fluorescência verde, enquanto os embriões de TT mostram apenas auto-fluorescência fraca(Figura 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rato<ol>
<li>Isolar os NSCs da zona subventricular (SVZ) de ratos WT adultos jovens. Rotule-os com DiI pouco antes da injeção seguindo as instruções do fabricante21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NSCs de camundongos ou ratos de cultura até que se desenvolvam em neurosferas, e os passem quando o diâmetro da esfera atingir cerca de 100 μm(Figura 3B). Use os NSCs para injeção entre as passagens 3 e 5.</li>
	<li>Verifique suas propriedades de células-tronco usando um painel de marcador de células-tronco embrionárias(Figura 3C).</li>
	<li>No dia da injeção, colete esferas de NSC e dissociar com a solução de descolamento celular, suspender em PBS livre de cálcio e magnésio para uma concentração de 107 células/mL, e colocar no gelo molhado até a injeção.</li>
</ol>4. Preparação cirúrgica
<ol><li>Antes da cirurgia, marque um ponto na sutura comercial de MCAO com uma caneta marcadora prateada a 9 mm (para mouse) ou 15 mm (para rato) da ponta para referência em cirurgia do comprimento da inserção. Autoclave as ferramentas cirúrgicas (tesouras, fórceps) e instrumentos antes de cada cirurgia, e o calor os esterilize em um esterilizador de contas de vidro entre as operações.</li>
	<li>Induzir anestesia em animais com 5% de isoflurane via inalação e manter anestesia com 1-2% de isoflurane. Avalie a profundidade da anestesia através da observação de condições gerais (padrão respiratório, movimento do bigode e postura espontânea de correção corporal), reflexo córnea e resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo.</li>
	<li>Coloque o supino animal em uma almofada de aquecimento, e prepare o local cirúrgico no animal, cortando e esfregando com solução betadina seguido de 70% de etanol. Proteja os olhos do animal da secagem, aplicando pomada oftalmológica (por exemplo, pomada artificial) durante a cirurgia.</li>
	<li>Que os cirurgiões esfreguem completamente as mãos com um esfoliante bactericidal e usem uma máscara, luvas estéreis e um jaleco limpo.</li>
</ol>5. Cirurgia de oclusão da artéria cerebral média (MCAO)
NOTA: As cirurgias para induzir derrame isquêmico em um hemisfério de camundongo ou rato são semelhantes na forma de introduzir uma sutura na artéria carótida interna (ICA) para ocluir o fluxo sanguíneo(Figura 4)17,,18,,19,22. No entanto, a artéria selecionada para a inserção da sutura difere com base no espaço de operação disponível necessário para a injeção subsequente de células-tronco. O rato tem amplo espaço no segmento de artéria carótida externa (ECA) para permitir duas cirurgias separadas e sequenciais (derrame e injeção de NSC), mas o rato não, exigindo uma abordagem alternativa. Alterações no fluxo sanguíneo cerebral induzidas por AVC, tamanho do infarto cerebral e déficits neurológicos foram relatadas como nos relatórios anteriores dos autores17,,18,,19.
<ol><li>Para induzir o AVC isquêmico, inicie cirurgias de camundongos e ratos com incisão de linha média na área cervical e isolamento da artéria carótida comum esquerda (CCA), ECA e ICA (Figura 4). Tenha cuidado para não esticar, deslocar ou espremer o nervo CCA ou vagus. Uma vez que a seleção das etapas da artéria e cirúrgica são diferentes depois disso, a cirurgia de MCAO no camundongo e no rato será descrita separadamente.</li>
	<li>Cirurgia de MCAO no camundongo (Figura 4A)<ol>
<li>Coloque três suturas trançadas de nylon 6-0 sob a CCA (Figura 4A, passo 1), e faça um nó cirúrgico apertado para ocluir o vaso o mais longe possível da bifurcação usando a corda proximal(Figura 4A, passo 2). Apare as pontas da sutura.</li>
		<li>Faça um slipknot no lado distal da CCA (cuidado: não aperte demais, pois será liberado na etapa 6) e um slipknot solto entre os dois nós apertados(Figura 4A, passo 2).</li>
		<li>Corte uma pequena incisão (~ 1/4 - 1/3 da circunferência) perto do nó proximal na CCA com microscisores(Figura 4A, passo 3), e insira cuidadosamente a sutura de nylon sólida revestida de silicone comercial 7-0(Figura 4A, passo 4). Segure esta sutura com a corda média, apertando o suficiente(Figura 4A, passo 5) para garantir nenhum vazamento de sangue da incisão e nenhum movimento do filamento de nylon revestido de silicone pelo fluxo de fundo da ICA, ao mesmo tempo que permite o avanço da sutura em direção ao ECA com um leve empurrão pela pinça.</li>
		<li>Solte o slipknot superior (distal)(Figura 4A, passo 6) e avance a sutura de nylon no ICA até que sua ponta passe a bifurcação por 9 mm (usando o marcador de prata na sutura como referência). Aperte os dois deslizamentos superiores para fixar a sutura e evitar o fluxo sanguíneo.</li>
		<li>Retire o filamento 1 h depois(Figura 4A, passo 7) e ligate a CCA usando o nó médio para evitar sangramento(Figura 4A, passos 5-7 em ordem inversa, resultados finais como visto na etapa 8). Solte o nó superior. Feche a ferida com sutura cirúrgica 4-0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cirurgia de MCAO em rato (Figura 4B)<ol>
<li>Coloque duas suturas trançadas de nylon 6-0 sob o ECA (Figura 4B, passo 1), e faça um nó apertado na extremidade distal na medida do possível(Figura 4B, passo 2).</li>
		<li>Coloque clipes de vaso no ICA e CCA para ocluir o fluxo sanguíneo arterial(Figura 4B, passo 3). Um slipknot pode ser usado como alternativa para um clipe de vaso.</li>
		<li>Faça uma pequena incisão no ECA com microscisores(Figura 4B, passos 3-4), insira um filamento comercial de borracha de silicone revestido 6-0 de nylon(Figura 4B, passo 5), e fixe corretamente com um slipknot no ECA.</li>
		<li>Solte o clipe do vaso no ICA, avance o filamento para dentro do ICA até que o marcador de prata (15 mm) atinja a bifurcação(Figura 4B, passo 6), edepois fixe a sutura com o 2º nó no ECA (Figura 4B, passo 6).</li>
		<li>Após 1h de isquemia, retire este filamento e liga a incisão para evitar sangramento (Figura 4B, passo 7), remova o clipe do vaso da CCA (resultado final como na etapa 8) e feche a ferida com sutura cirúrgica 4-0.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Recuperação
<ol><li>Após a cirurgia de derrame, coloque os animais em uma almofada de aquecimento até que recuperem totalmente a consciência.</li>
	<li>Forneça analgesia através de injeção subcutânea. Devolva os animais para suas gaiolas de origem com acesso a água e comida ad libitum.</li>
</ol>7. Injeção intra-arterial
<ol><li>Lave o cateter inteiro com 70% de etanol e mergulhe durante a noite até usar. Logo antes da injeção, conecte a trava Luer da agulha com uma seringa estéril e lave todo o lado lúmen do sistema de cateter com 10 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Janela de tempo e preparação para injeção de NSC NOTA: Com base na experiência e relatórios de outras equipes de pesquisa, o tempo para injeção de NSC é crucial para a sobrevivência de ambos os sujeitos e NSCs exógenos. Em nosso estudo piloto, a injeção de NSCs em pontos de tempo inicial (dentro das primeiras 6h após a reperfusão) levou a uma maior mortalidade. Assim, testamos pontos de tempo de injeção posteriores e determinamos a janela de tempo entre 2 d (48 h) a 3 d (72 h) após o acidente vascular cerebral é seguro e tolerável para animais, e é eficiente em alcançar a distribuição intraparenquimal de NSCs. Os resultados aqui apresentados são de animais recebidos injeção de NSC em 3 d após lesão.<ol>
<li>Coloque a taxa de injeção da bomba de seringa em 20 μL/min para ratos e 50 μL/min para ratos. A velocidade ou duração excessiva da injeção pode resultar em sobrecarga sistêmica de volume, para a qual os ratos são mais vulneráveis do que os ratos.</li>
		<li>Resumindo, em 3 d após a cirurgia de derrame, anestesiar os animais com isoflurano e colocá-los supino em uma almofada de aquecimento.</li>
		<li>Reabra a ferida cervical e exponha novamente o ECA, ICA e CCA(Figura 5, passo 1). Como nas cirurgias de derrame, determine a rota de injeção com base na espécie. Utilize a CCA para injeção de NSC no mouse, e o ECA para o rato23.</li>
	</ol></li>
	<li>Injeção intra-arterial através da CCA no mouse<ol>
<li>Coloque duas suturas de nylon trançadas 6-0 sob a CCA. Crie um slipknot solto com cada um deles entre a bifurcação e os nós inferiores da cirurgia anterior do derrame(Figura 5, passo 2).</li>
		<li>Aperte o slipknot superior e faça uma pequena incisão acima do nó inferior(Figura 5, passo 3). Insira um cateter MRE010 através da incisão(Figura 5, passo 4) e fixe com o nó médio sem bloquear o fluxo de injeção(Figura 5, passo 5). O fluxo de sangue deve ser visível no cateter ao liberar o nó superior e ajustar a posição do cateter.</li>
		<li>Coloque um clipe de vaso no ECA, injete 1 x 106 GFP-NSCs através deste cateter a 20 μL/min por 5 min com uma bomba de seringa, seguido por uma descarga com 50-100 μL de PBS na mesma velocidade.</li>
		<li>Após a injeção, liga a CCA acima da incisão com o nó de deslizamento superior e retire o cateter MRE010(Figura 5, passo 6). Aperte e corte o nó médio e o nó superior. Remova o clipe do vaso do TCE. Consulte a imagem final na Figura 5, passo 7.</li>
		<li>Feche a ferida com sutura cirúrgica 4-0.</li>
		<li>Depois de fornecer recuperação adequada em uma almofada de aquecimento e injeção analgésica subcutânea, devolva os animais para sua gaiola doméstica.</li>
	</ol></li>
	<li>Injeção intra-arterial através do ECA em rato<ol>
<li>Ocluir temporariamente o ECA e o CCA com clipes de vasos(Figura 5, etapa 2).</li>
		<li>Faça uma pequena incisão no lado proximal do ECA (Figura 5, passo 3), insira o cateter MRE010 e fixe com um nó (Figura 5, passo 4).</li>
		<li>Remova ambos os clipes do vaso, injete 5 x 106 NSCs em 100 μL de PBS a 50 μL/min por 2 min, seguido por uma descarga com 50-100 μL de PBS(Figura 5,passo 5) na mesma velocidade, usando uma bomba de seringa motorizada.</li>
		<li>Após a injeção, oclui novamente o CCA e o ECA com clipes de vaso e liga o ECA no lado proximal da segunda incisão após a retirada do cateter de injeção(Figura 5, etapa 6).</li>
		<li>Retire os dois clipes do vaso(Figura 5, passo 7) e feche a ferida com sutura cirúrgica 4-0.</li>
		<li>Depois de fornecer recuperação adequada em uma almofada de aquecimento e injeção analgésica subcutânea, devolva os animais para sua gaiola doméstica.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio histológico<ol>
<li>Coletar cérebros de camundongos e ratos que receberam derrame isquêmico seguido de injeção de NSCs ou solução de veículo após eutanásia e perfusão intracardiac com 4% de paraformaldeído a 1 d (rato e rato), 7 d (rato) e 30 d (rato) após injeção. Cada um desses quatro grupos consistiu em 5 NSC e 5 animais injetados por veículos.</li>
		<li>Conserte cérebros durante a noite e criopreserve em 30% de sacarose por 3 d.</li>
		<li>Incorpore os cérebros em OCT, corte a 40 μm de espessura e examine a distribuição de NSCs após a imunostenção com marcadores específicos de células, incluindo proteína ácida fibrilar gliana (GFAP, astrócitos), Tuj1 (neurônios maduros) e doublecortin (DCX, neurônios imaturos). NOTA: Devido à falta de uma cepa de rato que expressa GFP, utilizamos o DII, um rótulo fluorescente transitório, para NSCs de ratos, que permite apenas observação relativamente de curto prazo. Assim, a distribuição do NSC só foi examinada em 1 d após o derrame em ratos.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001(2013).</li>
<li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li>
<li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system%3A+Design+considerations+and+emerging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology+International%22%5BJournal%5D)">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li>
<li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intracerebroventricular+%28ICV%29+injection+of+autologous%2C+non-engineered%2C+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+%28ADSVF%29+for+neurodegenerative+disorders%3A+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li>
</ol>

A terapia com células-tronco para doenças neurológicas ainda está em estágio exploratório precoce. Uma questão importante é que não há um método estabelecido para a entrega suficiente de SCs ou NSCs no cérebro.
Embora SCs/NSCs exógenos possam ser detectados no cérebro após injeção intravenosa (IV), intraperitoneal (IP) ou intraparenquimal/intracerebral, cada abordagem de entrega tem desvantagens. Estima-se que a população detectável dentro do cérebro seja muito baixa com injeção periférica (IV...

A terapia com células-tronco (SC) tem um enorme potencial como tratamento para doenças neurológicas, incluindo acidente vascular cerebral, traumatismo craniano e demência1,,2,3,4,,5,6. No entanto, um método eficiente para fornecer SCs exógenos ao cérebro doente permanece problemático2,6,7,8,9,10,11,12,13. As SCs entregues através de rotas de entrega periféricas, incluindo injeção intravenosa (IV) ou intraperitoneal (IP), estão sujeitas à filtragem de primeira passagem na microcirculação, especialmente no pulmão, fígado, baço e músculo8,,9,,13,,14, aumentando as chances de acúmulo de células em áreas não-alvo. O método de injeção intracerebral invasivo resulta em danos localizados no tecido cerebral e uma distribuição muito restrita de SCs perto do local da injeção2,6,,8,,14,15,,16. Recentemente estabelecemos um método de injeção intra-arterial à base de cateter para fornecer SCs neurais exógenos (NSCs), que é descrito aqui aplicado em um modelo de roedor de derrame isquêmico focal. Induzimos lesão transitória (1 h) isquemia-reperfusão em um hemisfério usando um filamento revestido de borracha de silicone para ocluir a artéria cerebral média esquerda (MCA) no camundongo ou rato17,,18,,19. Neste modelo, observamos de forma reprodutiva aproximadamente 75-85% a depressão do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) no hemisfério ipsilateral com Laser Doppler ou Laser speckle imaging17,19, gerando déficits neurológicos consistentes17,,18,,19.
Para fins de economia de tempo, o vídeo é definido para jogar em duas vezes a velocidade normal e procedimentos cirúrgicos de rotina, como preparação da pele e fechamento de feridas com sutura e o uso e configuração da bomba de seringa motorizada não são apresentados. O método de entrega intra-arterial de NSCs é demonstrado no contexto do modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) de derrame experimental em roedores. Por isso, incluímos o procedimento de derrame isquêmico transitório, a fim de demonstrar posteriormente como a segunda cirurgia, a injeção intra-arterial, é realizada utilizando o local cirúrgico anterior no mesmo animal. A viabilidade da entrega intra-arterial de NSC em modelos de curso de roedores é demonstrada pela avaliação da distribuição e sobrevivência de NSCs exógenos. A eficácia da terapia NSC para atenuar a patologia cerebral e disfunção neurológica será relatada separadamente.

<table><tbody><tr><td>Agulha 20 G</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305175</td><td>preparação de cateter de injeção</td></tr><tr><td>26 G agulha</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305111</td><td>preparação do cateter de injeção</td></tr><tr><td>27 G agulha</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305136</td><td>preparação do cateter de injeção</td></tr><tr><td>4-0 NFS-2 sutura com agulha</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56905</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>6-0 sutura de nylon</td><td>Teleflex/Braintree Scientific</td><td>104-s</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td> lâmina de <td>solução de descolamento celular</td></tr><tr><td></td><td>Bard-Parker</td><td>10</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>Buprenorfina-SR Lab</td><td>ZooPharm</td><td>Buprenorfina-SR Lab&reg;</td><td>Analgesia (0,6-1 mg/kg acima de 3 D)</td></tr><tr><td>PBS livre de cálcio/magnésio</td><td>VWR</td><td>02-0119-0500</td><td>NSC dissociação</td></tr><tr><td>DCX anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB2253</td><td></td></tr><tr><td>imunocoloração GFAP anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>180063</td><td>imunocoloração</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50562-1</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>MCAO filamento para camundongo</td><td>Doccol</td><td>702223PK5Re</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>Filamento MCAO para ratos</td>, <td>Doccol</td><td>503334PK5Re</td>, <td></td></tr><tr><td>cirurgia MRE010, cateter</td><td>Braintree Scientific</td>, <td>MRE010</td>, <td>preparação do cateter de injeção</td></tr>, <tr><td>cateter MRE025</td>, <td>Braintree Scientific</td><td>MRE025</td>, <td>preparação do cateter de injeção</td></tr>, <tr><td>MRE050, cateter</td><td>Braintree Scientific</td>, <td>MRE050</td>, <td>preparação do cateter de injeção</td></tr>, <tr><td>Nu-Tears Pomada</td><td>NuLife Pharmaceuticals</td><td>Nu-Tears Pomada</td><td>cuidados com os olhos durante a cirurgia</td></tr><tr><td>S& Pinça T - Pontas SuperGrip JF-5TC Angular</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>S& T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Pacer Technology</td><td>15187</td> preparação da bomba de seringa <td>do cateter de injeção</td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>Tuj1 anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAb1637</td><td>imunocoloração</td></tr><tr><td>de dois componentes epóxi de 5 minutos</td><td>Devcon</td><td>20445</td><td>preparação do cateter de injeção Tesoura de</td></tr><tr><td>mola Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>braçadeiras vasculares</td><td>Fine Science Tools</td><td>00400-03</td><td>cirurgia</td></tr><tr><td>Microscópio Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td>microscopia</td></tr></tbody></table>

entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

A terapia com células-tronco neurais (NSC) é um tratamento inovador emergente para derrame, lesão cerebral traumática e distúrbios neurodegenerativos. Em comparação com a entrega intracraniana, a administração intra-arterial de NSCs é menos invasiva e produz uma distribuição mais difusa de NSCs dentro do parênquim cerebral. Além disso, a entrega intra-arterial permite o efeito de primeira passagem na circulação cerebral, diminuindo o potencial de captura de células em órgãos periféricos, como fígado e baço, uma complicação associada a injeções periféricas. Aqui, detalhamos a metodologia, tanto em camundongos quanto em ratos, para a entrega de NSCs através da artéria carótida comum (rato) ou artéria carótida externa (rato) para o hemisfério ipsilateral após um derrame isquêmico. Usando NSCs rotulados por GFP, ilustramos a distribuição generalizada alcançada em todo o hemisfério ipsilateral de roedores em 1 d, 1 semana e 4 semanas após a entrega pós-isquêmica, com maior densidade dentro ou perto do local de lesão isquêmica. Além da sobrevivência a longo prazo, mostramos evidências de diferenciação de células rotuladas por GFP em 4 semanas. A abordagem de entrega intra-arterial descrita aqui para NSCs também pode ser usada para administração de compostos terapêuticos, e, portanto, tem ampla aplicabilidade a variados modelos de lesões e doenças de CNS em várias espécies.

Os NSCs rotulados por GFP foram prontamente detectados no cérebro isquêmico, principalmente no hemisfério ipsilateral, especialmente na penumbra e ao longo da borda da lesão(Figura 6). O examinador ficou cego durante a imagem e análise.
Por exemplo, a 1 d após a injeção, os NSCs foram detectados dentro do hipocampo do rato. Um subconjunto de NSCs mostrou co-expressão do marcador de neurônio imaturo DCX no giro dentado mesmo neste momento inicial<strong class="xfig...

Um método para fornecer células-tronco neurais, adaptáveis para soluções ou suspensões injetáveis, através da artéria carótida comum (mouse) ou artéria carótida externa (rato) após o derrame isquêmico ser relatado. As células injetadas são distribuídas amplamente por todo o parenchyma cerebral e podem ser detectadas até 30 d após o parto.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

O AVC é a principal causa de mortalidade e incapacidade em todo o mundo. Embora a trommólise e a remoção cirúrgica da oclusão vascular cerebral possam ser realizadas em pacientes selecionados, ainda há uma necessidade urgente de terapias eficazes contra o AVC. Aqui, demonstramos uma entrega intra-arterial baseada em cateteres de células-tronco para o hemisfério isquêmico como um regime potencial para a terapia de derrame.Primeiro, introduzimos como preparar o cateter de injeção e ganchos cirúrgicos. Projetamos dois tipos de cateteres de injeção para injeção intra-arterial. O design um é usado para injeção de uma solução ou suspensão que não exija descarga do tubo.O design dois permite a injeção de células-tronco neurais, seguido por uma descarga do volume morto para entregar o volume total. Para construir um conjunto de cateteres de injeção, você precisará de 26 agulhas de calibre e 20, um comprimento de 10 a 15 centímetros de cateter MRE 25 e três centímetros de comprimento de cateter MRE 50 e MRE 10. Corte as duas pontas da agulha e polir a extremidade metálica na lixa para reabrir o tubo e suavizar as bordas e, em seguida, lavar com água destilada para limpar o furo e lavar os d

intra-arterial-delivery-neural-stem-cells-to-rat-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve um método não-viral de entrega de construções genéticas para uma determinada área do cérebro de roedores vivos. O método consiste na preparação de plasmídios, fabricação micropipeta, a cirurgia de rato neonatal filhote, microinjeção da construção,...

Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

O modelo de injeção de sangue autólogo de hemorragia intracerebral em camundongos descritos neste protocolo usa a técnica de injecção dupla para minimizar o risco de refluxo de sangue até a faixa de agulha, não anticoagulantes no sistema de bombeamento, e elimina todo o espaço morto e tubos expansíveis no sistema.

Injeção de sangue autólogo de Modelo hemorragia intracerebral espontânea em ratos

Ligadura da artéria cerebral média (MCA) é uma técnica para estudo da isquemia cerebral focal em modelos animais. Neste método, o da artéria cerebral média é exposto por craniotomia e ligados por cauterização. Este método dá volumes infarto altamente reprodutível e aumentou as taxas de sobrevivência pós-operatória em comparação com outros métodos disponíveis.

A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse

Modelos pré-clínicos de hemorragia intracerebral são utilizados para imitar certos aspectos da doença clínica. Assim, mecanismos de lesão e potenciais estratégias terapêuticas podem ser explorados. Neste protocolo, dois modelos de hemorragia intracerebral são descritos, injeções intraestriatais (gânglios da base) de sangue autólogo ou colagenase.

Injection intraestriatal de sangue autólogo ou Clostridial colagenase como modelos murinos de hemorragia intracerebral

Este artigo descreve a metodologia para a administração de curtos períodos de hipóxia intermitente para pós-natal 1-8 dia ratinho ou um rato filhotes. Esta abordagem suscita efectivamente um nível do tecido robusto "efeito priming" sobre as células progenitoras neurais em cultura que são colhidas no prazo de 30 min de exposição hipóxia.

Entrega de<em&gt; In Vivo</em&gt; Aguda intermitente hipóxia em Neonatal Roedores ao primeiro-subventricular Zona derivados de culturas de células progenitoras neurais

Para estudar a reorganização cerebral em condições patológicas, usamos bombas miniosmóticas para entrega direta de proteínas no cérebro, contornando a barreira hematoencefálica. Os traçadores do trato são então injetados para estudar alterações na conectividade cerebral sob a influência da proteína.

Implantação de miniosmóticas Bombas e Entrega de Tracers Trato de Estudar Reorganização do cérebro em condições fisiopatológicas

As células estaminais são portadores terapêuticos promissores para tratar tumores cerebrais devido ao seu tropismo intrínseco de tumor. A entrega de células estaminais intranasais não invasivas ultrapassa a barreira hematoencefálica e demonstra um forte potencial de tradução clínica. Este artigo resume os princípios básicos da administração de células estaminais intranasais em um modelo de glioma de mouse.

Entrega intranasal de células-tronco terapêuticas para Glioblastoma em um modelo de mouse

Aqui, descrevemos um método para entregar drogas ao sistema nervoso central do rato implantando um cateter no espaço intrathecal lombar da espinha. Nós nos concentramos na entrega de oligonucleotídeos antisenso, embora este método seja adequado para a entrega de outras modalidades terapêuticas também.

Entrega intrathecal de oligonucleotides do antisense no sistema nervoso central do rato

As células-hastes são continuamente investigadas como tratamentos potenciais para indivíduos com danos do miocárdio, no entanto, sua diminuição da viabilidade e retenção dentro do tecido lesionado pode afetar sua eficácia a longo prazo. Neste manuscrito descrevemos um método alternativo para a entrega de células-tronco em um modelo murino de lesão de reperfusão de isquemia.

Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

O reparo da artéria intracarótida em um modelo de camundongo após a injeção retorna o fluxo sanguíneo para a artéria sem afetar negativamente a distribuição do material injetado. O reparo no local da injeção facilita as injeções subsequentes através da mesma artéria e previne a isquemia cerebral em cepas de camundongos que não possuem um Círculo de Willis completo.

Facilitando injeções intracarotídeas repetidas em modelos de camundongos por uma nova técnica de reparo no local da injeção

Aprenda a entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de camundongos e ratos após acidente vascular cerebral isquêmico. Este método permite distribuição ampla e detecção das células por até 30 dias.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

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