Derivatização de Cristais de Proteína com I3C usando Triagem de Matriz Microseada Aleatória
16 de janeiro de 2021
Este artigo apresenta um método para gerar cristais proteicos derivados com I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic ácido) utilizando microseeding para gerar novas condições de cristalização em telas de matriz esparsas. As bandejas podem ser configuradas usando robôs de distribuição de líquidos ou à mão.
Este é um protocolo de cristalização projetado para otimizar o crescimento de um cristal proteico ao mesmo tempo em que deriva a proteína com uma molécula de eliminação para determinar a estrutura de uma proteína por cristalografia de raios-X. Para determinar a estrutura cristalina de raios-X de uma proteína completamente nova, as condições de cristalização são otimizadas para produzir cristais de qualidade. No caso de uma proteína completamente nova, átomos pesados precisam ser introduzidos no cristal para produzir um cristal derivado.
Os dados de difração de raios-X são coletados do cristal derivatizado e devem ser computacionalmente resolvidos para produzir uma estrutura de cristal de raios-X. Cristalização e derivitação são processos trabalhosos. Para enfrentar esses gargalos, elaboramos um procedimento de triagem otimizado que simultaneamente alcança esses dois objetivos.
Este protocolo usa uma técnica previamente desenvolvida conhecida como triagem de matriz microseada aleatória. Cristais ou precipitados cristalinos são esmagados em microseeds que podem ser usados para iniciar o crescimento de cristais em condições completamente independentes. Ao mesmo tempo, introduzimos uma molécula de eliminação chamada I3C na condição de cristalização.
Esta molécula fornece um grande sinal anômroo que permite que a estrutura seja resolvida por uma única discussão anômroa de comprimento de onda. Para usuários não familiarizados com o dimensionamento experimental de estruturas de cristal, apresentamos um pipeline de software fácil de usar para automatizar parcialmente a solução de estrutura adaptando-a para usar o sinal anômo do I3C. O primeiro passo é criar um estoque I3C.
Meça 120 miligramas de I3C em um tubo de microcentrífuga. Adicione 200 microliters de dois hidróxido de lítio molar ao tubo de microcentrífuga. O aquecimento do tubo a 40 a 60 graus e o vórtice podem ser usados para incentivar a dissolução.
O único estoque molar da solução I3C de lítio deve ser marrom. Dois métodos podem ser usados para introduzir o I3C no estoque de proteínas. O lítio I3C pode ser adicionado diretamente ao estoque de proteínas.
3,75 microlitres a 30 microliters de I3C podem ser adicionados a 150 microliters de proteína para dar uma concentração entre cinco e 14 mililamores. Algumas proteínas podem precipitar-se após o contato com altas concentrações de I3C. Nestes casos, o lítio I3C pode ser adicionado a um tampão de diluição proteica que é tampão correspondendo a proteína amostral a uma concentração final entre 10 a 80 mililitros.
Adicione 150 microliters do tampão de diluição proteica a 150 microliters de amostra de proteína. Uma sonda de vidro para esmagar cristais é feita de uma pipeta Pasteur de vidro. Com um bico de Bunsen na chama azul, aqueça a pipeta Pasteur em direção ao meio.
Usando um par de pinças, puxe as extremidades da pipeta Pasteur para fora em um diâmetro fino de menos de 0,3 milímetros. Segure esse segmento na chama para separar a pipeta neste ponto e contornar a extremidade da pipeta para finalizar a sonda de vidro. Este é um exemplo de como a pipeta de vidro deve parecer.
Esmagamentos de cristal também podem ser encomendados de fornecedores de terceiros como uma alternativa para fazer o seu próprio estoque de microseado A é gerado esmagando cristais de proteína ou precipitados cristalinos. Coloque cinco tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL no gelo. Sob um microscópio leve, selecione os melhores cristais de morfologia ou precipitados cristalinos que podem ser sacrificados.
Para 96 bandejas de cristalização bem abra o poço cortando a fita de vedação de plástico. Para pendurar bandejas de gota, o deslizamento da tampa pode ser removido usando pinças e invertido em uma superfície plana. Transfira 70 microliters de solução de reservatório para um dos tubos de microcentrifuuagem e esfrie no gelo.
Para os tubos restantes, transfira 90 microliters de solução de reservatório para ele e retorne ao gelo para esfriar. Se houver volume insuficiente de cristalização, o reservatório de cristalização pode ser feito misturando os reagentes apropriados e pode ser usado em seu lugar. Agitar os cristais na gota de cristalização usando a sonda de vidro esmagá-lo completamente.
O progresso pode ser monitorado sob o microscópio até que nenhum cristalismo ou material cristalino seja visível. Transfira todo o líquido da gota para o tubo de microcentrifuuge contendo 70 microliters de solução de reservatório. Misture por pipetting para cima e para baixo.
Transfira de dois a três microliters de mistura de volta para o poço e enxágue o poço pipetando para cima e para baixo. Transfira a mistura de volta para o tubo de microcentrifuagem. Este passo de enxágüe deve ser repetido mais uma vez.
O tubo de microcentrifuge deve ser mantido frio a partir deste ponto para a frente para evitar o derretimento das microseeds. Vórtice o tubo a velocidade máxima a quatro graus por cerca de três minutos esfriando o tubo no gelo regularmente para evitar superaquecimento. fazer uma em cada 10 diluições seriais do estoque de sementes transferindo sequencialmente 10 microliters entre as soluções de reservatório refrigerado.
Entre diluições de estoque de sementes, o tubo deve ser vórtice. Os estoques de sementes que não serão usados imediatamente, devem ser armazenados em um congelador ultra frio de menos 80 graus. Uma tela de matriz microseada bem aleatória de 96 bem aleatórias pode ser configurada usando um robô de distribuição de líquidos.
Coloque o estoque de sementes, solução de estoque de proteína suplementada com I3C e tela de cristalização no robô. Usando o robô transferir 75 microliters da tela de cristalização para a bandeja do poço 96. Adicione um microliter à queda de cristalização e 74 microliters ao reservatório.
Transfira um microliter de proteína suplementado com I3C para a queda de cristalização. Transfira 0,1 microliters de sementes para a queda de cristalização. Sele a placa usando fita de vedação.
As telas de gota suspensas podem ser configuradas em 24 bandejas de cristalização de gota suspensas. Unte as bordas dos poços de queda pendurados. Transfira 500 microliters de solução de cristalização para o reservatório.
Perto do centro de um deslizamento de tampa de vidro coloque uma gota de uma única microliter de solução de cristalização. Para esta queda, adicione um microlitra de proteína suplementada com lítio I3C e 0,1 microliters de estoque de sementes. Inverta o slide da tampa e sele bem a cristalização empurrando a tampa deslizar para dentro da graxa.
As bandejas de gota suspensas e vedação são incubadas a uma temperatura constante para permitir que os cristais se formem. Eles devem ser regularmente inspecionados sob um microscópio para crescimento de cristais. Após a obtenção de dados de difração, integrados e dimensionados conforme explicado no protocolo escrito acompanhado, o pipeline automatizado de determinação da estrutura cristalina Auto-Rickshaw pode ser usado para resolver o problema de fase e modelar a proteína.
Na página de aterrissagem auto-riquixá, clique no botão prosseguir. Digite seu e-mail institucional no formulário web Auto-Rickshaw e clique em prosseguir com a execução do Auto-Rickshaw. Para proteínas sem um modelo de moto de emologia execute o protocolo SAD de Auto-Rickshaw em modo avançado.
Digite os parâmetros necessários. Selecione proteína como o tipo de molécula. Digite o comprimento de onda de coleta de dados em angstroms.
Assim como eu como elemento de subestrutura para indicar átomos de iodo foram usados. Selecione o tipo de subestrutura I3C para indicar que I3C foi a molécula de eliminação. Selecione sub_direct como o método de determinação da subestrutura.
Selecione três como o número de subestruturas esperadas por monômero. Digite um como o limite de reserva da pesquisa de subestrutura. Isso permite que o Auto-Rickshaw determine automaticamente um corte de resolução adequado.
Digite o número de resíduos em um único monômero, grupo espacial do conjunto de dados e número de moléculas na unidade assimétrica com base no coeficiente matthews. Selecione o nível de disseminação adequado dos dados de raio-x que se adaptem às suas necessidades. Insira os dados anômalos como um arquivo de conjunto vazio.
Insira sua sequência de proteínas como um arquivo SEQ, PIR ou TXT. Digite seu endereço de e-mail institucional. Os resultados são entregues a você através de um link web enviado para o endereço de e-mail fornecido.
Se o Auto-Rickshaw não resolver a estrutura usando sua subestrutura determinada validando a subestrutura poderia ajudar na solução de problemas da estrutura. Baixe a lista de sites de átomos pesados da página de resultados do Auto-Rickshaw. É um hiperlink chamado locais átomos pesados.
Isso irá baixar um arquivo de texto com os sites de átomos pesados. Altere a extensão de arquivo do arquivo de txt para pdb. Abra o arquivo pdb em Coot.
Ligue a simetria para ver todos os átomos pesados das unidades assimétricas vizinhas. Meça as distâncias entre os átomos pesados, inclusive através de unidades assimétricas. I3C aparecerá como um triângulo equilátero com um comprimento lateral de seis angstroms.
A presença de um triângulo com essas dimensões indica que as colocações desses átomos pesados estão corretas. Se a subestrutura de execução auto-riquixá estiver incorreta, outras configurações de Auto-Rickshaw podem ser testadas conforme discutido no protocolo escrito. O método I3C RMMS foi testado em duas proteínas, a lisesoz branca de ovo de galinha usando a tela HT da Hampton Research e o domínio da proteína de lise orf11 da bacteriófago P68.
Telas completas foram configuradas para cada proteína correspondente à tela de controle sem I3C ou microseed, tela com microseado adicionado, tela com I3C, e finalmente a tela com I3C e microseed. Adicionar I3C a uma tela de cristal não parece aumentar o número de acertos de cristalização. Com a lise de ovo de galinha, o número de condições caiu de 31 para 26.
Com o domínio Orf11, uma única condição de acerto foi encontrada na tela de controle. Adicionar I3C à tela também deu um único hit nas mesmas condições. A adição de microseado ao poço resultou em um aumento significativo no número de condições de impacto, resultando em um aumento de 2,1 e 6 vezes para a lise branca de ovo de galinha e o domínio Orf11, respectivamente.
Este resultado é consistente com outros estudos que testam a RMMS. Mais importante, adicionar I3C e microseed a uma tela também aumentou o número de condições de impacto em relação à tela de controle demonstrando um aumento de 2,3 e sete vezes para a lise branca de ovo de galinha e o domínio Orf11, respectivamente. Isso demonstra que o método I3C RMMS pode produzir eficientemente novas condições para cristais derivatizados.
Cristais dessas condições poderiam ser colhidos e usados para resolver a estrutura cristalina. Tanto a estrutura do domínio de lysozyme orf11 branco de galinha poderia ser resolvida com o esfing SAD no pipeline Auto-Rickshaw, usando o sinal anômeo do I3C demonstrando a derivitação bem sucedida pela tela I3C RMMS. Apresentamos um protocolo simples e eficiente para produzir cristais de alta qualidade derivados com a molécula de corte I3C.
Minimiza o número de telas e etapas de manuseio cristalino, e, portanto, é de particular interesse para biólogos estruturais que estudam novas proteínas. Recomendamos fortemente otimizar o tamanho do cristal testando diferentes diluições de estoque de sementes que foram feitas durante a preparação do estoque de sementes. E esta etapa é concluída após as telas iniciais terem sido feitas.
O I3C está amplamente disponível e é barato comprar e, portanto, acreditamos que este método está ao alcance da maioria dos laboratórios de biologia estrutural.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo de cristalização que otimiza o crescimento de cristais de proteínas enquanto as derivatiza com I3C para cristalografia de raios X. O método emprega triagem aleatória de matriz de microssementes para melhorar as condições de cristalização.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Cristalização de proteínas
- Cristalografia de raios X
- Biologia estrutural
Fundamentos
- A cristalização é essencial para determinar estruturas proteicas.
- A derivatização com átomos pesados é necessária para a faseamento na cristalografia de raios X.
- Métodos tradicionais podem ser trabalhosos e demorados.
- Técnicas de microssementagem podem melhorar os resultados da cristalização.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo simplificado para cristalização e derivatização de proteínas.
- Introduzir I3C como uma molécula de faseamento para melhorar a determinação da estrutura por raios X.
- Fornecer um pipeline de software fácil de usar para a solução da estrutura.
Métodos Utilizados
- Preparação de soluções estoque de I3C.
- Esmagamento de cristais proteicos para criar microssementes.
- Configuração de telas de cristalização usando robôs de dispensação de líquidos.
- Monitoramento do crescimento de cristais e otimização das condições.
Principais Resultados
- Geração bem-sucedida de cristais de proteínas derivatizados.
- Melhoria das condições de cristalização através da microssementagem.
- Uso eficaz de I3C para faseamento em cristalografia de raios X.
- Automação de partes do processo de solução da estrutura.
Conclusões
- O protocolo aumenta a eficiência da cristalização de proteínas.
- A microssementagem melhora significativamente a qualidade dos cristais obtidos.
- I3C serve como um agente eficaz de faseamento para determinação estrutural.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in structural biology by combining protein crystallization with heavy-atom derivatization to enable experimental phasing for novel targets. By integrating random microseed matrix screening with I3C derivatization, it reduces the number of discrete steps required to obtain phase information, accelerating early-stage target validation. The approach supports de-risking of structural hypotheses in discovery pipelines where homology models are unavailable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables experimental phasing for novel proteins lacking homology models, supporting target validation through direct structure determination.
- Operational Value: Combines crystallization and derivatization in a single workflow, reducing hands-on time and sample handling.
- Predictive Value: The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows rapid validation of the anomalous substructure, increasing confidence in phased models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates derivatized crystal hits suitable for downstream data collection and phasing, enabling reliable electron density maps.
- Operational Value: Uses liquid dispensing robots to set up 96-well random microseed matrix screens, improving reproducibility and throughput.
- Scalability: Microseed stocks can be serially diluted and stored at -80°C, allowing reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a path from crystallization to automated structure solution via the Auto-Rickshaw pipeline, supporting preclinical target characterization.
- Mechanistic De-risking: Successful SAD phasing using I3C-derived anomalous signal validates the structural model, reducing uncertainty in target mechanism.
- Disease-Relevant System: Demonstrated on hen egg white lysozyme and Orf11 lysin domain, showing applicability to diverse protein classes including antimicrobial targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking crystallization to structure solution for targets requiring experimental phasing, particularly when computational methods fail due to lack of templates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D structure determination of novel proteins, clarifying binding sites and domain architecture.
- Screening: Produces reproducible crystallization conditions through microseeding, increasing hit rates for derivatized crystals as shown by 2.3- to 7-fold improvements over controls.
- Analytics: Outputs anomalous diffraction data suitable for SAD phasing, with substructure validation via I3C’s characteristic six-angstrom equilateral triangle.
- Translational Research: Connects to downstream validation through automated model building in Auto-Rickshaw, enabling progression to preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Microseed stocks and I3C protocols are standardized and storable, supporting platform reuse across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides experimental phase information, reducing reliance on molecular replacement and increasing success rate for novel targets.
- Operational Value: Streamlines workflow by combining two labor-intensive steps (crystallization and derivatization) into one integrated screen.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by enabling rapid structure determination.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target selection through high-quality, phased structures, supporting risk-adjusted advancement.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallization, microseeding, and handling of heavy atom compounds is required.
- Access to liquid dispensing robots, X-ray diffraction equipment, and structure solution software (Auto-Rickshaw, Coot) is necessary.
- Standardization across teams benefits from predefined I3C stock protocols and microseed storage procedures.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of I3C concentration to avoid precipitation, as noted for sensitive targets.
- Practical limitations include the need for initial crystal or precipitate to generate microseeds and the dependence on sufficient anomalous signal for SAD phasing.
