Name: Imagem e Análise de Lesões inteiras de aorta manchadas de óleo em um modelo de rato de hiperlipidemia aneurisma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprenda a quantificar lesões ateroscleróticas em camundongos hiperlipidêmicos usando coloração Oil Red O. Este método permite análise qualitativa e quantitativa da carga aterosclerótica em modelos animais.

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Este trabalho foi apoiado, em parte, por um Consórcio Conjunto de Biologia Microgrant fornecido sob a concessão do NIH P30AR070253 (P.-Y.C.), e HL135582 (M.S.). Somos gratos a R. Webber e L. Coon por manter os ratos usados neste estudo.

mT/mG (estoque nº 007676) e camundongos Apoe-/- (estoque nº 002052) foram comprados no Laboratório Jackson. Os ratos Myh11-CreERT2 foram um presente de Stefan Offermanns (disponível no Laboratório Jackson como estoque nº 019079). Os ratos Tgfbr2fl/fl foram obtidos de Harold L. Moses (Universidade Vanderbilt). Todos os procedimentos animais foram realizados por meio de protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale.
1. Ratos
<ol><li>Produzir MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- e MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- camundongos como descrito anteriormente7. Criar cepas mutantes para o fundo C57BL/6J por mais de dez gerações. NOTA: A linha de camundongos Myh11-CreERT2 cre fornece uma ferramenta poderosa para estudar o papel das células musculares lisas na homeostase vascular e na patologia vascular. O alelo Cre é inserido no cromossomo Y; assim, camundongos fêmeas não expressam essa construção.</li>
</ol>2. Genotipagem de camundongos, indução de tamoxifen e alimentação de dieta rica em gordura
<ol><li>Realize a genotipagem do mouse usando DNA de orelha do mouse e análise pcr. O DNA da orelha do rato deve ser isolado usando o kit de isolamento de DNA de sangue e tecido (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Os primers do PCR estão listados na Tabela 1.</li>
	<li>Induzir a recombinação de Cre-Lox por injeção de tamoxifen a 1 mg/dia i.p. por 5 dias em MYH11-CreERT2 de 6 semanas de idade;mT/mGf/f; Apoe-/- e MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- ratos machos.</li>
	<li>Induzir aterosclerose colocando camundongos machos de 8 semanas de idade (2 semanas após o tratamento de tamoxifen) em uma dieta HCHF (40% de gordura kcal, 1,25% colesterol, 0% ácido cholic) por 16 semanas.</li>
</ol>3. Reagentes e preparação da ferramenta de dissecação
<ol><li>Estocagem Red O preparação da solução: dissolver 1 g de Óleo Vermelho O em 100 mL de álcool isopropílico.</li>
	<li>Preparação da solução De Óleo De Trabalho Vermelho O: misture 24 mL de estoque Solução Oil Red O com 16 mL de dH2O. Filtrar o óleo diluído Vermelho O com filtros de seringa estéril de 0,45 μm (a solução só é boa para 1-2 h).</li>
	<li>60% de preparo isopropílico de álcool: misture 60 mL de álcool isopropílico com 40 mL de dH2O.</li>
	<li>4% de formaldeído em 1x preparação de DPBS: diluir 10 mL de formaldeído de 16% em 30 mL de 1x DPBS.</li>
	<li>Limpe todas as ferramentas de dissecção com 70% de etanol (Figura 1).</li>
</ol>4. Eutanásia (Figura 2A)
<ol><li>Meça o peso do rato antes da eutanásia.</li>
	<li>Eutanize o rato por injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina (cada mililitro contém 10 mg/mL de cetamina e 2 mg/mL de xilazina).</li>
	<li>Coloque o mouse em posição supina (face-up do lado da barriga).</li>
</ol>5. Abertura da cavidade torácica e abdominal e perfusão cardíaca (Figura 2B)
<ol><li>Prepare uma seringa de 10 mL com 10 mL de 1x DPBS. Boné com uma agulha de 25 G. A seringa será usada para dar descarga no coração.</li>
	<li>Segure a pele com pinças (Estilo 5) e corte com uma tesoura fina da base do abdômen até a parte superior do pescoço.</li>
	<li>Abra a parede abdominal abaixo da caixa torácica.</li>
	<li>Levante o esterno com pinças (Estilo 5) e corte o diafragma, depois corte a caixa torácica para expor a cavidade torácica.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão no átrio direito do coração.</li>
	<li>Perfuse através da punção ventricular esquerda apical injetando lentamente 10 mL de 1x DPBS. Uma vez completamente perfundido, o fígado e o rim tornam-se castanhos claros na cor.</li>
	<li>Limpe a cavidade torácica de sangue e fluidos íntegros usando uma esponja não tecida para absorver o material.</li>
</ol>6. Isolamento da aorta e dos ramos (Figura 2C)
<ol><li>Remova órgãos (ou seja, pulmão, fígado, baço e órgãos gastrointestinais e reprodutivos) e corte a clavícula usando pinças (Estilo 5) e tesoura fina enquanto deixa o coração, rim e aorta intactos in situ. NOTA: Certifique-se de não dilacerar o coração ou quaisquer vasos sanguíneos principais.</li>
	<li>Coloque o mouse sob um estereótipo.</li>
	<li>Os ramos de aorta e aorta incluem artérias braquiocefálicas, artérias carótidas, artérias subclávias, artérias renais, artérias ilíacas comuns e artérias femorais usando pinças (Estilo 4) e tesouras de mola. NOTA: Cubra a aorta com uma esponja molhada e não tecida para evitar a desidratação enquanto disseca os galhos de aorta.</li>
	<li>Disseque cuidadosamente e remova o adiposo avencionário e o tecido conjuntivo ao redor dos galhos de aorta e aorta usando pinças (Estilo 4) e tesouras de mola. NOTA: Como a inflamação é proeminente no aneurisma hiperlipidemia, é difícil remover a adventitia. Tenha cuidado para não rasgar ou cortar os galhos de aorta e aorta. Este passo requer prática e paciência.</li>
</ol>7. Fixação de coração e aorta (Figura 2D,E)
<ol><li>Prepare uma seringa de 10 mL com 10 mL de 4% de formaldeído em 1x de DPBS. Boné com uma agulha de 25 G. ATENÇÃO: O formaldeído é perigoso. Leia o MSDS antes de trabalhar com este produto químico. Use luvas e óculos de segurança e produza as soluções de diluição dentro de um capô de fumaça. NOTA: 4% da solução de formaldeído degrada-se ao longo do tempo. É importante usar formaldeído de 4% recém-feito para fixação.</li>
	<li>Fixar a árvore vascular através de punção ventricular esquerda apical injetando lentamente 10 mL de formaldeído de 4%. NOTA: A fixação do formaldeído interfere em várias aplicações a jusante, como cultura celular, análise FACS e análise de sequenciamento de RNA unicelular. Pule esta etapa se a aorta for usada para qualquer uma dessas aplicações.</li>
	<li>Limpe a cavidade torácica de qualquer fluido íntegro com uma esponja não tecida para absorver o material.</li>
	<li>Separe o coração da aorta segurando o coração com pinças (Estilo 4) e usando uma tesoura de mola micro-dissecando. NOTA: Para realizar en face Oil Red O mancha após esta etapa, recomenda-se cortar a aorta aberta in situ em vez de ex vivo e seguir para a seção 8. Isso torna mais fácil para a aorta en face para deitar plana.</li>
	<li>Isole e extirpa a aorta e seu major de 1 mm acima da artéria carótida até o final da artéria femoral usando pinças (Estilo 4) e tesoura de mola.</li>
	<li>Transfira o vaso para uma placa de cera de Petri ou tubo de microcentrifutura de 1,5 mL e encha com 1x DPBS até cobrir a aorta. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>8. Manchas e imagens de aorta inteira não aberta (Figura 3)
<ol><li>Coloque o recipiente em uma placa de cera de Petri usando pinos minutien (Figura 3A).</li>
	<li>Enxágüe o vaso uma vez com 1x DPBS.</li>
	<li>Despeje 25 mL de solução fresca de Óleo Vermelho O na placa de Petri (Figura 3B). NOTA: (1) Isopropanol é perigoso e um líquido inflamável. Use equipamentos de proteção individual adequados. (2) A solução Oil Red O pode facilmente precipitar. As partículas precipitadas podem interferir com a coloração subsequente. É importante remover o precipitado filtrando a solução Oil Red O através de um filtro de 0,45 μm antes de usar. (3) É melhor preparar a solução de O Vermelho-O fresco e descartar qualquer solução nãousada. (4) Além do Óleo Vermelho O, o Sudão IV é outro composto químico usado para coloração de lipídios, triglicérides e lipoproteínas. No entanto, o O Vermelho Óleo tem gradualmente substituído o Sudão IV porque a cor vermelha produzida pelo Óleo Vermelho O é mais intensa e pode, assim, tornar a gordura muito mais fácil de ver.</li>
	<li>Manche a aorta por 60 min em temperatura ambiente (RT). Óleo Vermelho O manchará placa rica em lipídios vermelho, deixando outras não-placas contendo áreas pálidas de cor.</li>
	<li>Lave uma vez por 20 min com isopropanol de 60% na RT. NOTA: O excesso de lavagem pode desestabilizar a placa.</li>
	<li>Enxágüe a aorta 3x com dH2O por 5 minutos para remover isopropanol.</li>
	<li>Sob um estereótipo, limpe suavemente todo o tecido adiposo perivascular ao redor da aorta usando pinças (Estilo 4) e tesoura de mola (Figura 3C,D). NOTA: É importante limpar todo o tecido adiposo perivascular ao redor da aorta e seus ramos após a coloração, pois o tecido adiposo perivascular manchado de óleo pode produzir fundo falso e interferir na morfometria da placa e quantificação da área da placa. Certifique-se de não remover uma parte da parede aórtica. Encha o prato de cera com dH2O até cobrir a aorta manchada durante a limpeza. Este passo requer prática e paciência.</li>
	<li>Transfira a nave para um escorregador de microscópio de vidro limpo.</li>
	<li>Adquira micrografias digitais usando uma câmera conectada a um microscópio de luz. Salvar imagens de alta resolução, de preferência em formato de arquivo de imagem marcado (TIFF) (Figura 3E). NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Para evitar que a aorta seque, transfira o vaso para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e encha com 1x DPBS até cobrir a aorta. Armazenar a 4 °C.</li>
</ol>9. En face aorta mounting (Figura 4, Figura 5)
<ol><li>Transfira o recipiente para uma placa de cera de Petri e encha com 1x DPBS até cobrir a aorta.</li>
	<li>Corte as artérias carótidas, subclávias do arco aórtico e artérias ilíacas na aorta abdominal 1-2 mm após bifurcações. Corte as artérias renais. (Figura 4A)</li>
	<li>Corte longitudinalmente a preparação da aorta ao longo da curvatura interna (Figura 4B1) e sozinho artérias ilíacas (Figura 4B2) com tesoura de mola micro-dissecando.</li>
	<li>Abra os três ramos do arco aórtico (ou seja, innominado, carótida comum, artéria subclávia esquerda) ao longo da curvatura maior até o nível base de curvatura interna (x-mark) (Figura 4B3-B8) com tesoura de mola micro-dissecando.</li>
	<li>Fixar a aorta plana (face-up lado do lúmen) em um prato de cera com pinos de minutien e aplicar 1x DPBS até cobrir a aorta para evitar que ela seque (Figura 4C). NOTA: (1) É importante deixar a aorta enrolada e fixá-la no rosto sem esticar. Esta etapa levará alguns dias dependendo da gravidade da aterosclerose. (2) Para aortas de animais Apoe//- ou Ldlr-/- recomenda-se fixar o plano de aorta por 24 h. (3) O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Limpe os slides do microscópio de vidro com 70% de etanol e limpadores de tarefas delicados (Figura 5A).</li>
	<li>Transfira a aorta para um slide de microscópio de vidro limpo e coloque 15 gotas de composto de temperatura de corte ideal (OCT) em outro slide de microscópio de vidro limpo (Figura 5B).</li>
	<li>Coloque cuidadosamente o slide do microscópio de vidro com composto OCT sobre a aorta e evite prender bolhas de ar no slide (Figura 5C).</li>
	<li>Rotule os slides com nomes de amostra (Figura 5D). NOTA: Os slides montados na aorta podem ser armazenados na câmara de umidade a 4 °C por vários meses.</li>
</ol>10. Imagem e quantificação da lesão da aorta en face (Figura 6)
<ol><li>Adquira micrografias digitais usando uma câmera conectada a um microscópio de luz. Salvar imagens de alta resolução, de preferência em formato de arquivo de imagem marcado (TIFF) (Figura 6A).</li>
	<li>Transfira imagens da aorta en manchada inteira para um computador equipado com software ImageJ.</li>
	<li>No ImageJ, selecione a ferramenta "Seleção à mão livre" e circule toda a placa manchada de Óleo Vermelho O manualmente (pontos vermelhos intensos) enquanto pressiona a tecla "Alt" (para PC Windows) ou "Shift" (para Mac). Em seguida, clique em "Medir" no menu "Analisar" para exibir áreas de lesão na janela de resultado (Figura 6B à esquerda). NOTA: Existem várias armadilhas da quantificação das lesões ateroscleróticas: (1) quaisquer pequenos pedaços de gordura aventurra manchada que permaneceram presos à aorta a partir do passo 8.7 podem produzir fundo falso e interferir na quantificação da placa; (2) remover uma parte da parede aórtica ou danificar a aorta das etapas 6.4 e 8.7 pode interferir na quantificação da placa; (3) bolhas e dobras formadas na aorta após a montagem (etapa 9.8) podem interferir na quantificação da placa; e (4) a placa aterosclerótica é um fenômeno 3D, e medições realizadas em um plano 2D podem não refletir a verdadeira extensão da placa. Além da análise da área da placa en face aorta, recomenda-se analisar o tamanho da placa na raiz aórtica, artéria braquiocefálica, aorta ascendente e aorta abdominal separadamente8.</li>
	<li>Circule a linha de borda externa da aorta e clique em "Medir" no menu "Analisar" para exibir a área de aorta na janela de resultado (Figura 6B à direita).</li>
	<li>Exporte todas as medidas para um arquivo Excel.</li>
	<li>Calcule a razão da área da placa a partir da área total da aorta e normalize o valor como a porcentagem da área total da superfície de O Vermelho-Óleo.</li>
	<li>Calcule a razão da área da placa em camundongos Apoe-//- e 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe. Apresentar os dados como média ± SEM (Figura 6C).</li>
	<li>Realize um teste t de um aluno não verificado para análise estatística da razão de dados da área da placa em comparação com outro grupo de camundongos. Considere as diferenças nos valores médios como significativas em p < 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li>
<li>Emini Veseli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).</li>
<li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71, 343-353 (1992).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258, 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).</li>
<li>Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE-deficient+mice+develop+lesions+of+all+phases+of+atherosclerosis+throughout+the+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree.</a> Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+reprogramming+in+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms.</a> Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).</li>
<li>Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil+Red+O+and+Hematoxylin+and+Eosin+Staining+for+Quantification+of+Atherosclerosis+Burden+in+Mouse+Aorta+and+Aortic+Root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TGF-beta+signalling+drives+vascular+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).</li>
<li>Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+mechanical+homeostasis+in+arterial+aging+and+associated+cardiovascular+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences.</a> Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Apolipoproteína E (Apoe) e os camundongos deficientes do receptor de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr) são úteis para estudar o desenvolvimento e o tratamento da aterosclerose. Os pesquisadores podem avaliar o impacto da genética e manipulações terapêuticas na iniciação, progressão e regressão de doenças relacionadas à aterosclerose, progressão e regressão usando a coloração de Óleo Vermelho O de toda a aorta9. A coloração de O vermelho e a quantificação da lesão é o ponto f...

A doença arterial coronariana, uma das principais causas de mortalidade nos EUA, é geralmente causada pela aterosclerose, um processo que leva ao acúmulo de placa dentro de paredes arteriais1. Camundongos deficientes de hiperlipidemia e ldlr são centrais para as investigações de aterosclerose e suas complicações e desenvolvimento de terapias2,3,4,5. A quantificação de lesões ateroscleróticas a partir de uma aorta en face é uma importante análise de ponto final para avaliar o impacto da manipulação genética em diferentes tipos de células. Também ajuda a estudar novas terapias projetadas para afetar a iniciação, progressão e regressão da doença aterosclerótica. Lesões ateroscleróticas podem se formar em qualquer lugar da aorta e seus ramos (ou seja, braquiocefálicas, carótidas e subclávias no peito, bem como artérias renais, ilíacas comuns e femorais abaixo do diafragma)6. Uma avaliação abrangente da carga de aterosclerose e da terapia adequada requer a avaliação da carga da doença em diferentes locais, um desafio que muitas vezes é negligenciado.
Este protocolo descreve como realizar uma análise abrangente das lesões ateroscleróticas, começando com uma aorta inteira não aberta e procedendo para en preparação facial, em um único rato. A coloração inteira de aorta vermelha o óleo não aberto permite uma avaliação rápida e qualitativa de placas carregadas de lipídios em toda a aorta e seus ramos, enquanto a preparação facial fornece uma avaliação quantitativa da distribuição da lesão aterosclerótica na aorta do rato.
A técnica utiliza camundongos de 8 semanas com uma exclusão TGFβR2 específica para células musculares lisas no fundo apoe/- hiperlipidêmico (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe/-; a partir de agora referido como ratos TGFβR2iSMC-Apoe) e controles de amuleto Apoe-/- (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe/-; a partir de agora referido como Apoe-/- ratos). Os animais são mantidos por 16 semanas em uma dieta rica em colesterol alto (HCHFD) como materiais de estudo7. No término do estudo, as aortas inteiras não abertas são manchadas e imagens (incluindo todos os principais ramos) com O Vermelho Óleo para avaliação qualitativa de placas carregadas de lipídios. As aortas são cortadas através da preparação do rosto, e todas as lesões ateroscleróticas são imagens e quantificadas. Este protocolo pode ser usado para estudar o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas nos modelos de camundongos de hiperlipidemia apoe/ou Ldlr/- hiperlipidemia e estendido a aplicações gerais de biologia vascular relacionadas à aorta.

<table><tbody><tr><td>Tubo Eppendorf de 1,5 mL</td><td>DENVILLE</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldeído</td><td>Polysciences</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>VWR</td><td>RC2546.70-5</td><td>Para limpar as ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Cera de dissecação preta</td><td>CR Scientific</td><td>C3541</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de milho</td><td>Sigma</td><td>C8267</td><td>Solvente para Tamoxifeno</td></tr><tr><td>DNeasy Sangue & Kit de lenços</td><td>QIAGEN</td><td>69506</td><td>Para isolar o DNA da orelha de camundongo</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (1X DPBS), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>14059-11</td><td>Para cortar a pele do rato e abrir a caixa torácica</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro liso Fisherbrand Economy Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Dieta rica em gordura com alto teor de colesterol</td><td>Dietas de pesquisa</td><td>D12108</td><td>Para induzir aterosclerose</td></tr><tr><td>Imagem software</td><td>National Institutes of Health</td><td>Imagem J</td><td>Quantificação de lesões aórticas</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>VWR</td><td>JT9079-5</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Para limpar as lâminas do microscópio de vidro</td></tr><tr><td>Tesoura de mola de microdissecação McPherson-Vannas</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5602</td><td>Para separar o coração e a aorta e abrir a aorta e os ramos</td></tr> <tr><td>da aortaSoftware de controle de microscópio</td><td>Olympus</td><td>DP Controller</td><td>Para imagem de aorta</td></tr><tr><td>Pinos Minutien</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Agulha-25G</td><td>BD</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>Esponja Não Tecida</td><td>McKesson</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Vermelho O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td>Para manchar as lesões de aterosclerose</td></tr><tr><td>Seringa Estéril Pall Acrodisc Filtros com Super Membrana</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td>Para filtrar a solução de trabalho Óleo Red O</td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>15021-15</td><td>Para dissecar e limpar a aorta</td></tr><tr><td>Software estatístico</td><td>GraphPad</td><td>Prism 8</td><td>Análise estática</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td>Para dissecção da aorta</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Para imagens da aorta</td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>Para induzir a recombinação Cre-loxP</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Estilo 4</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>0302-4-PO</td><td>Para cortar a pele do rato e abrir a caixa torácica</td></tr><tr><td>Pinça Estilo 5</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>0302-5-PO</td><td>Para dissecar e limpar a aorta</td></tr></tbody></table>

imagem e análise de lesões inteiras de aorta manchadas de óleo em um modelo de rato de hiperlipidemia aneurisma

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoproteína E (Apoe)- ou receptor de lipoproteína de baixa densidade (Ldlr)-camundongos hiperlipidêmicos deficientes são os dois modelos mais usados para pesquisa de aterosclerose. Eles são usados para estudar o impacto de vários fatores genéticos e diferentes tipos de células na formação de lesões ateroscleróticas e também testar o desenvolvimento de novas terapias. Isolamento, excisão de toda a aorta e quantificação de lesões ateroscleróticas manchadas de óleo são métodos morfométricos básicos utilizados para avaliar a carga aterosclerótica. O objetivo deste protocolo é descrever um método cirúrgico otimizado, passo a passo para dissecar, perfuse-fix, isolar, manchar, imagem e analisar lesões ateroscleróticas em aortas de camundongos com O Vermelho Óleo. Como lesões ateroscleróticas podem se formar em qualquer lugar em toda a árvore aórtica, todo este método de coloração de aorta- vermelha orta tem a vantagem de avaliar placas carregadas de lipídios em toda a aorta e todos os ramos em um único rato. Além da coloração de Óleo Vermelho O, aortas inteiras isoladas frescas podem ser usadas para variedade de experimentos in vitro e in vivo e isolamentos celulares.

Neste protocolo, foram analisadas lesões ateroscleróticas em camundongos TGFβR2iSMC-Apoe após 4 meses em uma dieta HCHF7. Além da aterosclerose extensiva, esses camundongos desenvolveram aneurismas de aoórtica torácica e abdominal, como relatado anteriormente. Em comparação com os camundongos Apoe-/- camundongos, as paredes aórticas de camundongos TGFβR2iSMC-Apoe apresentaram aterosclerose grave, dificultando a dissecação das lesões (Figura</st...

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para analisar a carga aterosclerótica em camundongos. Os investigadores podem usar este protocolo para comparar a abundância, localização e tamanho das lesões ateroscleróticas em diferentes animais.

Imagem e Análise de Lesões inteiras de aorta manchadas de óleo em um modelo de rato de hiperlipidemia aneurisma

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

A quantificação de lesões ateroscleróticas em apoE e outros tipos de camundongos hiperlipidêmicos é fundamental para a avaliação de vários fatores genéticos e novas terapias. Nosso protocolo fornece instruções passo a passo para análise da carga aterosclerótica de forma qualitativa e quantitativa em um único mouse. 16 semanas depois de induzir aterosclerose, antes de perfumar o coração, carregar uma seringa de 10 mililitros com 10 mililitros de DPBS e prender uma agulha de calibre 25.Levante a pele abdominal do rato experimental com pinças e use uma tesoura fina para cortar a pele da base do abdômen até a parte superior do pescoço. Abra a parede abdominal abaixo da caixa torácica e use a pinça para levantar o esterno para acessar o diafragma. Corte o diafragma e corte a caixa torácica para expor a cavidade torácica.Em seguida, faça uma pequena incisão no átrio direito do coração e injete lentamente todo o volume de DPBS na punção ventricular esquerda apical. O fígado e o rim vão ficar castanhos claros. Quando toda a solução salina tiver sido perfundida, use uma esponja não enrolada para limpar a cavidade torácica de qualquer sangue e fluido extrainoso.Depois que a cavidade torácica

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A análise ex vivo de lesões arteriais de modelos animais de doenças cardiovasculares classicamente depende de técnicas histológicas e imuno-histoquímicas. Estes fornecem medições bidimensionais em lesões tridimensionais. Este manuscrito descreve a geração de lesões arteriais para análise quantitativa em 3 dimensões usando tomografia de projeção óptica.

Geração e quantificação 3-Dimensional de Arterial lesões em ratos por meio de tomografia óptica de Projeção

Descrevemos procedimentos para quantificar e caracterizar lesões ateroscleróticas em modelos de camundongos usando secção de precisão do seio aórtico e da aorta ascendente combinada com análise histoquímica e imuno-histoquímica.

Análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino

Este vídeo mostra dois modelos de desenvolvimento íntima placas nas artérias murino e enfatiza as diferenças de hiperplasia miointimal e aterosclerose.

Induzir miointimais Hiperplasia Versus aterosclerose em camundongos: uma introdução de dois modelos válidos

Os modelos animais provaram ser ferramentas valiosas para a definição de acolhimento e de patógenos mecanismos específicos que contribuem para o desenvolvimento da inflamação crônica. Aqui nós descrevemos um modelo do rato de infecção oral com o patógeno humano Porphyromonas gingivalis e metodologias detalhe para avaliar a progressão da inflamação em sites locais e sistêmicos.

Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

Descreveremos um protocolo para induzir a aterosclerose na raiz da aorta de ApoE- / - ratos alimentados com uma dieta aterogênico, através de uma contínua liberação de aldosterona. Também são descritos métodos para caracterizar a composição da placa bacteriana.

Indução de ateroma através da ativação de receptores de mineralocorticoide em camundongos deficientes em Apolipoprotein E

Propomos um protocolo padronizado para caracterizar a composição celular do tarde-estágio lesões ateroscleróticas murino, incluindo métodos sistemáticos de dissecação animal, incorporação de tecido, corte, coloração e análise das artérias Braquiocefálica de ratos de rastreamento do linhagem de células de músculo liso atheroprone.

Análise quantitativa da composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas de ratos de rastreamento de linhagem celular músculo liso

Os modelos murinos de aterosclerose são ferramentas úteis para investigar vias patogênicas em nível molecular, mas necessitam de quantificação padronizada do desenvolvimento da lesão. Este protocolo descreve um método aperfeiçoado para determinar o tamanho da lesão nos vasos arteriais principais que incluem a raiz aórtica, o arco aórtico, e a artéria braquiocefálico.

Quantificação da aterosclerose em camundongos

Aqui, apresentamos protocolos otimizados de limpeza de tecido para obter imagens da aorta murina em três dimensões (3D). Delineamos procedimentos de última geração para imunocoloração, limpeza óptica e imagem com a intenção de definir a proximidade anatômica do sistema nervoso periférico com placas ateroscleróticas e a adventícia na aterosclerose.

Imagem tridimensional de tecidos aórticos na aterosclerose

Este protocolo fornece uma metodologia abrangente para a análise quantitativa de placas ateroscleróticas para facilitar pesquisas mais aprofundadas sobre os mecanismos e a progressão da aterosclerose.

Isolamento e análise de lesões do arco aórtico e da raiz em um modelo de camundongo aterosclerótico

Um modelo de camundongo experimental de metástase óssea foi estabelecido após a entrega intracardíaca da luciferase expressando células tumorais mamárias. Desenvolvimento do tumor e resultou lesão osteolítica foram monitorados longitudinalmente, com a bioluminescência e CT micro imagem.

Monitoramento metástases tumorais e lesões osteolíticas com bioluminescência e CT Micro Imagem

Aprenda a quantificar lesões ateroscleróticas em camundongos hiperlipidêmicos usando coloração Oil Red O. Este método permite análise qualitativa e quantitativa da carga aterosclerótica em modelos animais.

Imagem e Análise de Lesões inteiras de aorta manchadas de óleo em um modelo de rato de hiperlipidemia aneurisma

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