Name: 一种基于DNA/Ki67的流式细胞术测定法，用于接种疫苗的小鼠抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学习基于DNA/Ki67的流式细胞术方法，用于分析接种疫苗小鼠脾脏和淋巴结中抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期动态。该技术可准确检测增殖中的T细胞，无需体内药物处理或细胞转移的干扰，适用于疫苗接种、感染、自身免疫疾病及癌症免疫治疗研究。

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本工作由 Reithera、意大利大学与研究部（MIUR）项目 2017K55HLC_006，以及意大利癌症研究协会（AIRC）的 5 × 1000 项目资助。&#160;以下四聚体由美国国立卫生研究院（NIH）四聚体核心设施获得：APC 标记的 H-2K(d) HIV gag 197-205 AMQMLKETI。

<ol><li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li>
<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+T+cells%3A+foot+soldiers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li>
<li>Bajénoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highways%2C+byways+and+breadcrumbs%3A+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunology%22%5BJournal%5D)">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li>
<li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD8+response+on+autopilot%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li>
<li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Naïve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li>
<li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+and+memory+T-cell+differentiation%3A+implications+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li>
<li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer%3A+making+sense+of+T-cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li>
<li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li>
<li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow%3A+survival+or+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271(2016).</li>
<li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+niches+in+the+bone+marrow%3A+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li>
<li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary%3A+Memory+CD8%28%2B%29+T+cells+colocalize+with+IL-7%28%2B%29+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102(2016).</li>
<li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735(2019).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes & Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li>
<li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Report%22%5BJournal%5D)">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li>
<li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li>
<li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li>
<li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li>
<li>Mouse phenotype. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020).</li>
<li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+time+of+CD8%2B+T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423(2010).</li>
<li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li>
<li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425(2013).</li>
</ol>

A. Folgori 和 S. Capone 是 Reithera Srl 公司的员工。A. Nicosia 是专利申请 WO 2005071093 (A3) &#34;Chimpanzee adenovirus vaccine carriers.&#34; 的署名发明人。其余作者无任何利益冲突需要披露。

尽管T细胞克隆扩增已被广泛研究，但仍有一些方面尚不明确，主要原因在于可用于研究该过程的工具较少且各自存在局限性。基于这一背景，我们建立了一种高灵敏度的流式细胞术方法，用于在小鼠模型中分析疫苗接种后早期抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期。该方案基于Ki67与DNA染色相结合的方法，此前该方法曾用于分析小鼠骨髓造血细胞的细胞周期13,14。为了将该方案适用于抗原特异性CD8 T细胞，我们必须考虑若干关键问题，包括DNA染料的选择、获得不同样本间可比DNA染色效果的适当条件，以及数据分析的设门策略。
可用于DNA染色的染料有多种，包括碘化丙啶和7-氨基放线菌素D；我们选择Hoechst是因为它与膜染色兼容，并且适用于Ki67染色所需的温和固定和透化方案。同时，使用Hoechst染色能够获得高质量的DNA直方图，即G0/G1和G2/M期DNA峰的变异系数（CV）明显低于使用其他DNA染料（如DRAQ519）通常获得的DNA峰。事实上，Hoechst甚至可以在活细胞中对DNA进行染色20。
为避免同一次实验中不同样本的Hoechst荧光强度出现波动，我们采用了一些策略。Hoechst染色应在流式细胞仪检测前立即进行，以最大限度减少染料随时间推移而发生的荧光衰减。对于希望在包含大量样本的大规模实验中重复本方案的研究者，我们建议每次仅对少量样本进行Hoechst染色。另一个明显的缺点是，细胞数量在染色孵育过程中会对Hoechst荧光强度产生显著影响。因此，我们强烈建议在DNA染色时，每个样本始终使用相同数量的细胞和相同的体积。如果流式细胞仪检测需要较多细胞，我们建议制备两个或更多完全相同的样本，并在Hoechst染色步骤前将它们合并。
该实验方案的一个关键点在于数据分析的设门策略。我们近期发表了一种在免疫应答早期阶段分析T细胞的新策略，该策略提高了抗原特异性T细胞检测的灵敏度12。我们对本文所示数据应用了该策略，具体步骤如下：首先，在DNA-A/W图中排除细胞聚集体；其次，在排除死细胞后，我们在FSC/SSC图中使用了一个相对宽泛的淋巴细胞门（&#34;宽松设门&#34;）。通过该策略，我们能够纳入那些通常被现有设门策略遗漏的、处于S-G2/M期的高度活化的抗原特异性CD8 T细胞，因为这些细胞具有较高的FSC-A和SSC-A信号。总之，数据分析是该方法中的关键环节，对于实现对抗原特异性活化/增殖T细胞的高灵敏度检测至关重要。
该方法可避免在免疫应答早期阶段遗漏关键的T细胞数据，为T细胞免疫监测开辟了新的前景。未来的一个改进方向是加入磷酸化组蛋白3的染色，从而能够区分G2期与M21期。目前的局限性在于，为了对核标记物Ki67进行染色，细胞必须经过固定和透化处理，因此无法用于其他类型的分析，例如分选及后续的功能分析。此外，包括Hoechst在内的DNA染料通常会干扰基因组DNA分析，不适用于此类评估。若能鉴定出与不同细胞周期阶段相关、且可在活细胞表面染色的膜标记物，则有望克服这一局限。总之，该方法在疫苗接种、感染、免疫介导性疾病以及免疫治疗等多种情境下，对活化/增殖T细胞的评估具有广阔的应用潜力。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Lymph node, spleen, bone marrow flow cytometry workflow; staining, fixation, data analysis diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Flow cytometry process diagram; lymph node and bone marrow cell staining, Ki67, DNA with Hoechst 33342." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

初始T细胞在抗原启动后会发生克隆扩增和分化。分化后的T细胞表现出效应功能，这些功能对于清除抗原以及维持抗原特异性记忆至关重要，而后者是实现长期保护的关键。在初次免疫应答的早期阶段，初始T细胞与淋巴器官内特定微环境中抗原提呈细胞（APCs）的相互作用，对于诱导大量T细胞增殖（即克隆扩增阶段的特征）具有决定性作用1,2,3。T细胞与APC之间的相互作用受到抗原浓度与持续性、共刺激信号以及可溶性因子（如细胞因子和趋化因子）的精细调控，这些因素共同影响T细胞克隆后代的数量和质量4,5,6,7。
尽管对T细胞克隆扩增已进行了大量研究，但目前仍不清楚抗原致敏的T细胞是否在抗原识别位点完成整个细胞周期，还是在细胞周期进展过程中迁移至其他器官。这一知识空白源于现有细胞周期分析工具的局限性&#160;。这些工具包括针对核标记物Ki67的单克隆抗体（mAbs），以及能够识别已进入细胞周期S期的细胞的细胞染料（例如&#160;溴脱氧尿苷（BrdU）），或用于区分子代细胞与其祖先细胞的染料（例如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE））。
然而，细胞标记染料（如 CFSE 和 BrdU）无法确定在特定器官中发现的细胞是局部增殖，还是在分裂后迁移至该部位8,9。此外，细胞核内蛋白 Ki67 仅能区分处于 G0 期（Ki67 阴性细胞）与处于其他任何细胞周期阶段（Ki67 阳性细胞）的细胞。因此，Ki67 分析无法区分处于活跃增殖状态（即 S、G2 或 M 期）的细胞与处于 G1 期的细胞，后者可能迅速进入分裂，也可能长期停留在 G1 期或返回静息状态10,11。
本文介绍了一种新的流式细胞术方法，用于分析接种疫苗小鼠脾脏和淋巴结（LNs）中抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期12（图1）。该方法利用了Ki67与DNA染色的联合应用，此前该组合已被用于分析小鼠骨髓（BM）造血细胞的细胞周期13,14。在此，我们将Ki67联合DNA染色与近期发表的创新性设门策略12相结合，成功应用于CD8 T细胞克隆扩增的分析。我们能够清晰地区分接种疫苗小鼠脾脏&#160;及引流淋巴结中处于G0期、G1期以及S-G2/M期的抗原特异性CD8 T细胞。

<table><tbody><tr><td>1-200 &amp;mu;L型通用适配散装吸头</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>CLS4866-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2 抗 Fc&amp;gamma;R mAb&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>553141</td><td>10 &amp;mu;g/ml 终浓度</td></tr><tr><td>5 ml 注射器推杆</td><td>BD Emerald&amp;nbsp;</td><td>307733</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>默克密理博&amp;nbsp;</td><td>SBHA025SB</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养皿（TC处理）</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m细胞滤筛&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>96孔透明圆底经组织培养处理的微孔板</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>抗大鼠/仓鼠Ig,k/阴性对照补偿微粒</td><td>BD-生物科学</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>BUV805 大鼠抗小鼠 CD8a&amp;nbsp;</td><td>BD-生物科学</td><td>564920</td><td>4 &amp;mu;g/ml 终浓度</td></tr><tr><td>不含钙不含镁的杜氏磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120159</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>34852-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐溶液（EDTA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>康宁</td><td>35-079-CV</td><td></td></tr><tr><td>Filcon，无菌，注射器式 70 &amp;mu;m</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>可固定的活力染料 eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>1:1000 终浓度</td></tr><tr><td>Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>该套装包含固定/透化浓缩液、稀释液以及10倍浓度的透化缓冲液</td></tr><tr><td>H-2k(d) AMQMLKETI 别藻红蛋白（APC）标记四聚体</td><td>由美国国立卫生研究院四聚体核心设施提供</td><td></td><td>6 &amp;mu;g/ml 终浓度</td></tr><tr><td>H-2k(d) AMQMLKETI 藻红蛋白（PE）标记五聚体</td><td>Proimmune&amp;nbsp;</td><td>F176-2A-E - 176</td><td>10 &amp;mu;L / 样本&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342三盐酸盐三水合物 - 水溶液（10 mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 单克隆抗体（SolA15），FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5698-82</td><td>5 &amp;mu;g/ml 终浓度</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 100倍浓度（200 mM）</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HA 滤器 0.45 &amp;micro;m</td><td>BD</td><td>340606</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100X</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 抗小鼠 CD62L 抗体</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>104418</td><td>0.2 &amp;mu;g/ml 终浓度</td></tr><tr><td>PerCP-Cy&amp;trade;5.5 仓鼠抗小鼠 CD3e&amp;nbsp;</td><td>BD-生物科学</td><td>551163</td><td>4.4 &amp;mu;g/ml 终浓度</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯管</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>不含L-谷氨酰胺含酚红的RPMI 1640培养基</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>用于分析流式细胞术数据的软件包</td><td>FlowJo</td><td>v.10</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪样本采集软件</td><td>BD FACSDiva&amp;nbsp;</td><td>v 6.2</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Euroclone</td><td>ECM0990D</td><td></td></tr></tbody></table>

基于dna/ki67的流式细胞术检测法用于分析疫苗接种小鼠中抗原特异性cd8 t细胞的细胞周期

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

体内抗原特异性T细胞的细胞周期已通过少数几种方法进行研究，但这些方法均存在一定的局限性。溴脱氧尿苷（BrdU）可标记处于S期或近期完成S期的细胞，而羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）可在细胞分裂后用于检测子代细胞。然而，这些染料无法在分析时确定细胞所处的细胞周期时相。另一种方法是利用Ki67，这是一种在细胞周期各时相中均有高表达、但在静息期G0除外的标记分子。0遗憾的是，Ki67 无法进一步区分处于 S 期并已承诺进入有丝分裂的细胞与处于 G 期的细胞1 可以保持在此阶段, 进入细胞周期循环，或进入G期0.
此处，我们描述了一种用于捕获的流式细胞术方法 &#34;快照&#34; 小鼠次级淋巴器官中不同细胞周期阶段T细胞的分析。该方法结合了Ki67与DNA染色、主要组织相容性复合物（MHC）-肽-多聚体染色以及一种创新的设门策略，使我们能够成功区分处于G0，在 G1 以及在 S-G 期2细胞周期中脾脏的M期&#160;并在接种携带人免疫缺陷病毒（HIV）-1模型抗原gag的病毒载体后，获取小鼠的引流淋巴结。
该方法的关键步骤包括DNA染料的选择以及设门策略的优化，以提高检测的灵敏度，并纳入那些按照当前分析标准容易被遗漏的高度活化/增殖的抗原特异性T细胞。DNA染料Hoechst 33342能够实现G0/G1期与G2/M期DNA峰之间的高质量区分&#160;，同时保持细胞膜及细胞内染色的完整性。该方法在增进对体内T细胞应答的理解以及改进免疫监测分析方面具有巨大潜力。

根据图1中总结的方案，使用荧光DNA染料Hoechst和抗Ki67单克隆抗体对Balb/c小鼠脾脏、淋巴结和骨髓中细胞的细胞周期时相进行了分析。该染色方法可区分细胞周期的以下各时相：G0期（Ki67阴性，DNA含量为2N，定义为DNAlow）、G1期（Ki67阳性，DNAlow）以及S-G2/M期（Ki67阳性，DNA含量介于2N至4N之间，或等于4N，定义为DNAintermediate/high）。
我们首先对骨髓（BM）细胞进行细胞周期分析，以重现先前已发表的结果13,14，然后分析目标细胞，即CD8 T细胞。图2展示了骨髓细胞细胞周期分析的一个典型示例（图2A）。该方案获得的G0/G1和G2/M期DNA峰的变异系数（CV）较低，表明DNA染色质量优异（图2B显示了一个CV &lt; 2.5的示例；在所有实验中，CV始终 &lt; 5）。
随后，我们将相同的方案应用于接种疫苗小鼠的抗原特异性CD8 T细胞。使用携带HIV-1 gag抗原的Chad3-gag进行初次免疫，并用MVA-gag进行加强免疫，对BALB/c小鼠进行疫苗接种。在加强免疫后第3天（d3），我们分析了脾脏和引流淋巴结中gag特异性CD8 T细胞的频率。我们采用了新近定义的免疫应答早期T细胞设门策略，该策略与传统方法不同，适用于检测高度活化的抗原应答性CD8 T细胞12。该新策略分为五个连续步骤执行。第一步，通过DNA-A/-W设门排除双联体或聚集体；第二步，通过排除死细胞标记物鉴定活细胞。第三步，采用一种非传统的“宽松”FSC-A/SSC-A设门（图3A），而非经典的狭窄淋巴细胞设门，以识别目标细胞群体12。在圈定CD3+CD8+细胞后（图3A的第4步），我们使用两种不同的MHC多聚体（即Pent-gag和Tetr-gag）鉴定gag特异性CD8 T细胞（图3A的第5步）。我们使用两种多聚体而非一种，以提高在接种疫苗小鼠中检测gag特异性CD8 T细胞的灵敏度，同时不增加未处理小鼠的染色背景（图3B 和 C，第5步）。因此，我们成功区分了未处理小鼠（淋巴结和脾脏中抗原特异性CD8 T细胞分别为0.00%和0.00%）与接种疫苗小鼠（淋巴结和脾脏中抗原特异性CD8 T细胞分别为0.46%和0.29%，图3B 和 C）。
值得注意的是，该方案使我们在未经处理小鼠的淋巴结和脾脏中抗原特异性CD8 T细胞门控内的背景信号极低（通常为0.00%，最高为0.02%）。对gag特异性和非gag特异性FSC-A / SSC-A图谱的比较显示，gag特异性细胞具有较高的SSC-A和FSC-A值。图3D)，证实了使用“宽松”的FSC-A/SSC-A门控来捕获这些细胞的必要性。随后，我们评估了不同细胞周期阶段中gag特异性CD8 T细胞的比例（图4A). 我们发现，脾脏中的gag特异性CD8 T细胞以及引流淋巴结中更高比例的细胞处于S-G期2加强免疫后第3天的M期细胞比例分别为18.60%和33.52%。
此外，我们将同一器官中gag特异性的CD8 T细胞与总CD8 T细胞叠加分析发现，处于S-G2/M期的gag特异性CD8 T细胞具有较高的FSC-A和SSC-A（图4B）。如预期的那样，gag特异性CD8 T细胞的CD62L表达水平较低，提示其为活化状态的T细胞，仅在淋巴结（LNs）中少数处于G0期的细胞例外（图4C）。综上所述，这些结果证实了“宽松”设门策略（图3A、B和C的步骤3）对于包含所有正在增殖的抗原特异性CD8 T细胞是必需的12。该方案对于在分析时“快照式”评估抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期阶段，以及不同细胞周期阶段细胞的CD62L表达情况极为有价值。
<img alt="流式细胞术流程图，详细说明细胞染色和数据分析步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1： 抗原特异性CD8 T细胞细胞周期分析实验方案示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示DNA含量和细胞周期各时相的流式细胞术分析示意图，包含设门数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：骨髓细胞的细胞周期分析。来自未处理Balb/c小鼠的骨髓细胞经染色后通过流式细胞术进行分析。（A） 设门策略示例。我们在DNA-A/-W图中首先设门选择单个细胞（左图），然后通过排除死细胞染料信号选择活细胞（中图）。随后，使用“宽松”的FSC-A/SSC-A门选所有骨髓细胞（右图）。（B） 骨髓细胞细胞周期分析示例（左图）。我们联合使用Ki67和DNA染色来鉴定处于以下细胞周期时相的细胞：G0期（左下象限，Ki67neg-DNAlow细胞）、G1期（左上象限，Ki67pos-DNAlow）、S-G2/M期（右上象限，Ki67pos-DNAintermediate/high）。图中同时展示了Ki67单克隆抗体的荧光减一（FMO）对照（中图）和DNA直方图（右图）。在DNA直方图中，左侧和右侧门分别对应G0/G1和G2/M期的DNA峰，数字表示各峰的变异系数（CV）。在其余所有图中，数字表示指定门内细胞所占的百分比。该图展示了5次独立实验中1次的代表性结果。每次实验中，我们分析了来自3只小鼠的混合骨髓细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术，CD8 T细胞，淋巴细胞，疫苗接种，gag特异性细胞，数据分析，点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：来自淋巴结和脾脏的抗原特异性CD8 T细胞分析。 Balb/c小鼠通过肌内注射（i.m.）用Chad3-gag进行初次免疫，并用MVA-gag进行肌内加强免疫。加强免疫后第3天，收集已免疫小鼠和未处理对照小鼠的引流淋巴结及脾脏细胞，经染色后通过流式细胞术进行分析。（A） 分步设门策略示意图，共五个步骤：识别单细胞（步骤1）；活细胞（步骤2）；淋巴细胞（步骤3）；CD8 T细胞（步骤4）；以及gag特异性细胞（步骤5）。（B-C） 分析图表示例：（B） 未处理（上图）和已免疫（下图）小鼠淋巴结细胞分析结果，（C） 脾脏细胞分析结果。在步骤1中，我们通过DNA-A/-W图识别单细胞；在步骤2中，通过排除死细胞染料信号选择活细胞；在步骤3中，我们采用一种非经典的“宽松”设门方式圈选淋巴细胞；在步骤4中，通过CD3和CD8的双表达识别CD8 T细胞；在步骤5中，根据细胞是否能够结合荧光标记的H-2kd-gag-五聚体（Pent-gag）或H-2kd-gag-四聚体（Tetr-gag），分别鉴定为gag特异性细胞或非gag特异性细胞。（D） 按上述设门策略分析后，gag特异性细胞（蓝色）与非gag特异性细胞（灰色）在FSC-A/SSC-A图中的分布情况。数字表示相应门内细胞所占百分比。本图展示的是5次独立实验中1次的代表性结果。每次实验中，我们分析了来自3只已免疫小鼠和3只未处理小鼠的合并脾脏细胞与合并淋巴结细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示淋巴结和脾脏细胞周期时相的流式细胞术分析；Ki67、DNA-A 图谱结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：抗原特异性 CD8 T 细胞的细胞周期分析。 小鼠的免疫方案同 图 3 所示，在加强免疫后第 3 天进行 gag 特异性细胞的细胞周期分析，分析前按 图 3 所示进行 5 步设门。 (A) 来自免疫小鼠淋巴结（上方）和脾脏（下方）的 gag 特异性 CD8 T 细胞细胞周期分析示例。细胞周期时相的划分方法同 图 2B。图中各图显示处于 G0、G1 和 S-G2/M 期（左侧）的细胞，以及 Ki67 单克隆抗体的荧光减一（FMO）对照（右侧）。数值表示指定设门区域内细胞的百分比。 (B) FSC-A/SSC-A 散点图，显示来自免疫小鼠淋巴结（上方）和脾脏（下方）的 gag 特异性 CD8 T 细胞处于 S-G2/M 期（红色）叠加在全部 CD3+CD8+ T 细胞（灰色）上的情况。 (C) 偏移直方图，显示来自免疫小鼠淋巴结（上方）和脾脏（下方）的 gag 特异性 CD8 T 细胞在 G0 （绿色）、G1（蓝色）和 S-G2/M 期（红色）时 CD62L 的表达水平。y 轴表示标准化后的事件数。该图展示了 5 次独立实验中 15 只小鼠的 1 个代表性示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充材料：流式细胞仪设置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

克隆扩增是抗原特异性T细胞反应的关键特征。然而，对抗原应答T细胞的细胞周期研究较少，部分原因是技术上的限制。本文介绍了一种流式细胞术方法，用于分析接种疫苗小鼠脾脏和淋巴结中发生克隆扩增的抗原特异性CD8 T细胞。

基于DNA/Ki67的流式细胞术检测法用于分析疫苗接种小鼠中抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期

体内抗原特异性T细胞的细胞周期已通过少数几种方法进行研究，但这些方法均存在一定的局限性。溴脱氧尿苷……

本方案提供了一种实用的方法，利用小鼠脾脏和淋巴结来反映T细胞应答的动态变化，而不仅仅是提供稳态下的表型快照。该技术能够灵敏地检测正在参与应答过程的抗原特异性CD8 T细胞。在无需体内药物处理或细胞转移可能带来的干扰效应的情况下，即可对增殖中的CD8 T细胞进行测量。我们的技术可在多种情况下揭示免疫动态的变化。例如，可用于研究对疫苗接种和感染的免疫应答、自身免疫性疾病以及癌症免疫治疗。通过将10x破膜洗涤缓冲液用蒸馏水稀释，配制新鲜的1x破膜洗涤缓冲液，并使用0.45微米滤器过滤以去除聚集体。根据滴定实验结果，用1×透化洗涤缓冲液稀释单克隆抗体Ki67 FITC，每份样品最终体积为100微升。向每管细胞中加入3毫升1×透化洗涤缓冲液，并在室温下以400 ×g离心5分钟。弃去上清液。再次加入1×破膜洗涤缓冲液，离心以沉淀细胞。然后弃去上清液。向沉淀中加入100 µL稀释的单克隆抗体Ki67 FITC，涡旋混匀后于避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，用 4 毫升 1× 透化缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤后离心并弃去上清液。对于直接在流式细胞仪上检测的样品，向细胞沉淀中加入 350 微升 PBS；对于需用 Hoechst 染色 DNA 的样品，向细胞沉淀中加入 250 微升 PBS。配制 Hoechst 与 PBS 溶液，并将其加入各样品中，使终浓度为 2 微克/毫升。涡旋混匀样品，并在避光条件下孵育15分钟。然后将样品以5分钟离心，向细胞沉淀中加入350 µL PBS。打开软件，在工作区功能区点击“Create Group”，创建对应于待分析不同器官的各个组别。通过双击组名称打开已修改的组窗口，并在“synchronized”功能前插入勾选标记，以同步新创建的组。将每个FCS文件拖动到其对应的组中，然后从a-LN组开始创建设门策略。通过双击完全染色的样本打开图形窗口，以在点图中显示该样本获取的未设门事件。请注意，x轴和y轴的标签应与本手稿的流式细胞仪设置文件中表二所示的FCS文件中的标注一致。检查是否已显示足够数量的事件以实现适当的可视化效果。如有必要，单击工作区功能区中的心形图标打开首选项，选择“图形”，然后将“散点图”设为图形类型，并确认相应框中绘制的点数是否正确，或进行修改。在图形窗口中以点图形式显示未设门的事件，横轴为DNA-A，纵轴为DNA-W，两轴均使用线性刻度。如有必要，可通过点击图形窗口中靠近各坐标轴的标有“T”的方框，将刻度从对数转换为线性。在设门工具部分点击矩形，选择单个细胞群，然后在矩形门的中心双击，以在点图中显示单个细胞，其中横轴为FSC-A参数，纵轴为死细胞染料信号。点击多边形以选择活细胞群体，该群体对死细胞染料呈阴性。在多边形门的中心双击，以在点图中显示细胞，其中横轴为FSC-A参数，纵轴为SSC-A参数。单击矩形区域，创建一个宽松门控以包含该图中所有单个活细胞。双击宽松门控的中心，将在点图中显示细胞，其中 x 轴为 CD3，y 轴为 CD8。在图形窗口中使用适当的刻度进行可视化显示。如有需要，可单击靠近各坐标轴的标有 T 的框，选择“自定义访问功能”，根据需要调整负对数级（含底数）和正对数级的刻度范围。通过单击多边形选择 CD3+CD8+ 细胞。在 CD3+CD8+ 门控中心双击，即可在点图中显示细胞，其中 x 轴为 Tetr-gag，y 轴为 Pent-gag。通过点击多边形来选择抗原特异性的 CD8 T 细胞。在 gag 特异性门控区域的中心双击，以在点图中显示细胞，其中 x 轴为 DNA-A，y 轴为 Ki67。在图形窗口的门控工具部分点击“Quad”，以选择处于不同细胞周期阶段的细胞。将一个样本中创建的设门策略复制到相应组，以将门应用于该组的所有样本。然后按照文本稿件中的描述，复制b-脾脏组和CBM组的设门策略。验证这三个组中每个样本的设门是否均合适。如有需要，按照文中的描述去同步化该细胞群并调整门控。在点图中显示宽松门控下的骨髓细胞，横轴为DNA-A，纵轴为Ki67。通过点击工作区功能区中的“布局编辑器”来可视化结果。将样本窗格中设门策略的每个门拖动到布局编辑器中，并按照设门顺序放置各个图。如有需要，可通过在布局中双击相应图并在图形定义窗口中选择适当的类型来更改图形类型。单击分组，并利用布局功能区上的函数进行迭代，以可视化各器官中抗原特异性CD8 T细胞的实验结果，并比较不同样本。观察代表阳性对照的骨髓细胞结果。此处展示了一个典型的骨髓细胞周期分析示例。该方案获得的G0至G1期以及G2至M期DNA峰的变异系数较低，表明DNA染色质量优良。采用五步门控策略来鉴定抗原特异性的CD8细胞。使用两种多聚体以提高在免疫小鼠中检测gag特异性CD8 T细胞的灵敏度，同时不增加未处理小鼠中的染色背景。在加强免疫后第3天，引流淋巴结和脾脏中的gag特异性CD8 T细胞中有较高比例的细胞处于S-G2/M期。此外，将处于 S-G2/M 期的 gag 特异性 CD8 T 细胞叠加到同一器官的全部 CD8 T 细胞时，其 FSC-A 和 SSC-A 值较高。偏移直方图显示，gag 特异性 CD8 T 细胞的 CD62L 表达水平较低，符合活化 T 细胞的预期特征，仅在淋巴结中少数处于 G0 期的细胞例外。该方法旨在使 T 细胞在进行细胞膜和 Ki67 染色的同时，获得高质量的 DNA 染色效果。流式细胞术数据分析是关键环节。务必使用适当的对照来确定设门位置。利用该方法，我们发现了小鼠和人外周血中处于细胞周期S期至G2/M期的T细胞。该技术在1型糖尿病、传染性单核细胞增多症和新冠肺炎的免疫监测研究中具有重要应用价值。

a-dnaki67-based-flow-cytometry-assay-for-cell-cycle-analysis-antigen

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科研

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