Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Este protocolo descreveu a imobilização da amostra usando coágulos de fibrina. As amostras são transferidas para uma gota de fibrinogênio contendo meio de cultura na superfície de uma lamínula, após o que a polimerização é induzida pela adição de trombina. Sob um microscópio de dissecação, use uma escova para transferir as larvas L3 para um prato de vidro borossilicato de nove poços contendo PBS.

Mexa para separar a maior parte do alimento das larvas e transfira-o para outro meio de cultura que contenha poço. Use uma pinça para agarrar uma larva em todo o seu diâmetro no meio do comprimento do corpo e transfira-a para outro poço da placa de borossilicato contendo 200 microlitros de meio de cultura fresco. Não solte a larva.

Para cortar a larva ao meio em todo o seu diâmetro, triture a área agarrada com o movimento lateral das pontas da pinça ou deslize uma ponta de outro par de pinças entre as duas pontas da pinça que seguram a larva. Use a pinça para segurar a larva pela cutícula e outro par de pinças para separar a cutícula sem puxar o cérebro. Repita isso até que os nervos originados do cérebro estejam visíveis e os órgãos que conectam o cérebro às partes da boca possam ser acessados.

Enquanto segura os nervos originados do cérebro com uma pinça, corte a conexão entre o cérebro e as partes da boca com o outro par de pinças, separando o cérebro do resto da cutícula. Segure o cérebro pelos axônios que saem do cordão nervoso ventral e arranque os órgãos circundantes, puxando-os suavemente para longe do cérebro. Em seguida, segure a conexão entre os discos imaginários do olho e o cérebro com o outro par de pinças e corte essa conexão sem puxar o cérebro.

Certifique-se de que o cérebro esteja adequadamente limpo de outros tecidos e não danificado. Descarte o cérebro se ele mostrar sinais de danos. Pipete a solução de revestimento com um P20 para dentro e para fora para revestir a ponta da pipeta, depois aspire o cérebro com a ponta revestida junto com três microlitros de meio e pipete-o em outro poço contendo 200 microlitros de meio de cultura limpo.

Repita esse processo até que cérebros suficientes sejam dissecados, ocasionalmente substituindo o meio de cultura do poço no qual as dissecações são realizadas. Use uma pipeta P20 com uma ponta revestida para transferir os cérebros dissecados para outro poço da placa de borossilicato contendo 200 microlitros de meio de cultura e fibrinogênio. Aspire um cérebro junto com nove microlitros de meio de cultura e fibrinogênio.

Com a extremidade da ponta quase tocando o fundo da lamínula da placa de cultura de células, pipetar o conteúdo de modo que o meio de cultura toque na lamínula imediatamente após sair da ponta da pipeta. Use uma ponta de um par de pinças, ou um par de pinças fechadas, para empurrar e posicionar suavemente o cérebro dentro do meio de cultura e da gota de fibrinogênio. Se a parte ventral do cérebro tiver que ser visualizada, induza a coagulação do fibrinogênio para orientar adequadamente o cérebro dentro do coágulo.

Empurre o cérebro para um lado da gota. Toque a borda da gota no lado oposto do cérebro com a ponta da pipeta e adicione um microlitro de trombina. Aguarde de um a dois minutos para que o fibrinogênio comece a polimerizar, resultando na formação de um precipitado turvo em um lado da gota, depois empurre suavemente e dobre o cérebro no coágulo de fibrina, certificando-se de que o lado ventral esteja o mais próximo possível da lamínula sem deformar o cérebro.

Pipete um microlitro de solução de trombina perto do lado do cérebro não enfiado no coágulo de fibrina. Aguarde de dois a três minutos para que o segundo coágulo de fibrina endureça e, em seguida, pressione as bordas do coágulo para que ele adira mais fortemente à lamínula, tomando cuidado para não deformar o cérebro. Se o cérebro parecer estar muito longe da lamínula, aproxime-o pressionando o coágulo de fibrina para mais perto do cérebro.

Para induzir o coágulo de fibrina para obter imagens da parte dorsal do cérebro, posicione o cérebro no centro da gota, a parte dorsal voltada para a lamínula. Usando uma pipeta P2, toque a borda da gota no lado oposto do cérebro com a ponta da pipeta e pipete um microlitro de trombina. Aguarde de dois a três minutos para que o fibrinogênio comece a polimerizar, resultando na formação de um precipitado fibroso turvo, depois pressione as bordas do coágulo para que ele adira mais fortemente à lamínula, tomando cuidado para não deformar o cérebro.

Com a ponta da ponta posicionada cerca de 0,5 centímetros acima do coágulo, pipete suavemente 390 microlitros de meio de cultura sem gota de fibrinogênio em cima do coágulo. Não adicione o meio de cultura nas laterais do coágulo, pois pode desprendê-lo da lamínula. Para lavar o excesso de trombina, remova 300 microlitros do prato e, em seguida, adicione 300 microlitros de meio de cultura limpo, certificando-se de que os coágulos permaneçam totalmente imersos.

Para evitar mudanças de temperatura que provoquem mudanças de foco, mantenha a solução com os reagentes na mesma temperatura da placa de cultura. Remova a tampa da placa de cultura sem deslocá-la em si. Para facilitar a remoção, coloque a tampa do prato de 35 milímetros de cabeça para baixo em cima do prato antes de fazer a imagem.

Posicione uma ponta de pipeta P1000 perto da superfície do meio dentro da placa de cultura e libere suavemente o volume adequado de solução reagente sobre ela, sem gerar fluxos fortes que possam desprender os coágulos. Para homogeneizar a solução dentro da placa de cultura, use uma pipeta P200 para pipetar lentamente uma pequena quantidade da solução para dentro e para fora cinco vezes. Recoloque a tampa sem deslocar a placa de cultura e retome a imagem.

Quando um NAPP1 foi adicionado a cérebros larvais imobilizados com fibrina expressando Bazooka marcada com GFP, os cérebros portadores de uma mutação sensível analógica de aPKC exibiram uma contração do epitélio neural, bem como aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua progênie. O neuroblasto continuou se dividindo durante todo o lapso de tempo, indicando que o tecido permaneceu saudável. E os cérebros mostraram pouca deriva, apesar da mudança no meio da cultura.

Da mesma forma, a aplicação de um NAPP1 a ovariais que expressam Bazooka marcada com GFP induziu a contração de células foliculares mutantes aPKC sensíveis analogicamente, mas não de controles. Uma hiperpilha exibindo desvio lateral e focado foi primeiro corrigida para desvio lateral e, em seguida, desvio de foco, resultando em uma redução substancial dos movimentos observados na hiperpilha original. Ao tentar este protocolo, é importante dobrar o cérebro no coágulo de fibrina parcialmente polimerizado enquanto o coágulo ainda é maleável, mas sólido o suficiente para manter o cérebro de forma estável.

Experimente a manipulação de coágulos vazios e sonde suavemente o coágulo enquanto ele está polimerizando para verificar o quão resistente ele é.