Name: Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a imobilizar tecidos de Drosophila usando coágulos de fibrina para imagem ao vivo de neurônios. Este método minimiza a deriva da amostra e permite a adição de reagentes durante a observação dinâmica de processos neurais em tempo real.

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O trabalho no laboratório Januschke é apoiado pelas bolsas de confiança Wellcome 100031/Z/12/A e 1000032/Z/12/A. A instalação de imagem tecidual é apoiada pela concessão WT101468 da Wellcome.

<ol><li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li>
<li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744(2016).</li>
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<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li>
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<li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division%2C+differentiation+and+loss%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li>
<li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li>
<li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588(2013).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%3A+An+iIternational+Journal+On+the+Molecular%2C+Supramolecular+and+Evolutionary+Aspects+of+Chromosome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li>
<li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li>
<li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li>
<li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166(2018).</li>
<li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
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<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
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 <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Imagens ao vivo de cérebros larvais de montagem d. melanogaster fornecem a oportunidade de observar divisões de células-tronco neurais assimétricas em condições próximas a um contexto fisiológico. A primeira parte do nosso protocolo introduz nossa abordagem sobre a dissecação de cérebros larvais. Como já dito13, um aspecto crítico da preparação é evitar danificar o cérebro. O aspecto mais desafiador disso é separar o cérebro dos discos imagináveis vizinhos sem puxar excessivamente o cérebro. Nossa abordagem para "cortar sem puxar" é realizar um movimento de moagem com as pontas de um par de fórceps, ou deslizar uma ponta de fórceps ao longo de duas outras pontas de fórceps segurando a conexão entre tecidos(Figura 1A) enquanto Lerit et al. descrevem movimentos semelhantes a serras com um pino dissecando. Aconselhamos o experimentador a tentar todas as abordagens e a adotar a mais adequada para si. Também sugerimos o uso de pontas de pipeta revestidas de BSA ou FCS em vez de ferramentas de dissecção para transferir cérebros isolados. O revestimento impede que os tecidos grudem no plástico e permite a transferência segura de tecidos, mantendo-os sempre completamente imersos, sem submá-los a uma possível deformação transitória, pois se apegam à ferramenta de dissecção durante a transferência. As pontas revestidas têm outras vantagens para permitir a transferência de vários cérebros ao mesmo tempo, o que é particularmente útil quando é fundamental controlar o tempo de residência das amostras dentro de um determinado meio; são adequados para a transferência de outros tecidos, mesmo os frágeis como, por exemplo, corpos de gordura; eles podem acomodar uma ampla gama de diferentes tamanhos de amostra usando pontas maiores ou cortando a extremidade da ponta.
Em seguida, este protocolo descreve o uso de coagulação de fibrinogênio para imobilizar cérebros larvais na tampa de um prato de cultura. Um cérebro é orientado dentro de uma gota de cultura média + Fibrinogen, após o qual a coagulação é induzida pela adição de Trombina. A formação de fibrina é gradual, proporcionando uma janela de tempo durante a qual a orientação da amostra pode ser ajustada, se necessário(Figura 2C). Se for necessária uma leve compressão da amostra - que aconselhamos no caso de cérebros larvais - ela também pode ser ajustada bem pressionando o coágulo mais ou menos perto da amostra durante as etapas 3.4.4 e 3.5.2. A principal vantagem deste fibrinogênio coagulando sobre o protocolo descrito em Lerit et al., em que os cérebros são montados entre uma membrana permeável a gás e uma mancha de cobertura, é a capacidade de substituir o meio de cultura durante a imagem ao vivo. Uma possível vantagem de usar uma membrana permeável a gás sobre nosso protocolo pode ser que ele fornece uma oxigenação ideal das amostras, que poderia ser mais limitada com nossa abordagem à medida que os cérebros são separados do ar pelo coágulo e algum meio. Por essa razão, embora não tenhamos avaliado o efeito da quantidade de cultura média dentro do prato de cultura, sugerimos limitar a quantidade de cultura média em cima dos coágulos, mantendo os coágulos completamente imersos.
Como a manipulação dos coágulos pode ser experimentalmente difícil e demorada, recomendamos que o experimentador primeiro pratique manipular coágulos sem amostras. Modulando o volume da queda do meio de cultura + Fibrinogênio na tampa, a concentração de Fibrinogen ou o volume e concentração de Trombina poderia ajudar a facilitar a preparação e poderia ser importante ao adaptar o protocolo a outros tipos de tecidos. Com experiência suficiente manipulando os coágulos, vários cérebros podem ser imobilizados em um coágulo, se necessário, embora complica o ajuste fino da orientação. Vários coágulos podem ser formados no deslizamento de tampas, permitindo, por exemplo, imagens de amostras de diferentes genótipos. Também é possível expor diferentes coágulos na mesma cobertura para diferentes meios culturais, embora tenha que ser tomado cuidado para nunca misturar as gotas do meio cultural que cobre os diferentes coágulos. Uma vez que os cérebros larvais estejam imobilizados e prontos para imagens ao vivo, aconselhamos seguir as recomendações de Lerit et al.13 para evitar fotodamagem excessiva. Só adicionamos a essas recomendações para não apenas manter os cérebros a 25 °C durante a imagem ao vivo com uma incubadora de estágio, mas também para pré-aqueça esta etapa por pelo menos 30 minutos antes do início da imagem. Em nossas mãos, não fazê-lo sistematicamente resulta em um forte foco à deriva.
Pode ser vantajoso em alguns contextos ser capaz de realizar microscopia correlacionada e corrigir e imunossuir uma amostra após a imagem viva. No entanto, uma limitação do uso de coágulos fibrinas é que é quase impossível isolar mecanicamente um cérebro de um coágulo sem danificá-lo. Uma possível maneira de superar essa limitação poderia ser desenvolver métodos para degradar coágulos fibrinas com Plasmin ou induzir a desmontagem do coágulo por adição de um peptídeo imitando os botões permitindo a polimerização fibrina28. Normalmente usamos coágulos fibrinos em amostras que variam de células únicas a tecidos longos de 200 μM, mas também poderíamos imobilizar com sucesso em coágulos e cérebros de imagem de abelhas adultas com mais de 3 mm de largura. O limite superior do tamanho da amostra que pode ser imobilizado em coágulos permanece a ser determinado. Da mesma forma, embora normalmente imagem amostras imobilizadas por 4 a 5 h, nós visualizamos com sucesso neuroblastos na cultura primária por até 3 dias, indicando que o coágulo pelo menos não interfere com a viabilidade a longo prazo. Pelo contrário, os coágulos podem facilitar a substituição regular do meio, requisito para imagens de longo prazo, sem a necessidade de dispositivos como bombas peristálticas para este fim. Embora não tenhamos medido os parâmetros de permeabilidade dos coágulos fibrinos, a natureza fibrosa em gel dos coágulos parece ser penetrável por moléculas permeáveis celulares. Descobrimos que Latrunculin A, Colcemid ou 1-NAPP1, ligantes HALO-tag e outros corantes padrão usados na biologia celular atingem as células no coágulo fibrina sem qualquer problema e até agora não encontraram moléculas que seriam retidas pelo coágulo, o que, no entanto, é uma possibilidade que precisa ser testada empiricamente.
Em conclusão, o uso de coágulos fibrinas fornece uma maneira confiável e relativamente fácil de implementar uma maneira de imobilizar tecidos vivos para imagens vivas. Além de sua utilidade em limitar a deriva lateral, a capacidade de mudar o meio cultural durante a imagem ao vivo tem se mostrado inestimável para nossa abordagem genética química para estudar a divisão celular assimétrica dos neuroblastos de D. melanogaster 21. Prevemos que essa técnica será benéfica para estudos em uma ampla gama de tecidos diferentes, particularmente se envolvem genética química ou, por exemplo, auto-rotulagem deproteínas 29.
Nossa macro MultiHyperStackReg conta com o plugin TurboReg ImageJ, que alinha quadros sucessivos ou fatias de uma pilha, e o plugin MultiStackReg ImageJ, que permite aplicar as transformações a outras pilhas. O MultiHyperStackReg simplesmente permite aplicar essas transformações a hiperséscimos (pilhas com pelo menos quatro dimensões). Como o uso do MultiHyperStackReg, como o descrevemos, requer muitas ações e pode ficar bastante demorado, também escrevemos a macro AutoHyperStackReg, que executa automaticamente todas as etapas descritas nas etapas 6.2 e 6.3. No entanto, ao contrário do MultiHyperStackReg, o AutoHyperStackReg atualmente não tem a possibilidade de calcular o alinhamento de uma pilha com base em uma sub-região desta pilha, uma opção que encontramos às vezes é crucial para um alinhamento satisfatório. Outra limitação do AutoHyperStackReg é que seu uso está restrito a traduções e não às outras transformações propostas pelo TurboReg e MultiStackReg, enquanto o MultiHyperStackReg pode se aplicar a um hiperstruo qualquer tipo de transformação caso o usuário precise. Futuras versões implementarão essas funções e estarão disponíveis no GitHub30. Finalmente, nossa macro de linhas rotativas fornece uma maneira fácil de medir rapidamente sinais corticais em lapsos de tempo, mesmo que o córtex mude sua posição ou orientação ao longo do tempo. Se seu modo de rastreamento ou seu modo de não rastreamento é mais adequado para análise depende da qualidade e consistência do sinal cortical. O modo de rastreamento é mais fácil de usar, pois o usuário não precisa considerar onde o córtex estará para cada ponto de tempo e pode acomodar grandes mudanças de posição e orientação ao longo do tempo. No entanto, só é adequado se o sinal cortical permanecer forte o suficiente para ser detectado durante todo o filme: uma falha em detectar qualquer outra coisa que não seja o córtex (por exemplo, um compartimento citoplasmático brilhante perto do córtex) pode comprometer a detecção para cada ponto de tempo seguinte (por exemplo, o compartimento citoplasmático se afasta do córtex e as linhas corticais podem segui-lo para o resto do lapso de tempo). O modo de não rastreamento não tem essa armadilha, pois a detecção é limitada à linha originalmente desenhada pelo usuário (por exemplo, um compartimento citoplasmônico brilhante pode fazer com que a detecção falhe por alguns pontos de tempo, mas à medida que o compartimento citoplasmônico se afasta da zona de detecção, a detecção adequada do córtex retoma), mas não se comporta bem se a posição córtex ou orientação mudar muito ao longo do tempo. O próximo recurso (que estará disponível no GitHub30) a ser desenvolvido para o modo de rastreamento será a opção de analisar apenas os pontos de tempo especificados e definir um ponto de tempo de referência (em vez do primeiro ponto de tempo) antes do qual e depois da qual a detecção será realizada, o que permitirá ao usuário pelo menos evitar pontos de tempo problemáticos.

A drosophila continua sendo um importante sistema modelo para estudar uma vasta gama de questões biológicas e tem se destacado no avanço do conhecimento em muitas disciplinas por décadas. Uma característica que o faz particularmente se destacar é que ele é especialmente adequado para imagens ao vivo. A capacidade de monitorar processos subcelulares ou o comportamento de células e tecidos em tempo real continua contribuindo para gerar conceitos-chave relevantes para a biologia celular e de desenvolvimento. Muitos protocolos bem sucedidos foram desenvolvidos por diferentes grupos para manter tais amostras de Drosophila vivas e saudáveis para estudar o comportamento do espécime e moléculas fluorescentes vivas. Órgãos e tecidos da mosca, como discos imagináveis1,2, o cérebro larval3,4,5,6, ou câmaras de óvulos de fêmeas adultas7,8,9, ou o intestino adulto10, por exemplo, podem ser extraídos e mantidos em cultura para imagem com microscopia de lapso de tempo. Um desafio fundamental para a imagem ao vivo é garantir que a amostra seja mantida perto da superfície de imagem para uma resolução ideal e imóvel sem comprometer a integridade da amostra que pode ser sensível a impactos mecânicos. Estudar células-tronco neurais, chamadas neuroblastos ou neurônios no cérebro larval de Drosophila, por exemplo, manter amostras próximas à superfície de imagem pode ser alcançada cobrindo-as com mídia cultural em câmaras de imagem seladas11,12,13. No entanto, essa abordagem não permite facilmente a troca de mídia, limitando assim o espaço experimental para manobras. Alternativamente, as amostras podem ser preparadas e colocadas em tampas tratadas para aumentar a adesão das células e permitir microscopia de visitação de vários pontos e imagens estendidas de células vivas em pratos de cultura aberta, que potencialmente permitem a troca de mídia, mas não fornecem meios fáceis para evitar a deriva ou perda de amostras durante a troca de mídia14,15.
O método de coágulo fibrin originalmente desenvolvido para estudar a meiose em espermatos vivos de mosca-de-guindaste16 é especificamente adequado para superar esses problemas. O fibrinogênio é dissolvido em meio de cultura relevante, as amostras colocadas e orientadas em uma gota desta solução em uma câmara de imagem adequada de superfície de vidro antes da adição da Trombina, resultando na rápida formação de um coágulo fibrin insolúvel, uma malha fibrosa pegajosa que adere à superfície do vidro e às amostras, garantindo o acesso da amostra ao meio da cultura. O meio pode então ser trocado sem perturbar o coágulo ou a posição da amostra. A troca média de cultura durante a imagem é, por exemplo, desejável quando os inibidores devem ser adicionados como no método original ou para experimentos de lavagem ou perseguição de pulso ou quando corantes fluorescentes devem ser adicionados durante a imagem de células vivas, mantendo células e tecidos no lugar. Coágulos fibrinos são adequados para a imagem de tecidos drosophila, bem como células individuais13,17. Coágulos fibrinos podem ainda ser usados para ajudar a orientar amostras, que devido à sua forma ou outras propriedades normalmente não seriam orientadas da maneira desejada, modulando a posição da amostra dentro do coágulo fibrina e a forma do próprio coágulo.
Aqui fornecemos uma atualização sobre nossos métodos atuais de imagem baseados em coágulos fibrinas e fornecemos ferramentas para análise de imagem baseada em segmentação e focamos no uso deste método para estudar divisões de neuroblastos no cérebro de mosca em desenvolvimento. Usamos rotineiramente o método de coágulos fibrinas para seguir várias amostras em diferentes coágulos no mesmo prato de cultura. Isso permite i) imagens de eventos subcelulares como comportamento central ou localização mRNA ao vivo18,19, ii) monitorando o comportamento das amostras após o tratamento farmacológico de diferentes genótipos sob as mesmas configurações de imagem usando micros visitantes multipontos20, iii) estudar os efeitos da inibição aguda das enzimas21 e iv) minimizando a deriva para estudar mudanças na orientação da divisão celular das células dentro de seu ambiente fisiológico sobre a ablação alaser-alvo 22. Enquanto efeitos indesejados de Trombina e Fibrinogênio e o coágulo fibrinão precisam ser testados empiricamente para cada amostra, este método é, em princípio, adequado para imobilizar qualquer tipo de amostra que deve ser analisada por imagens de células vivas e em Drosophila tem sido usada com sucesso para estudar múltiplos aspectos da biologia dos neuroblastos5,19,20, mas também a dinâmica das projeções citosensoras das células-tronco da linha germina feminina23 e mudanças na polaridade sobre a inibição aguda de células folículos de Drosophila
A imagem fluorescente de lapso de tempo resulta na geração de complexos conjuntos de dados 3D resolvidos pelo tempo que requerem métodos para extrair essas informações quantitativas. Aqui descrevemos nosso desenvolvimento adicional de24 macros baseadas em ImageJ que podem ser usadas para corrigir para deriva em hipersobras e macros ImageJ personalizadas que permitem quantificação semi-automatizada de fluorescência multicanal no córtex celular desenvolvido para quantificar proteínas corticais em neuroblastos de cérebros larvais Drosophila ou de neuroblastos individuais na cultura celular primária.

<table><tbody><tr><td>Soro bovino de albumina, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) -glicose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 55 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, adequado para cultura de células</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogênio de plasma</td> <td>humanoPlaca de Cultura de Células FluoroDish Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>- 35mm, 23 mm de poço</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analógico (1NA-PP1)</td>Placa de spot <td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex com nove depressões</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Trombina de plasma bovino</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

A drosophila é um importante sistema modelo para estudar uma vasta gama de questões biológicas. Vários órgãos e tecidos de diferentes estágios de desenvolvimento da mosca, como discos imagináveis, o cérebro larval ou câmaras de óvulos de fêmeas adultas ou o intestino adulto podem ser extraídos e mantidos em cultura para imagem com microscopia de lapso de tempo, fornecendo insights valiosos sobre a biologia celular e de desenvolvimento. Aqui, descrevemos em detalhes nosso protocolo atual para a dissecção de cérebros larvais de Drosophila, e então apresentamos nossa abordagem atual para imobilizar e orientar cérebros larvais e outros tecidos em uma mancha de vidro usando coágulos fibrinos. Este método de imobilização requer apenas a adição de Fibrinogen e Trombina ao meio da cultura. É adequado para imagens de lapso de tempo de alta resolução em microscópios invertidos de múltiplas amostras no mesmo prato de cultura, minimiza a deriva lateral frequentemente causada por movimentos do estágio microscópio em microscopia visitante de vários pontos e permite a adição e remoção de reagentes durante o curso da imagem. Também apresentamos macros personalizadas que usamos rotineiramente para corrigir para deriva e para extrair e processar informações quantitativas específicas a partir da análise de lapso de tempo.

Imobilização de tecidos de Drosophila com coágulos fibrinas e média de cultura de troca durante a imagem ao vivo. Após ser dissecado após o procedimento apresentado na etapa 2 (Figura 1) e imobilizado em coágulos fibrinas no mesmo deslizamento de cobertura após o procedimento apresentado na etapa 3 (Figura 2),cérebros larvais expressando Bazooka marcada por GFP (Baz::GFP), o ortolog de mosca da proteína polaridade Par-3, foram imageados por 30 minutos em imagens multi-posicionais de lapso de tempo. Baz::GFP é combinado com apkcas4, um alelo que permite a inibição aguda da proteína atípica quinase C (aPKC) através da adição do pequeno ATP analógico 1-NAPP120. 1-NAPP1 foi, portanto, adicionado ao meio cultural após o procedimento apresentado na etapa 4 e a imagem viva foi retomada por 2,5 h. Cérebros de controle que carregam uma versão selvagem do aPKC quinase não reagiram ao análogo ATP, enquanto cérebros portadores adicionalmente de uma mutação sensível a analógica de aPKC (apkcas4) exibiram uma contração do neuroepithelium e aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua prole ( Figura6, Vídeo 1). Os neuroblastos continuam se dividindo ao longo do lapso de tempo, indicando que o tecido permanece saudável, e os cérebros mostram pouca deriva apesar da mudança média cultural, indicando que eles estão bem imobilizados. Da mesma forma, após serem dissecadas após o procedimento apresentado em27,os ovários expressando Baz::GFP foram imobilizados em coágulos fibrinas no mesmo deslizamento de tampas e imageados por 8 min, após o qual a aplicação de 1-NAPP1 induziu a contração de células foliculares mutantes apkcas4, mas não de controles(Figura 7, Vídeo 2).
Correção de drift lateral e de foco usando MultiHyperstackReg. Um hipersoante exibindo deriva lateral e de foco(Vídeo 3, painel esquerdo) foi primeiro corrigido para deriva lateral (passo 6.2, Figura 3, Vídeo 3, painel médio), depois o drift de foco (passo 6.3, Figura 4, Vídeo 3, painel direito) usando o plugin MultiStRegack e a macro MultiHyperstackReg, resultando em uma redução substancial dos movimentos observados no hiperstack original.
Medição de sinal cortical usando linhas rotativas Um neuroblasto expressando Baz::GFP (verde) e a proteína transmembrana CD4 marcada com uma proteína fluorescente infravermelha (CD4::mIFP, vermelho) foi imageado durante uma mitose. O sinal CD4::mIFP foi usado como referência para detectar o córtex em várias partes do neuroblasto com tubos de linha (etapa 7, Figura 5, Figura 8A-C) e o sinal Baz::GFP foi medido nas posições detectadas Figura 8D). Durante sua divisão, os neuroblastos se polarizaram transitoriamente estabelecendo domínios corticais distintos e opostos: o polo apical e o polo basal. Baz define o polo apical e, consistentemente, o sinal baz::GFP aumentou no polo apical do neuroblasto e diminuiu no polo basal durante a divisão (Figura 8C,D). A posição do córtex foi rastreada satisfatoriamente ao longo do lapso de tempo (Figura 8C, Vídeo 4). As linhas e genótipos de Drosophila são referenciados na Tabela Suplementar 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figura 6: Aplicação de um análogo ATP em cérebros larvais imobilizados durante a imagem ao vivo. (A) Imagem ao vivo de dois cérebros larvais expressando Baz::GFP imobilizado no mesmo deslizamento de tampa. O meio de cultura é alterado para uma concentração de 10 μM do ATP analógico 1-NAPP1 em 0 min. Os cérebros de controle não reagem visivelmente ao análogo ATP, enquanto os cérebros portadores de uma mutação sensível analógica de aPKC (aPKCAS4) exibem uma contração do neuroepithelium (pontas de flecha) e aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua descendência. Projeção de intensidade máxima de 33 fatias para uma profundidade de 23 μM. Barra de escala: 20 μM. (B) Ampliação do neuroepithelium. Barra de escala: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figura 7: Aplicação de um análogo ATP em câmaras de ovos imobilizadas durante a imagem ao vivo. Imagem ao vivo de dois ovários expressando Baz::GFP imobilizado no mesmo deslizamento de tampa. O meio de cultura é alterado para uma concentração de 10 μM do ATP analógico 1-NAPP1 em 0 min. As câmaras de ovos de controle não reagem visivelmente ao análogo ATP, enquanto as câmaras de ovos que carregam uma mutação sensível analógica de aPKC (aPKCAS4) exibem uma contração do epitélio (pontas de flecha) eventualmente levando à aparente quebra das junções de aderentes. Projeção de intensidade máxima de 33 fatias para uma profundidade de 27 μM. Barra de escala: 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figura 8: Medição do sinal cortical utilizando linhas rotativas. (A) Neuroblasto de D. melanogaster ao vivo expressando Baz::GFP (verde) e CD4::mIFP (vermelho). Linhas de ciano: linhas de varredura iniciais traçadas perpendicularmente para várias zonas corticais para medir. Barra de escala: 5 μM. (B) Identificação do córtex (linha azul escuro) utilizando linhas corticais e CD4::mIFP (vermelho) como canal de referência. Linha ciano: área definida pelo parâmetro "Medir ao redor" (aqui, 2 pixels), onde o sinal é medido após a detecção do córtex. Barra de escala: 2 μm. (C) Cyan: áreas corticais identificadas durante uma divisão de neuroblasto pelo método de linha rotativa das linhas de varredura iniciais exibidas em (A), usando CD4::mIFP (vermelho) como canal de referência. Barra de escala: 5 μM. Seta: polo apical. Ponta de flecha: polo basal. (D) Medição da intensidade do sinal Baz::GFP ao longo do tempo nas duas zonas correspondentes identificadas por linhas rotativas exibidas em(C). Durante a mitose, Baz::GFP é transitoriamente enriquecido no polo apical do neuroblasto e é esgotado do polo basal oposto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Aplicação de troca de mídia em cérebros larvais imobilizados durante a imagem ao vivo para adicionar um inibidor, apresentado na Figura 6, barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 2: Aplicação de troca de mídia em câmaras de óvulos imobilizadas durante a imagem ao vivo para adicionar um inibidor, apresentado na Figura 7, barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 3: Correção de drift lateral e de foco usando MultiHyperStackReg. Imagem ao vivo de um neuroblasto expressando a sonda de membrana PH::GFP. Xy: plano focal único. Xz: reslice ortogonal. Esquerda: antes da correção da deriva. Meio: após a correção da deriva lateral. Direito: após a correção lateral e o drift de foco, barra de escala: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 4: Detecção do córtex usando linhas rotativas, apresentadas na Figura 8, barra de escala: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Tabela Suplementar 1: Genótipos de tecidos Drosophila imaged. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela Suplementar 2: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo de codificação suplementar 1: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 2: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 3: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve aplicações de imobilização de amostras usando coágulos fibrinas, limitando a deriva e permitindo a adição e lavagem de reagentes durante a imagem ao vivo. As amostras são transferidas para uma gota de Fibrinogênio contendo meio de cultura na superfície de um deslizamento de cobertura, após o qual a polimerização é induzida pela adição de trombina.

Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Este protocolo descreveu a imobilização da amostra usando coágulos de fibrina. As amostras são transferidas para uma gota de fibrinogênio contendo meio de cultura na superfície de uma lamínula, após o que a polimerização é induzida pela adição de trombina. Sob um microscópio de dissecação, use uma escova para transferir as larvas L3 para um prato de vidro borossilicato de nove poços contendo PBS.Mexa para separar a maior parte do alimento das larvas e transfira-o para outro meio de cultura que contenha poço. Use uma pinça para agarrar uma larva em todo o seu diâmetro no meio do comprimento do corpo e transfira-a para outro poço da placa de borossilicato contendo 200 microlitros de meio de cultura fresco. Não solte a larva.Para cortar a larva ao meio em todo o seu diâmetro, triture a área agarrada com o movimento lateral das pontas da pinça ou deslize uma ponta de outro par de pinças entre as duas pontas da pinça que seguram a larva. Use a pinça para segurar a larva pela cutícula e outro par de pinças para separar a cutícula sem puxar o cérebro. Repita isso até que os nervos originados do cérebro estejam visíveis e os órgãos que conectam o cérebro às partes da boca possam ser acessados.Enquanto segura os nervos originados do cérebro com uma pinça, corte a conexão entre o cérebro e as partes da boca com o outro par de pinças, separando o cérebro do resto da cutícula. Segure o cérebro pelos axônios que saem do cordão nervoso ventral e arranque os órgãos circundantes, puxando-os suavemente para longe do cérebro. Em seguida, segure a conexão entre os discos imaginários do olho e o cérebro com o outro par de pinças e corte essa conexão sem puxar o cérebro.Certifique-se de que o cérebro esteja adequadamente limpo de outros tecidos e não danificado. Descarte o cérebro se ele mostrar sinais de danos. Pipete a solução de revestimento com um P20 para dentro e para fora para revestir a ponta da pipeta, depois aspire o cérebro com a ponta revestida junto com três microlitros de meio e pipete-o em outro poço contendo 200 microlitros de meio de cultura limpo.Repita esse processo até que cérebros suficientes sejam dissecados, ocasionalmente substituindo o meio de cultura do poço no qual as dissecações são realizadas. Use uma pipeta P20 com uma ponta revestida para transferir os cérebros dissecados para outro poço da placa de borossilicato contendo 200 microlitros de meio de cultura e fibrinogênio. Aspire um cérebro junto com nove microlitros de meio de cultura e fibrinogênio.Com a extremidade da ponta quase tocando o fundo da lamínula da placa de cultura de células, pipetar o conteúdo de modo que o meio de cultura toque na lamínula imediatamente após sair da ponta da pipeta. Use uma ponta de um par de pinças, ou um par de pinças fechadas, para empurrar e posicionar suavemente o cérebro dentro do meio de cultura e da gota de fibrinogênio. Se a parte ventral do cérebro tiver que ser visualizada, induza a coagulação do fibrinogênio para orientar adequadamente o cérebro dentro do coágulo.Empurre o cérebro para um lado da gota. Toque a borda da gota no lado oposto do cérebro com a ponta da pipeta e adicione um microlitro de trombina. Aguarde de um a dois minutos para que o fibrinogênio comece a polimerizar, resultando na formação de um precipitado turvo em um lado da gota, depois empurre suavemente e dobre o cérebro no coágulo de fibrina, certificando-se de que o lado ventral esteja o mais próximo possível da lamínula sem deformar o cérebro.Pipete um microlitro de solução de trombina perto do lado do cérebro não enfiado no coágulo de fibrina. Aguarde de dois a três minutos para que o segundo coágulo de fibrina endureça e, em seguida, pressione as bordas do coágulo para que ele adira mais fortemente à lamínula, tomando cuidado para não deformar o cérebro. Se o cérebro parecer estar muito longe da lamínula, aproxime-o pressionando o coágulo de fibrina para mais perto do cérebro.Para induzir o coágulo de fibrina para obter imagens da parte dorsal do cérebro, posicione o cérebro no centro da gota, a parte dorsal voltada para a lamínula. Usando uma pipeta P2, toque a borda da gota no lado oposto do cérebro com a ponta da pipeta e pipete um microlitro de trombina. Aguarde de dois a três minutos para que o fibrinogênio comece a polimerizar, resultando na formação de um precipitado fibroso turvo, depois pressione as bordas do coágulo para que ele adira mais fortemente à lamínula, tomando cuidado para não deformar o cérebro.Com a ponta da ponta posicionada cerca de 0,5 centímetros acima do coágulo, pipete suavemente 390 microlitros de meio de cultura sem gota de fibrinogênio em cima do coágulo. Não adicione o meio de cultura nas laterais do coágulo, pois pode desprendê-lo da lamínula. Para lavar o excesso de trombina, remova 300 microlitros do prato e, em seguida, adicione 300 microlitros de meio de cultura limpo, certificando-se de que os coágulos permaneçam totalmente imersos.Para evitar mudanças de temperatura que provoquem mudanças de foco, mantenha a solução com os reagentes na mesma temperatura da placa de cultura. Remova a tampa da placa de cultura sem deslocá-la em si. Para facilitar a remoção, coloque a tampa do prato de 35 milímetros de cabeça para baixo em cima do prato antes de fazer a imagem.Posicione uma ponta de pipeta P1000 perto da superfície do meio dentro da placa de cultura e libere suavemente o volume adequado de solução reagente sobre ela, sem gerar fluxos fortes que possam desprender os coágulos. Para homogeneizar a solução dentro da placa de cultura, use uma pipeta P200 para pipetar lentamente uma pequena quantidade da solução para dentro e para fora cinco vezes. Recoloque a tampa sem deslocar a placa de cultura e retome a imagem.Quando um NAPP1 foi adicionado a cérebros larvais imobilizados com fibrina expressando Bazooka marcada com GFP, os cérebros portadores de uma mutação sensível analógica de aPKC exibiram uma contração do epitélio neural, bem como aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua progênie. O neuroblasto continuou se dividindo durante todo o lapso de tempo, indicando que o tecido permaneceu saudável. E os cérebros mostraram pouca deriva, apesar da mudança no meio da cultura.Da mesma forma, a aplicação de um NAPP1 a ovariais que expressam Bazooka marcada com GFP induziu a contração de células foliculares mutantes aPKC sensíveis analogicamente, mas não de controles. Uma hiperpilha exibindo desvio lateral e focado foi primeiro corrigida para desvio lateral e, em seguida, desvio de foco, resultando em uma redução substancial dos movimentos observados na hiperpilha original. Ao tentar este protocolo, é importante dobrar o cérebro no coágulo de fibrina parcialmente polimerizado enquanto o coágulo ainda é maleável, mas sólido o suficiente para manter o cérebro de forma estável.Experimente a manipulação de coágulos vazios e sonde suavemente o coágulo enquanto ele está polimerizando para verificar o quão resistente ele é.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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