Name: In-Nucleus Hi-C em Células Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Aprenda o protocolo in-nucleus Hi-C para mapear interações cromossômicas em alta resolução em células Drosophila. Este método permite estudar a organização do genoma e a função de elementos reguladores em domínios topológicos.

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Este trabalho foi apoiado pelo número de bolsas do PROGRAMA DE INOVAÇÃO E Amparo à Pesquisa (PAPIIT) da UNAM Technology Innovation and Research(PAPIIT) em 207319 e pelo número de bolsas do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. é um aluno de mestrado apoiado pelo número de CVU do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACyT) 968128.

1. Fixação
<ol><li>Comece com 10 milhões de células da linha 2 plus (S2R+) da Schneider para preparar 17,5 mL de suspensão celular no meio Schneider contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Adicione formaldeído sem metanol para obter uma concentração final de 2%. Misture e incubar por 10 minutos no RT, tomando o cuidado de misturar a cada minuto. NOTA: Formaldeído é um produto químico perigoso. Siga as normas de saúde e segurança apropriadas e trabalhe no capô da fumaça.</li>
	<li>Sacie a reação adicionando glicina para alcançar uma concentração final de 0,125 M e misture. Incubar por 5 min na RT, seguido por 15 min no gelo.</li>
	<li>Centrífuga por 400 × g no RT por 5 min e depois por 10 min a 4 °C; descartar o supernante. Resuspenda a pelota cuidadosamente em 25 mL de salina fria 1x tamponada com fosfato.</li>
	<li>Centrifugar a 400 × g por 10 min a 4 °C, depois descarte o supernaspe. NOTA: Se continuar com o protocolo, vá para a etapa 2.1 para a lise; caso contrário, congele a pelota em líquido N2 e armazene a pelota a -80 °C.</li>
</ol>2. Lysis
<ol><li>Resuspenncie as células em 1 mL de tampão de lise gelada (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% de surfactante não iônico (ver a Tabela de Materiais); 10 mM NaCl; 1x inibidores de protease), e ajuste o volume para 10 mL com tampão de lise gelada. Ajuste o volume para obter uma concentração de 1 × 106 células/mL. Incubar no gelo por 30 minutos, misturando a cada 2 minutos invertendo os tubos.</li>
	<li>Centrifugar os núcleos a 300 × g por 5 min a 4 °C e, em seguida, descartar cuidadosamente o sobrenante. Lave a pelota 1x com 1 mL de tampão de lise fria e transfira-a para um tubo de microcentrifutura. Lave a pelota 1x com 1 mL de tampão de restrição de 1,25x frio e resuspenda cada pelota de célula em 360 μL de tampão de restrição de 1,25x.</li>
	<li>Adicione 11 μL de sulfato de dodecyl de sódio de 10% de sódio (SDS) por tubo (concentração final de 0,3), misture cuidadosamente por pipetação e incubar a 37 °C por 45 min, tremendo a 700-950 rpm. Pipet para cima e para baixo para interromper aglomerados algumas vezes durante a incubação.</li>
	<li>Sacie o SDS adicionando 75 μL de surfactante não iônico (solução de 10%, ver a Tabela de Materiais) por tubo (concentração final de 1,6%) e incubar a 37 °C por 45 min, tremendo a 950 rpm. Encolé-lo algumas vezes para interromper aglomerados durante a incubação. NOTA: Se os aglomerados forem grandes e difíceis de interromper, diminua a velocidade rotativa para 400 rpm durante os tratamentos SDS e surfactantes. Se os aglomerados são difíceis de desagregar por pipetação, divida a amostra em duas; ajustar os volumes de buffer de restrição, SDS e surfactante; e proceder com a permeabilização. Em seguida, gire os núcleos em velocidade mínima (200 × g),descarte cuidadosamente o supernante, acumule as amostras em tampão de restrição de 1X e proceda com a digestão. Tome uma alíquota de 10 μL como a amostra não digerida (UD).</li>
</ol>3. Digestão enzimática
<ol><li>Digerir a cromatina adicionando 200 unidades (U) de Mbo I por tubo, e incubar a 37 °C por um período que varia de 4h a durante a noite durante a rotação (950 rpm).</li>
	<li>No dia seguinte, adicione mais 50 U de Mbo I por tubo e incubar a 37 °C por 2h enquanto gira (950 rpm).</li>
	<li>Inativar a enzima incubando os tubos a 60 °C por 20 min. Coloque os tubos no gelo. NOTA: Tome uma alíquota de 10 μL como a amostra digerida (D).</li>
</ol>4. Biotinylation de extremidades de DNA
<ol><li>Para preencher as saliências do fragmento de restrição e rotular as extremidades do DNA com biotina, adicione 1,5 μL cada um de 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL de 0,4 mM biotina dATP, 17,5 μL de tampão Tris low-EDTA (TLE) tampão [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8.0], e 10 μL de 5 U/μL de Klenow (DNA polymerase I grande fragmento) para todos os tubos. Misture cuidadosamente e incubar por 75 min a 37 °C. Agite a 700 rpm a cada 10 s por 30 s. Coloque todos os tubos no gelo enquanto prepara a mistura de ligadura.</li>
</ol>5. Ligadura
<ol><li>Transfira cada mistura de cromatina digerida para um tubo separado de 1 mL com mistura de ligadura (100 μL de tampão de ligadura de 10x, 10 μL de 10 mg/mL de colmeia bovina, 15 U de ligadura de DNA T4 e 425 μL de água dupla destilada [ddH2O]). Misture bem por pipetação suave e incubar durante a noite a 16 °C.</li>
</ol>6. Reversão de crosslink e purificação de DNA
<ol><li>Degrade as proteínas adicionando 50 μL de 10 mg/mL Proteinase K por tubo, e incubar a 37 °C por 2 h. Crosslinks reversos aumentando a temperatura para 65 °C e incubar durante a noite.</li>
	<li>Degrade o RNA adicionando 20 μL de 10 mg/mL RNase A, e incubar a 37 °C por 1 h.</li>
	<li>Realizar extração de fenol:clorofórmio seguido de precipitação de etanol.<ol>
<li>Adicione 1 volume de fenol-clorofórmio e misture completamente por inversão para obter uma fase branca homogênea. NOTA: O fenol é um produto químico perigoso. Siga as normas de saúde e segurança adequadas. Trabalhe no capô da fumaça.</li>
		<li>Centrífuga a 15.000 × g por 15 min. Transfira a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga de 2 mL fresco. Realize uma extração traseira da camada inferior com 100 μL de tampão TLE e transfira a fase aquosa para o mesmo tubo de 2 mL.</li>
		<li>DNA precipitado adicionando 2 volumes de 100% de álcool etílico (EtOH), 0,1 volumes de acetato de sódio de 3 M e 2 μL de 20 mg/mL de glicogênio. Incubar a -20 °C por um período que varia de 2h a noite.</li>
		<li>Gire a 15.000 × g por 30 min a 4 °C, e lave as pelotas 2x com gelo frio de 70% EtOH. Seque as pelotas em RT e resuspenque em 100 μL de tampão TLE. Quantifique o DNA usando um corante fluorogênico que se liga seletivamente ao DNA e um fluorômetro de acordo com as instruções do fabricante(Tabela de Materiais). NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazenar produtos de ligadura a 4 °C a curto prazo ou a -20 °C a longo prazo. Use uma alíquota (100 ng) do material como a amostra ligada (L) para controle de qualidade.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Avalie a qualidade do modelo Hi-C
<ol><li>Controles qualitativos de digestão e ligadura<ol>
<li>Purifique o DNA das alíquotas UD e D invertendo os crosslinks, e realize a extração de fenol:clorofórmio e precipitação de etanol conforme descrito acima.</li>
		<li>Carregar 100 ng de amostras de UD, D e L em um gel de 1,5% de agarose. Procure por uma mancha centrada em torno de 500 bp na amostra D versus uma faixa de alto peso molecular para a amostra de L (ver resultados representativos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controle quantitativo de eficiência de digestão NOTA: Para avaliar a eficiência de digestão com mais precisão, use as amostras de UD e D como modelos para realizar reações quantitativas da cadeia de polimerase (qPCR) usando primers projetados da seguinte forma.<ol>
<li>Projete um par de primer que amplifica um fragmento de DNA contendo o local de restrição de DNA para a enzima usada para digestão (Mbo I no protocolo atual), chamado R na fórmula na etapa 7.2.3.</li>
		<li>Projete um par de primer que amplifica um fragmento de DNA de controle que não contenha o local de restrição para a enzima usada para digestão (Mbo I para o protocolo atual), chamado C na fórmula na etapa 7.2.3.</li>
		<li>Use os valores do limiar de ciclo (valores ct) da amplificação para calcular a eficiência da restrição de acordo com a fórmula mostrada abaixo: % Restrição = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD} Quando a CtR refere-se ao valor ct do fragmento R, e CtC refere-se ao valor ct do fragmento C para amostra D e UD amostra. NOTA: A porcentagem de restrição reflete a eficiência da enzima de restrição que corta o fragmento de DNA restrito (R) em comparação com um fragmento de DNA de controle (C) que não contém o local de DNA de restrição. Recomenda-se uma eficiência de restrição de ≥ 80%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detecção de interações conhecidas<ol>
<li>Execute o PCR para amplificar um controle de ligadura interna para examinar interações de curto e/ou médio ou longo alcance (ver resultados representativos).</li>
		<li>Alternativamente, projete primers para amplificar um produto de ligadura no qual os primers estão em orientação para frente ou reverso em fragmentos de restrição adjacentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controle de preenchimento e rotulagem de biotina<ol>
<li>Verifique a eficiência de marcação e ligadura hi-C por amplificação e digestão de uma interação conhecida ou um produto de ligadura entre fragmentos de restrição adjacentes no genoma, conforme descrito acima. NOTA: O preenchimento bem-sucedido e a ligadura do site Mbo I (GATC) geram um novo local para a enzima de restrição Cla I (ATCGAT) na junção de ligadura e regenera o site Mbo I.</li>
		<li>Digerir o produto PCR com Mbo I, Cla I ou ambos. Depois de executar as amostras em um gel de 1,5-2%, estimar o número relativo de junções de ligaduras 3C e Hi-C quantificando a intensidade das bandas de corte e sem cortes26. NOTA: É desejada uma eficiência de > 70% (veja resultados representativos).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Sonicação
<ol><li>Sonicar as amostras para obter fragmentos de DNA de 200-500 bp. Para o instrumento utilizado neste protocolo (ver a Tabela de Materiais),dilua a amostra (de 5 a 10 μg) em 130 μL de ddH2O por tubo, e defina o instrumento para sonicar até 400 bp: nível de preenchimento: 10; fator de dever: 10%; pico de tráfego incidente (w): 140; ciclos por explosão: 200; tempo (s): 80.</li>
</ol>9. Remoção/reparo final da biotina
NOTA: As etapas abaixo são ajustadas para 5 μg de DNA Hi-C.
<ol><li>Para realizar a remoção da biotina, transfira a amostra (130 μL) para um tubo de microcentrifuge fresco. Adicione 16 μL de tampão de ligadura de 10x, 2 μL de 10 mM dATP, 5 μL de T4 DNA Polymerase (15U) e 7 μL de ddH2O (160 μL de volume total). Incubar a 20 °C por 30 min.</li>
	<li>Adicione 5 μL de 10 mM dNTPs, 4 μL de tampão de ligadura de 10x, 5 μL de T4 polynucleotide quinase (10 U/μL), 1 μL de Klenow e 25 μL de ddH2O (200 μL de volume total). Incubar a 20 °C por 30 min.</li>
</ol>10. Seleção de tamanho
<ol><li>Para selecionar fragmentos principalmente na faixa de tamanho de 250-550 bp, realize a seleção de tamanho de imobilização reversível de fase sólida sequencial (SPRI) primeiro com 0,6x, seguido por 0,90x de acordo com as instruções do fabricante, e elute o DNA usando 100 μL de TLE.</li>
</ol>11. Retração de biotina/ligadura/adaptador/adaptação
NOTA: Realize as lavagens reutilizando as contas magnéticas por vórtice, gire as amostras por 3 minutos em uma roda giratória e, em seguida, gire brevemente a amostra e coloque-a no suporte magnético. Deixe as contas grudarem no ímã, descarte o supernasce e proceda com a seguinte etapa de lavagem. Execute as lavagens a 55 °C em um bloco termo com rotação em vez da roda giratória.
<ol><li>Coma o volume final para 300 μL por amostra com TLE para puxar para baixo. Prepare os buffers de lavagem de contas: 1x Tampão de Interpolação (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5x TB, 1x Tampão No-Tween (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.</li>
	<li>Use 150 μL de contas magnéticas ligadas a streptavidina (ver a Tabela de Materiais) por biblioteca. Lave as contas 2x com 400 μL de 1x TB. Em seguida, resuspend contas em 300 μL 2x NTB.</li>
	<li>Misture as contas com o material Hi-C de 300 μL e incubar na RT por 30 minutos em uma roda giratória para permitir a ligação de biotina às contas streptavidin.</li>
	<li>Lave as contas com 400 μL de 0,5x TB e incubar a 55 °C por 3 min, girando a 750 rpm. Lave as contas em 200 μL de 1x de buffer de restrição.</li>
	<li>Resuspenque as contas em 100 μL de mistura de rejeito dATP (5 μL de 10 mM dATP, 10 μL de tampão de restrição de 10x, 5 μL de Klenow exo-, e 80 μL de ddH2O). Incubar a 37 °C por 30 min.</li>
	<li>Retire o supernascimento, lave as contas 2x com 400 μL de 0,5x TB incubando a 55 °C por 3 min e girando a 750 rpm.</li>
	<li>Lave as contas com 400 μL de 1x NTB e, em seguida, com 100 μL de tampão de ligadura 1x.</li>
	<li>Resuspenque as contas em 50 μL de tampão de ligadura 1x e transfira a suspensão para um novo tubo. Adicione 4 μL de adaptadores pe pré-enalados (15 μM de estoque) e 2 μL de ligase T4 (400 U/μL, ou seja, 800 U/tube); incubar na RT por 2 h. NOTA: Pré-anneal os adaptadores adicionando volumes iguais de ambos os adaptadores PE 1.0 e PE 2.0 (estoque de 30 μM) e incubação por 10 minutos na RT (ver a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Recapture as contas removendo o supernascimento e lavando as contas 2x com 400 μL de TB. Lave as contas com 200 μL de 1x NTB, depois com 100 μL de tampão de restrição de 1x e resuspenja as contas em 40 μL de tampão de restrição de 1x.</li>
</ol>12. Amplificação do PCR
<ol><li>Configure PCRs de volume de 25 μL com ciclos de 5, 6, 7 e 8. Para cada PCR, use:<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Receita de Reação</td>
			</tr>
<tr>
<td>Contas hi-C</td>
				<td>2,5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR primer 1 (Tabela de Materiais)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR primer 2 (Tabela de Materiais)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTP</td>
				<td>0,6 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Tampão de reação 5x</td>
				<td>5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Polimerase de DNA</td>
				<td>0,3 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
				<td>14,65 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Total</td>
				<td>25 μL</td>
			</tr>
</tbody></table>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ciclos</td>
				<td>Temperatura</td>
				<td>Hora</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td rowspan="3">n ciclos</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>10 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>65 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>72 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>72 °C</td>
				<td>7 min.</td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
</ol>13. Amplificação final do PCR
<ol><li>Realize a amplificação final do PCR usando as mesmas condições descritas acima e o número de ciclos selecionados. Divida a amostra usando 5 μL de contas Hi-C como modelo em reações de 50 μL.</li>
	<li>Colete todas as reações do PCR e transfira-as para um tubo fresco. Use o ímã para remover as contas de streptavidina e recuperar os produtos supernascentes (PCR). Transfira as contas para um tubo fresco, lave as contas conforme indicado na etapa 11.2.9 e armazene em 1x tampão de restrição a 4 °C como backup.</li>
	<li>Purifique os produtos PCR utilizando 0,85x o volume das contas SPRI de acordo com as instruções do fabricante. Elute com 30 μL de tampão TLE.</li>
	<li>Quantifique a biblioteca Hi-C usando um instrumento fluorométrico, e confirme a qualidade da biblioteca por eletroforese capilar baseada em chip.</li>
	<li>Como ponto de verificação de última qualidade, use 1 μL da biblioteca Hi-C como modelo para executar uma reação pcr usando 10 ciclos usando as mesmas condições descritas na etapa 12.1. Divida o produto PCR em dois tubos de microcentrifuuge: digerir um com Cla I e deixar o outro indigesto como controle. Executar os produtos em um gel de 1,5-2% de agarose (ver resultados representativos).</li>
	<li>Prossiga para 50 bp ou 75 bp de sequência de extremidade emparelhada em uma plataforma de sequenciamento adequada.</li>
</ol>

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<li>Van Bortle, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulator+function+and+topological+domain+border+strength+scale+with+architectural+protein+occupancy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy.</a> Genome Biology. 15, 82(2014).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
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<li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li>
<li>Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actual+ligation+frequencies+in+the+chromosome+conformation+capture+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure.</a> PLoS One. 8, 60403(2013).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Hi-C+results+using+in-solution+versus+in-nucleus+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation.</a> Genome Biology. 16, 175(2015).</li>
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<li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiC-Pro%3A+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing.</a> Genome Biology. 16, 259(2015).</li>
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<li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCUP%3A+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310(2015).</li>
<li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li>
<li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biolog%22%5BJournal%5D)">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198(2015).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137(2008).</li>
<li>Ong, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li>
<li>Fresán, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li>
<li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li>
<li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li>
<li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li>
<li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li>
<li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-BERST%3A+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

O método Hi-C em núcleo apresentado aqui permitiu a exploração detalhada da topologia do genoma de Drosophila em alta resolução, proporcionando uma visão das interações genômicas em diferentes escalas genômicas, desde loops de cromatina entre elementos regulatórios, como promotores e melhoradores até TADs e identificação de compartimentos grandes25. A mesma tecnologia também foi aplicada eficientemente aos tecidos mamíferos com algumas modificações33. Por exemplo, ao proces...

Nos eucariotes, o genoma é dividido em cromossomos que ocupam territórios específicos no espaço nuclear durante a interfase1. A cromatina formando os cromossomos pode ser dividida em dois estados principais: um de cromatina acessível que é transcritivamente permissivo, e o outro de cromatina compacta que é transcritivamente repressiva. Esses estados de cromatina segregam e raramente se misturam no espaço nuclear, formando dois compartimentos distintos no núcleo2. Na escala sub-megabase, os limites separam domínios de interações de cromatina de alta frequência, chamados TADs, que marcam a organização cromossômica3,4,5. Nos mamíferos, os limites do TAD são ocupados por cohesin e fator de ligação CCCTC (CTCF)6,7,8. O complexo de cohesina extruda a cromatina e para em locais de ligação CTCF que são dispostos em uma orientação convergente na sequência genômica para formar laços de cromatina estável9,10,13,14. A interrupção genética do local de ligação de DNA ctcf nos limites ou redução da densidade de proteínas de CTCF e cohesina resulta em interações anormais entre elementos regulatórios, perda da formação de TAD e desregulação da expressão genética9,10,11,13,14.
Em Drosophila, os limites entre os TADs são ocupados por vários APs, incluindo fator associado a elementos de fronteira 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 proteína de ligação (M1BP), proteína centrosômica 190 (CP190), supressor de asa peluda (SuHW) e CTCF, e são enriquecidos em modificações de histona ativa e Polymerase II16,17,18. Tem sido sugerido que em Drosophila, os TADs aparecem como consequência da transcrição13,17,19, e o papel exato dos APs independentes na formação de limites e propriedades de isolamento ainda está sob investigação. Assim, se os domínios em Drosophila são uma consequência única da agregação de regiões de estados transcricionais semelhantes ou se as APs, incluindo a CTCF, contribuem para a formação de limites permanece totalmente caracterizada. A exploração de contatos genômicos em alta resolução tem sido possível através do desenvolvimento de tecnologias de captura de conformação de cromossomos, juntamente com o sequenciamento de próxima geração. O protocolo Hi-C foi descrito pela primeira vez com a etapa de ligadura realizada "em solução"2 na tentativa de evitar produtos de ligadura espúria entre fragmentos de cromatina. No entanto, vários estudos apontaram para a constatação de que o sinal útil nos dados veio de produtos de ligadura formados em núcleos parcialmente lysed que não estavam na solução20,21.
O protocolo foi então modificado para realizar a ligadura dentro do núcleo como parte do experimento Hi-C de célula única22. O protocolo Hi-C no núcleo foi posteriormente incorporado à população celular Hi-C para produzir uma cobertura mais consistente ao longo de toda a gama de distâncias genômicas e produzir dados com menos ruído técnico23,24. O protocolo, descrito em detalhes aqui, baseia-se no protocolo Hi-C da população no núcleo23,24 e foi usado para investigar as consequências da remoção genética de motivos de vinculação de DNA para CTCF e M1BP de um limite de domínio no lócus genético notch em Drosophila25. Os resultados mostram que alterar os motivos de vinculação de DNA para APs na fronteira tem consequências drásticas para a formação do domínio de Notch, defeitos topológicos maiores nas regiões ao redor do lócus notch e desregulamentação da expressão genética. Isso indica que elementos genéticos nos limites do domínio são importantes para a manutenção da topologia do genoma e expressão genética em Drosophila25.

<table><tbody><tr><td>Solução de paraformaldeído a 16% (vol/vol)</td><td>Ágar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>CA1524-016</td><td></td></tr><tr><td>Enzima ClaI</td><td>NEB</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>COVARIS Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>LE220-M220</td><td></td></tr><tr><td>Corte Smart</td><td>NEB</td><td>B72002S</td><td></td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS) filtrado estéril</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Dna PolI grande fragmento</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo(-)</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de ligadura</td><td>NEB</td><td>B020S</td><td></td></tr><tr><td>Enzima MboI</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td></td></tr><tr><td>NP40-Igepal</td><td>SIGMA</td><td>CA-420</td><td>Surfactante não iônico para adição no tampão de lise</td></tr><tr><td>Adaptador PE 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>adaptador 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR primer 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR primer 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Fenol</td><td></td></tr><tr><td>: Clorofórmio: Álcool Isoamílico 25:24:1</td><td>SIGMA</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Primer 1 (interação conhecida, Figura 2A)</td> <td>Sigma</td><td>5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer</td><td></td></tr> <tr><td>2 (interações conhecidas, Figura 2A)</td> <td>Sigma</td><td>5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Comprimido</td><td></td></tr> <tr><td>de coquetel inibidor de protease</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Contas</td><td>Roche 10109142001</td><td></td></tr><tr><td>SPRI</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerase</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleotídeo quinase (PNK)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>TaqPhusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>DNA polimerase</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Surfactante não iônico para têmpera de SDS</td></tr></tbody></table>

in-nucleus hi-c em células drosophila

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

O genoma é organizado em domínios topologicamente associando (TADs) delimitados por fronteiras que isolam interações entre domínios. Em Drosophila, os mecanismos subjacentes à formação e aos limites do TAD ainda estão sob investigação. A aplicação do método Hi-C em núcleo descrito aqui ajudou a dissecar a função de sítios de ligação de proteína arquitetônica (AP) nas fronteiras do TAD isolando o gene Notch. A modificação genética dos limites de domínio que causam a perda de APs resulta em fusão TAD, defeitos transcricionais e alterações topológicas de longo alcance. Esses resultados forneceram evidências demonstrando a contribuição de elementos genéticos para a formação de limites de domínio e controle da expressão genética em Drosophila. Aqui, o método Hi-C no núcleo foi descrito em detalhes, o que fornece importantes pontos de verificação para avaliar a qualidade do experimento juntamente com o protocolo. Também são mostrados os números necessários de leituras de sequenciamento e pares Hi-C válidos para analisar interações genômicas em diferentes escalas genômicas. A edição genética mediada pelo CRISPR/Cas9 de elementos regulatórios e o perfil de alta resolução das interações genômicas usando este protocolo Hi-C no núcleo pode ser uma combinação poderosa para a investigação da função estrutural dos elementos genéticos.

Descritos abaixo estão os resultados de um protocolo Hi-C bem sucedido (veja um resumo do fluxo de trabalho do protocolo Hi-C na Figura 1A). Existem vários pontos de controle de qualidade durante o experimento Hi-C no núcleo. As alíquotas amostrais foram coletadas antes (UD) e depois (D) da etapa de restrição da cromatina, bem como após a ligadura (L). Os crosslinks foram invertidos, e o DNA foi purificado e executado em um gel de agarose. Uma mancha de 200-1000 bp foi observada quando a res...

O genoma é organizado no espaço nuclear em diferentes estruturas que podem ser reveladas através de tecnologias de captura de conformação cromossomos. O método Hi-C no núcleo fornece uma coleção de interações de cromatina em linhas celulares Drosophila, que gera mapas de contato que podem ser explorados em resolução de megabases em nível de fragmento de restrição.

In-Nucleus Hi-C em Células Drosophila

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Os protocolos de núcleo Hi-C permitem a exploração da confirmação cromossômica em resolução diferente para a caracterização de laços de cromatina, domínios e compartimento organizando o genoma. Este protocolo fornece perfil de alta resolução de interações genômicas em diferentes escalas, gerando uma cobertura mais consistente sobre toda a gama de distâncias genômicas e dados com menos ruído técnico. Combinar este protocolo com a edição genética é uma estratégia poderosa para testar a função estrutural dos elementos genéticos.Também pode ser aplicada à caracterização de variações estruturais que levam à doença. O protocolo de núcleo Hi-C pode ser aplicado para explorar a organização do genoma de qualquer genoma eucariótico. Fazer o tratamento SDS e Triton desagrega qualquer aglomerado nuclear por pipetação, pois os agregados interferem na eficiência da reação enzimática, e certifique-se de executar a medida de controles de qualidade apropriado antes do sequenciamento.Comece adicionando formaldeído sem metanol a uma vezes 10 às sete células de Drosophila da Linha 2 Plus schneider em 17,5 mililitros de schneider médio suplementado com 10% FBS a uma concentração final de 2% Incubar as células por 10 minutos à temperatura ambiente com mistura a cada 60 segundos ou em uma roda giratória, e adicionar glicina a uma concentração final de 0,125 molar com mistura. Depois de cinco minutos em temperatura ambiente e 15 minutos no gelo, colete as células por centrifugação e resume cuidadosamente a pelota em 25 mililitros de PBS frio e colete as células com outra centrifugação. No final da centrifugação, resuspenge as células em um mililitro de tampão de lise gelada para contar e ajustar as células para uma única vezes 10 às seis células por concentração mililitro.Incubar as células no gelo por 30 minutos, invertendo o tubo a cada dois minutos para misturar e coletar as células com outra centrifugação. Resuspenda a pelota em um mililitro de tampão de lise gelada fresca. Após a centrifugação, lave o lise com um mililitro de tampão de restrição de 1,25X.Centrifugar novamente para coletar o lysate. Resuspenja a pelota em 360 microliters de tampão de restrição fresco e 11 microliters de 10% SDS com tubulação cuidadosa e incubação por 45 minutos a 37 graus Celsius e 7 a 950 revoluções por minuto com tubulação ocasional. No final da incubação, pare a permeabilização com 75 microlitadores de surfactante não iônico e devolva o tubo à incubadora por mais 45 minutos com agitação a 950 revoluções por minuto com pipetação ocasional.Para digestão de cromatina, adicione 200 unidades de Mbo1 ao tubo para uma incubação de quatro a 16 horas a 37 graus Celsius com rotação. Ao final da incubação, inativar a enzima com incubação de 20 minutos a 60 graus Celsius. Para preencher as pendeções do fragmento de restrição e rotular as extremidades de DNA com biotina, adicionar 1,5 microliters cada um de 10 mililitros dCTP, dGTP, dTTP, 20 microlitres de 0,4 milimolar biotina dATP, 17,5 microliters de três baixos buffer EDTA, e 10 microlitres de cinco unidades por microliter de DNA polimerase um grande fragmento para o tubo com mistura cuidadosa.Incubar a reação por 75 minutos a 37 graus Celsius com agitação a 700 revoluções por minuto a cada 10 segundos por 30 segundos. No final da incubação, adicione a mistura de ligadura à cromatina e ajuste-a a um mililitro volume final de reação com mistura suave e incubada durante a noite a 16 graus Celsius. Para degradar as proteínas da amostra, adicione 50 microlitadores de 10 miligramas por mililitro proteinase K ao tubo para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius.No final da incubação, aumente a temperatura para 65 graus Celsius durante a noite para reverter o cruzamento da amostra. Na manhã seguinte, degrade o RNA com 10 microlitres de 10 mililíberos por mililitro RNAse A.Após uma hora a 37 graus Celsius, adicione um volume de clorofórmio fenol ao tubo e misture completamente por inversão para obter uma fase branca homogênea. Depois de precipitar o DNA de acordo com os protocolos padrão, quantifique o DNA usando um corante fluorogênico que se liga seletivamente ao DNA e um fluorômetro de acordo com as instruções do fabricante.Para purificar o DNA de alíquotas não digeridas e digeridas, carregue 100 nanogramas de amostras não digeridas, digeridas e ligadas em um gel de 1,5% de ágarose e procure por uma mancha centrada em cerca de 500 pares de base na amostra digerida versus uma faixa de alto peso molecular para a amostra ligada. Para verificar a marcação hi-C e eficiência de ligadura por amplificação e digestão de uma interação conhecida, após PCR, digerir os produtos com Mbo1, Cla1, ou ambos, e executar as amostras em um novo gel de 1,5 a 2% para permitir a estimativa do número relativo de junções de ligaduras 3C e Hi-C. Depois de sonicar a amostra para obter 200 a 500 fragmentos de DNA do par base, transferir 130 microliters com cinco microgramas de DNA de cada amostra para novos tubos de microcentrífa contendo 16 microliters de tampão de ligadura 10X, dois microlitres de 10 milimolares dATP, cinco microlitradores de polimerase de DNA T4, e sete microliters de água dupla destilada para uma incubação de 30 minutos a 20 graus Celsius.No final da incubação, adicione cinco microlitadores de 10 dNTPs mililitros, quatro microliters de tampão de ligadura 10X, cinco microlitrais de quinase de polinucleotídeo T4, um microliter de polimerase de DNA um grande fragmento, e 25 microliters de água dupla destilada aos tubos para uma segunda incubação de 30 minutos a 20 graus Celsius. Para selecionar fragmentos principalmente na faixa de tamanho do par base de 250 a 550, realize a seleção de tamanho reversível de fase sólida sequencial e de tamanho de mobilização com 0,6X, depois 0,9X de acordo com as instruções do fabricante e elute o DNA com 100 microliters de tris low EDTA. Para puxar biotina para cada biblioteca, lave 150 microliters de contas magnéticas ligadas a Streptavidin duas vezes com 400 microliters de tampão 1X Tween e gire as amostras por três minutos em uma roda giratória.No final da incubação, resuspenja as contas em 300 microliters de tampão 2X no Tween e misture com 300 microliters de material Hi-C para uma rotação de 30 minutos em uma roda giratória. No final da incubação, lave as contas com 400 microliters de tampão 0,5X Tween para uma incubação de três minutos a 55 graus Celsius e 750 rotações por minuto, seguida por duas lavagens em 200 microliters de tampão de restrição 1X por lavagem. Após a segunda lavagem, resuspenque as contas em 100 microliters de mistura de rejeito dATP para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius.Ao final da incubação, resuspenque as contas em 50 microliters de tampão de ligadura 1X e transfira a suspensão para um novo tubo contendo quatro microliters adaptadores finais emparelhados pré-annealed e dois microliters de ligadura T4. Depois de duas horas em temperatura ambiente, remova o supernatante e lave as contas duas vezes com 400 microliters de tampão de interpolação, depois lave as contas uma vez com 200 microliters sem tampão de Interpol e uma vez com 100 microliters de tampão de restrição antes de suspender novamente as contas em 40 microliters de tampão de restrição 1X. Uma mancha de 200 a 1.000 pares de base é observada quando a restrição com Mbo1 é bem sucedida.Se a ligadura for bem sucedida, uma faixa de alto peso molecular é observada no topo do gel. A eficiência de digestão também pode ser confirmada por PCR quantitativo. Uma eficiência de digestão aceitável é de 80% ou mais.Como ilustrado, a amplificação de uma interação conhecida de média gama em produtos de ligadura Hi-C pode ser estimada pela digestão do produto PCR recuperado na amplificação. Recomenda-se uma eficiência de digestão superior a 70% para evitar ter uma grande proporção de leituras não úteis para as bibliotecas após o sequenciamento. O número de ciclos de PCR para a amplificação final deve ser um ciclo menor do que o número de ciclos para os quais a mancha é visível.O nível de digestão da biblioteca indica a abundância de pares Hi-C válidos e reflete a proporção de leituras úteis que serão obtidas da biblioteca. Utilizando os pares Hi-C válidos exclusivos, a análise básica da distribuição do par pode ser realizada. Como observado neste exemplo representativo, o lócus genético NOTCH pode ser visto juntamente com as proteínas arquitetônicas, domínios um e dois, e modificações histonas ao longo do lócus.Após a exclusão da região contendo os locais de ligação de DNA CTCF e M1BP, uma mudança drástica nos contatos de cromatina pode ser observada. Após o experimento Hi-C, pode ser realizado um conjunto específico de contatos, por exemplo, de regiões promotoras. Isso é particularmente útil na avaliação de genomas grandes.Como demonstrado, a combinação do protocolo Hi-C com a adição genética pode ser usada para avaliar a função estrutural e regulatória dos elementos genômicos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este protocolo demonstra como executar imunohistoquímica em dissecados larva Drosophila.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

Este trabalho demonstra o uso de um microscópio confocal de varredura rápida para o comportamento das células de imagem diretamente através do pupário. Ao deixar o caso de pupa intacto, este método permite a observação e medição de processos celulares dinâmicos numa fase de desenvolvimento de Drosophila que é difícil de estudar directamente.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Tecidos de Drosophila contêm muitas vezes uma mistura heterogénea de tipos celulares. Para examinar a expressão de genes em tipos específicos de células a partir de um tecido em particular, os núcleos podem ser geneticamente marcado e, subsequentemente, isolado usando uma abordagem baseada em afinidade. Isolado núcleos pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a análise de expressão génica e imunoprecipitação da cromatina.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

A poliploidização induzida por feridas é uma estratégia de reparação de tecidos conservada onde as células crescem em tamanho em vez de se dividirem para compensar a perda celular. Aqui está um protocolo detalhado sobre como usar a mosca frutífera como modelo para medir a ploidia e sua regulação genética no reparo de feridas epiteliais.

Um modelo de Drosophila para estudar poliploidização induzida por feridas

O objetivo deste protocolo é injetar actina globular conjugada por Rhodamine em embriões Drosophila e montagem de haste de actina intranuclear de imagem após estresse térmico.

Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo

Este protocolo visa visualizar agregados de heterocromatina em células de politento de Drosophila.

Mancha imunofluorescente para visualização de proteínas associadas à heterocromatina em glândulas salivares drosophila

A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridine/Phospho-Histone H3 Protocolo de rotulagem dupla para análise de progressão do ciclo celular em células-tronco neurais Drosophila

Em Drosophila,o núcleo oócito sofre migração dependente de microtúbulos durante a oogênese. Aqui, descrevemos um protocolo que foi desenvolvido para acompanhar a migração realizando imagens ao vivo em câmaras de ovos ex-vivo. Nosso procedimento mantém as câmaras de ovos vivas por 12 horas para adquirir filmes de lapso de tempo 3D multi-posição usando microscopia confocal de disco giratório.

Migração Nuclear no Oócito de Drosophila

Este protocolo descreve as etapas necessárias para realizar hibridização fluorescente in situ por reação em cadeia (HCR-FISH) nos lobos ópticos larvais de Drosophila melanogaster . Procedimentos para o projeto da sonda, hibridização, amplificação e montagem de tecidos são detalhados para facilitar a visualização do lobo óptico em desenvolvimento.

FISH de reação em cadeia de hibridização no lobo óptico em desenvolvimento de Drosophila

Aprenda o protocolo in-nucleus Hi-C para mapear interações cromossômicas em alta resolução em células Drosophila. Este método permite estudar a organização do genoma e a função de elementos reguladores em domínios topológicos.

In-Nucleus Hi-C em Células Drosophila

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