Name: Explante de tecido córnea porcina para estudar a eficácia do vírus Herpes Simplex-1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a isolar e tratar córneas porcinas ex vivo para testar a eficácia de drogas antivirais contra Herpes Simplex-1. Este método oferece uma alternativa econômica e menos trabalhosa aos modelos animais tradicionais.

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Este estudo foi apoiado por subvenções do NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 e RO1 EY029426) ao D.S. A.A. foi apoiado por uma bolsa F30EY025981 do National Eye Institute, NIH. O estudo foi realizado utilizando as córneas suínas obtidas da empresa Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609

Todo o tecido suíno usado neste estudo foi fornecido por uma organização privada terceirizada e nenhum dos manuseamentos de animais foi realizado pela Universidade de Illinois em Chicago.
1. Materiais
<ol><li>
Reagentes
	<ol>
<li>Use os seguintes reagentes para ensaio de placa: metilcelulose em pó, meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal (FBS), penicilina e estreptomicina (P/S) para ensaio de placa.</li>
		<li>Use comprimidos de cristal violeta e etanol (grau de biologia molecular) para preparar solução violeta cristalina para ensaio de placa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vero cell growth media - DMEM whole media
	<ol>
<li>Abra a garrafa de mídia DMEM dentro da capa de cultura de tecido. Remova 55 mL de mídia da garrafa usando uma pipeta sorológica e descarte-a. Adicione 50 mL de FBS de P/S ao DMEM. Leve à geladeira a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mídia de ensaio de placa - Estoque de 5% de mídia de metilcelulose
	<ol>
<li>Meça 2,5 g de pó de metilcelulose com um ímã de agitação dentro de uma garrafa de vidro de 500 mL e autoclave-a. Depois que a garrafa esfriar até a temperatura ambiente, pegue 500 mL de mídia inteira DMEM contendo 50 mL de FBS e 5 mL de P/S e adicione-a à garrafa de vidro contendo metilcelulose.</li>
		<li>Mexa a 4 °C por 2 dias usando um agitador magnético. Leve à geladeira a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da mídia para córnea suína excizada
	<ol>
<li>Abra uma garrafa de mídia essencial mínima (MEM) dentro da capa de cultura de tecido. Descarte 10 mL de MEM da garrafa usando uma pipeta sorológica.</li>
		<li>Adicione 5 mL de insulina-transferrina-selênio (ITS) e 5 mL de antibiótico antimíctico (AA) à mídia e leve à geladeira a 4°C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mestre e estoque de cristal violeta:
	<ol>
<li>Para fazer a solução de estoque cristalino, adicione 1 g de pó violeta cristalina a 100 mL de 20% de etanol na água. Este estoque (1% c/v de cristal violeta) pode ser armazenado e usado por até um ano quando armazenado em um lugar escuro.</li>
		<li>Para fazer um estoque de trabalho a partir disso, adicione 50 mL de solução de estoque original a 350 mL de água. Adicione 100mL de etanol a esta solução para fazer uma solução de cristal violeta de 500 mL (0,1% w/v de violeta cristalina). NOTA: Ambas as soluções precisam ser armazenadas no escuro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Procedimento
<ol><li>Isolamento das córneas suínas de olhos inteiros17
	<ol>
<li>Ao receber os olhos suínos de um fornecedor adequado, armazene no gelo se houver um atraso com o processamento de tecidos como retratado na Figura 1.</li>
		<li>Certifique-se de que os equipamentos de proteção individual são usados e usados durante este procedimento para evitar contaminação, bem como acidentes de derramamento de humor vítreo.</li>
		<li>Pulverizar a área de trabalho com 70% de etanol para limpar e desinfetar. Para garantir que o espaço de trabalho esteja estável, espalhe uma tampa de banco e tape pelos lados com segurança, conforme retratado na Figura 2.</li>
		<li>Coloque os olhos suínos na gaze (Figura 3). Utilizando gaze de 50 mm, segure a seção posterior(Figura 4A) dos olhos suínos, conforme mostrado na Figura 4B com uma mão.</li>
		<li>Com uma agulha de 30 G, faça delicadamente um único poke no centro da superfície epitelial do olho cuidadosamente e certifique-se de que não há danos ao estroma(Figura 5). A cutucada deve ser limitada ao epitélio (~100-200 μm) para evitar o envolvimento estromalítico.</li>
		<li>Usando uma lâmina esterilizada afiada, faça uma pequena incisão na esclera a 1 mm de distância da córnea. Corte a borda da córnea garantindo que o humor vítreo não vaze usando uma ação rotativa rápida e suave da mão(Figura 6A). Segurando a córnea na borda córnea-esclera com uma pinça plana, corte as membranas de amarração restantes do olho usando a lâmina(Figura 6B).</li>
		<li>Pegue a córnea e coloque-a em uma placa de 12 poços sobreposta com 2 mL de meio de córnea. A córnea deve ser colocada de frente para cima, demonstrada em uma série de passos nas Figuras 7A-D, Figura 8).</li>
		<li>Adicione 5 μL da solução de vírus contendo unidades de formação de placas (PFU) de 5 x10 5 placas (PFU) de 17 GFP ao local desbridado na superfície da córnea. Coloque a placa de 12 poços contendo córneas suínas infectadas em uma incubadora com 5% de CO2 por 72 h.</li>
		<li>Pulverize quaisquer olhos adicionais não utilizados em experimentos com alvejante 10% e descartados com segurança em sacos de risco biológico.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualização NOTA: O vírus deve ser visualizado todos os dias antes da adição de medicamentos.<ol>
<li>Ligue o microscópio estéreo e a fonte de luz LED e deixe a lâmpada da máquina aquecer antes de imaginar as córneas. Leve cuidadosamente a placa de córneas para instrumento sem perturbar a solução. Altere o filtro para que o GFP (380-460 nm) seja usado para olhar amostras. Defina o tempo de exposição para 500 ms para capturar imagens.</li>
		<li>Primeiro, coloque a placa de córnea sob o estereoscópio e capture as imagens na menor ampliação de 7,5x. Acompanhe isso com uma série de imagens de ampliação crescentes (por exemplo, 15x, 25x, 35x) de tal formação viral de spread e dendrito é visualizada claramente</li>
		<li>Certifique-se de devolver as córneas infectadas de volta à incubadora de cultura tecidual e salvar todas as imagens que foram tiradas.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação da infecção por vírus NOTA: Os de vírus das córneas suínas devem ser avaliados todos os dias para analisar o efeito do tratamento medicamentoso.<ol>
<li>Para quantificar o vírus, as células vero sementes a uma densidade de 5 x 105 de células por poço se usar uma placa de 6 poços como feito neste experimento. Faça isso um dia antes da infecção. Incubar as células banhadas durante a noite para garantir que elas sejam confluentes para quantificação do vírus.</li>
		<li>Alíquota de 500 μL de mídia livre de soro em múltiplos tubos de microcentrifuuge. Insira o cotonete estéril de algodão mergulhado nos tubos cheios de mídia livre de soro. Os cotonetes de algodão precisam ser mergulhados e molhados por pelo menos 5 minutos antes do uso.</li>
		<li>Sem perturbar a mídia subjacente, transporte a placa de córnea suína infectada para um armário de biossegurança. Usando os cotonetes de algodão molhado, faça 3 revoluções no sentido horário e 3 revoluções no sentido anti-horário a um diâmetro de 5 mm do centro da córnea suína infectada sem aplicar pressão excessiva.</li>
		<li>Insira o cotonete de algodão no tubo de microcentrifusagem preenchido com soro e gire-o no sentido horário e anti-horário 5 vezes. A ponta metálica do cotonete deve ser cortada para que se encaixe inteiramente no tubo de microcentrifuuge e a tampa possa ser fechada.</li>
		<li>Coloque o tubo de microcentrifuge contendo a ponta de algodão esfregado em uma máquina de vórtice e vórtice em alta velocidade por 1 min.</li>
		<li>Realize a quantificação do vírus através de um ensaio de placa nestas amostras. NOTA: Esta etapa de quantificação precisa ser realizada nos dias 2, 4 e opcionalmente em 6 dias após a infecção.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação de vírus por ensaio de placa NOTA: Para realizar um ensaio de placa, cresça e emplaque células Vero em uma placa de 6 poços e garanta 90% de confluência de células antes do início do ensaio. Use um frasco confluente de 75 cm2 dessas células. Todas as etapas abaixo precisam ser realizadas dentro de um armário de biossegurança.<ol>
<li>Lave a monocamada confluente das células Vero no frasco com 10 mL de soro fisco tampão de fosfato fresco (PBS) após aspirar o meio de cultura. Repita o passo de lavagem mais uma vez com PBS depois de aspirar o primeiro conjunto de solução de lavagem.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 0,05% trypsin à monocamada celular. Incubar o frasco a 37 °C por 5 min. A olho nu, certifique-se de que as células se desvincularão da superfície interna do frasco. Se não, espere mais 5 minutos antes de examinar o frasco novamente. Quando as células parecerem separadas, adicione 9 mL de toda a mídia à monocamada para garantir que as células se desalojam completamente da superfície do frasco.</li>
		<li>Colete todas as células do frasco junto com toda a mídia e coloque-as em um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Para cada poço das 6 placas que são usadas para ensaio de placa, use 300 μL do tubo centrífuga. Cubra cada poço da placa de 6 poços com 2 mL de mídia inteira. Deixe as placas na incubadora durante a noite para permitir que elas cresçam e formem uma monocamada confluente em cada poço.</li>
		<li>Para realizar um ensaio de placa, realizar uma diluição serial das amostras precisa ser realizada antes da quantificação do vírus.</li>
		<li>Realize uma diluição de101 vezes do vírus em tubos de microcrífugas usando mídia livre de soro até que uma diluição de 10-8 seja alcançada. Quando em uma diluição de 10-3, transfira 1 mL da diluição para a monocamada de células banhadas depois de aspirar a mídia de crescimento nas células da placa de 6 poços, este será o passo da infecção. Incubar a placa infectada a 37 °C incubadora por 2 h.</li>
		<li>Aspire a mídia de infecção existente, lave com PBS duas vezes suavemente para revestir células e adicione 2 mL de mídia carregada de metilcelulose por poço a todos os 6 poços. Incubar por 72 h ou até que a formação de placas possa ser vista. As placas podem ser identificadas pela formação de pequenas lacunas entre as células da monocamada celular.</li>
		<li>Adicione 1 mL de metanol lentamente ao canto de cada poço, usando a parede como ponta guia. Incubar a placa de 6 poços à temperatura ambiente por 15 minutos. Aspire lentamente o conteúdo de cada poço da placa sem perturbar ou agitar a monocamada celular.</li>
		<li>Adicione 1 mL de solução de trabalho cristal violeta a cada poço de 6 placas de poço, garantindo que todas as células estejam cobertas. Incubar a placa de 6 poços no escuro por 30 minutos. Descarte a solução violeta cristalina aspirando-a e seque os poços em uma folha de papel absorvente.</li>
		<li>Conte o número de placas no poço de diluição mais alta para quantificar o conteúdo total do vírus na solução inicial. Repita o processo duas vezes para confirmar o título viral.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li>
<li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li>
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<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li>
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<li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559(2017).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+Histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li>
<li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861(2018).</li>
<li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há conflito de interesses e nenhum interesse financeiro concorrente.

Pesquisas anteriores mostraram que o BX795 tem um papel promissor como agente antiviral contra a infecção pelo HSV-1; inibindo a quinase de ligação tank 1 (TBK1)16. Tanto o TBK1 quanto a autofagia desempenharam um papel em ajudar a inibir a infecção pelo HSV-1, como demonstrado nas células epiteliais da córnea humana. O BX795 mostrou-se extremamente eficaz com a atividade antiviral em uma concentração de 10μM e usando tanto a análise de manchas ocidentais quanto a análise de placas virais das prin...

Pessoas que sofrem de infecções oculares muitas vezes incorrem em perda de visão1. Com alta soroprevalência em todo o mundo, indivíduos infectados pelo HSV sofrem de infecções oculares recorrentes que levam a cicatrizes na córnea, ceratite estromica e neovascularização2,3,4,5. As infecções por HSV também têm se mostrado com menos frequência, uma série de condições graves entre pacientes imunocomprometidos e não tratados como encefalite e morbidade sistêmica6,7,8. Drogas como o Acyclovir (ACV) e seus análogos nucleosídeos têm mostrado sucesso consistente na contenção da infecção do HSV-1 e até mesmo na reativação decontrole,mas o uso prolongado dessas drogas está associado à insuficiência renal, anormalidades fetais e falha em restringir o surgimento da resistência a drogas às cepas virais em evolução9,10,11,12,13. Complexidades associadas às infecções oculares do HSV-1 foram previamente estudadas in vitro usando monocamadas e culturas 3D de células córneas humanas e in vivo usando infecções oculares de murina ou coelho. Embora esses modelos in vitro forneçam dados significativos sobre os componentes biológicos celulares das infecções pelo HSV-1, eles, no entanto, não conseguem imitar a complexidade intrincada do tecido córnea e pouco fazem para iluminar a propagação dendrítica do vírus14. Em contraste, embora os sistemas in vivo sejam mais perspicazes em mostrar infecção espalhada em córneas e respostas de ativação imunológica durante a infecção pelo HSV-1, eles vêm com a ressalva de que eles exigem pesquisadores treinados e grandes instalações para cuidados com animais para ignorar os experimentos.
Aqui usamos córneas suínas como modelo ex vivo para examinar o sistema de feridas induzidas pela infecção por HSV-1. Tanto a farmacologia potencial de certas drogas quanto a biologia celular e molecular do sistema de feridas causada pela infecção podem ser estudadas através de culturas de explanta tecidual. Este modelo também pode ser alterado para uso de outras infecções virais e bacterianas. Neste estudo, foram utilizadas córneas suínas para testar a eficácia antiviral de uma pequena molécula pré-clínica, BX795. O uso de córneas suínas foi preferido devido à facilidade de acesso e custo-benefício. Além disso, os modelos suínos de córneas são bons modelos de olhos humanos, sendo as córneas fáceis de isolar, adequadamente dimensionadas para infecção e visualização e robustas para manusear15. As córneas suínas também são comparáveis à complexidade dos modelos de córnea humanas tanto na permeabilidade da córnea trans quanto na absorção sistêmica15. Usando este modelo para o estudo, pudemos elucidar como o BX795 é digno de uma investigação mais aprofundada como um inibidor competente da infecção pelo vírus HSV-1 e adiciona à literatura de classificá-lo como um potencial composto antiviral de pequenas moléculas16.

<table><tbody><tr><td>Agulhas hipodérmicas de 30 G.</td><td>BD</td><td>305128</td> frasco de vidro de <td></td></tr><tr><td>500 mL.</td><td>Thomas Scientific</td><td>844027</td><td></td></tr><tr><td>Antimicótico e Antibiótico (AA)</td><td>GIBCO</td><td>15240096</td><td>Alíquota em tubos de 5 mL e mantenha congelado até o uso</td></tr><tr><td>no vórtice de bancada.</td><td>Gabinete de</td> biossegurança BioDot <td>BDVM-3200</td><td></td></tr><tr><td>com certificação Bio-Safety Level-2 (BSL-2).</td>Cotonetes Padrão de Alginato de Cálcio Estéril <td>Herasafe 2030i</td><td></td> <td>da Thermofisher Scientific</td></tr><tr><td>6".</td><td>Raspador</td><td>de células Puritan 22029501</td><td></td></tr><tr><td>- 25 cm</td><td>Biologix BE</td><td>70-1180 70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Cristal violeta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6158</td><td>Armazene o pó em um local escuro</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s médio - DMEM</td><td>GIBCO</td><td>41966029</td><td>Loja em 4 & C até o uso</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino -FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Alíquota em tubos de 50 mL e mantenha congelado até o uso</td></tr><tr><td>Pinças de borda plana - ndash; 2.Harward</td> <td>Instruments</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>Freezers --80 &deg;C. -</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>13 100 790</td><td></td></tr><tr><td>Caixa fresca de lâminas.</td><td>Thomas Scientific</td><td>TE05091</td><td></td></tr><tr><td>Guaze</td><td>Johnson & Pasta Johnson</td><td></td><td>de 108 polegadas quadradas 12 camadas</td></tr><tr><td>HSV-1 17GFP</td><td>cultivada em linhagem original</td><td></td> <td>da Dra. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressando HSV-1 cepa 17</td></tr><tr><td>Insulina, Transferrina, Selênio - ITS</td><td>GIBCO</td><td>41400045</td><td>Alíquota em tubos de 5 mL e mantenha congelado até o uso</td></tr><tr><td>Agitador magnético.</td><td>Tesoura Metálica Thomas Scientific</td><td>H3710-HS</td><td></td></tr><tr><td>.</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas 1 a 1000 &micro;L.</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M37</td><td></td></tr><tr><td>Mínimo Essencial Médio - MEM</td><td>GIBCO</td><td>11095080</td><td>Loja em 4 &deg; C até o uso</td></tr><tr><td>OptiMEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985047</td><td>Loja em 4 &deg; C até o uso</td></tr><tr><td>de penicilina/estreptomicina.</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td>Alíquota em tubos de 5 mL e mantenha congelado até o uso</td></tr><tr><td>Tampão fosfato solução salina -PBS</td><td>GIBCO</td><td>10010072</td><td>Armazene em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Porcine Corneas</td><td>Park Packaging Co., Chicago, IL</td><td></td><td>Pedido especial por solicitação</td></tr><tr><td>Procedimento de coberturas de bancada - conforme necessário.</td>Pipetas sorológicas <td>Thermofisher Scientific</td><td>S42400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thomas Scientific</td><td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento de pipetagem sorológica.</td><td>Estereoscópio</td><td>Thomas Scientific Ezpette Pro</td><td></td></tr><tr><td>Carl</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery V20</td><td></td></tr><tr><td>Ímã de agitação.</td><td>Thomas Scientific</td><td>F37120</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos, T175 cm2.</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1275</td><td></td></tr><tr><td>Incubadoras de cultura de tecidos que podem manter 5% de CO2 e 37 &deg; C temperatura.</td>Placas tratadas com cultura de tecidos <td>Thermofisher Scientific</td><td>Forma 50145523</td><td></td></tr><tr><td>(6 poços).</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>GIBCO</td><td>25-300-062</td><td>Alíquota em tubos de 10 mL e mantenha congelado até o uso</td></tr><tr><td>Células Vero</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

explante de tecido córnea porcina para estudar a eficácia do vírus herpes simplex-1

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

Vírus e bactérias podem causar uma variedade de defeitos da superfície ocular e degeneração, como feridas e úlceras através de infecção corneal. Com uma soroprevalência que varia de 60 a 90% em todo o mundo, o Vírus Herpes Simplex tipo-1 (HSV-1) geralmente causa lesões mucocutâneas da região orofacial que também se manifestam como lesões e cegueira associada à infecção. Embora as drogas antivirais atuais sejam eficazes, o surgimento de resistência e persistência de efeitos colaterais tóxicos requer o desenvolvimento de novos antivirais contra este patógeno onipresente. Embora a avaliação in vitro forneça alguns dados funcionais sobre um antiviral emergente, eles não demonstram a complexidade do tecido ocular in vivo. No entanto, os estudos in vivo são caros e exigem pessoal treinado, especialmente quando se trabalha com agentes virais. Portanto, os modelos ex vivo são passos eficientes, mas baratos para testes antivirais. Aqui discutimos um protocolo para estudar a infecção pelo HSV-1 usando córneas suínas ex vivo e um método para tratá-los topicamente usando drogas antivirais existentes e novas. Também demonstramos o método para realizar um ensaio de placa usando o HSV-1. Os métodos detalhados podem ser usados para realizar experimentos semelhantes para estudar infecções que se assemelham ao patógeno HSV-1.

Para entender a eficácia dos antivirais experimentais, eles precisam ser testados extensivamente antes de serem enviados para testes clínicos in vivo em humanos. Nesse sentido, devem ser identificados controles positivos, controle negativo e grupos de testes. Trifluorothymidina (TFT) tem sido usada há muito tempo como o tratamento preferido para tratar a ceratite de herpes topicamente16. Usados como controle positivo, os grupos córneas tratados com TFT mostram menor propagação de infecções. Como c...

Descrevemos o uso de uma córnea suína para testar a eficácia antiviral de drogas experimentais.

Explante de tecido córnea porcina para estudar a eficácia do vírus Herpes Simplex-1

Viruses and bacteria can cause a variety of ocular surface defects and degeneration such as wounds and ulcers through corneal infection. With a ...

Entender a eficácia das drogas em modelos animais é custo e trabalho intensivo. Nosso protocolo que utiliza um modelo ex vivo de ex-plantas de tecido é significativamente menor tanto em termos de custo quanto de pessoal científico necessário para conduzir o estudo. A principal vantagem dessa técnica é o uso de olhos suínos, que têm anatomia e fisiologia muito semelhantes aos olhos humanos em oposição a alguns outros pequenos modelos animais.Quando testamos drogas in vitro, elas podem mostrar eficácia que pode estar ausente em modelos animais ou humanos. Sistemas de tecidos ex vivo são a melhor maneira de entender se nossos sistemas in vitro podem ou não ser traduzidos em testes em animais e humanos. O sistema de córnea suína, embora menos intensivo em mão-de-obra, requer habilidades capacitáveis para isolar, manter, infectar e tratar com as drogas, especialmente o processo de isolamento da córnea de todo o olho suíno é complicado de expressar em palavras, mas requer demonstração visual.Ao receber olhos suínos de um fornecedor adequado, armazene os tecidos no gelo até o processamento e coloque os equipamentos de proteção pessoal adequados. Desinfete a área de trabalho com 70% de eta

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste artigo de vídeo que descreve o uso de um...

Ex Vivo modelo organotípico córnea de Agudos Herpes simplex vírus tipo epiteliais eu Infecção

A maioria dos estudos de doença herpética corneal utilizar um modelo de infecção primária. No entanto, a infecção primária por HSV-1 normalmente não conduzem à doença humana. Aqui nós descrevemos um modelo recorrente de doenças da córnea herpética, que mais imita a doença humana.

Ceratite herpética recorrente Estroma em camundongos, um modelo para estudar HSK Humanos

Este vídeo descreve um protocolo para configurar um modelo ex vivo para ceratite bacteriana usando um botão corneoescleral dissecado do olho suíno. As bactérias inoculadas atravessam as incisões epiteliais da córnea para invadir o estroma subjacente e estabelecer uma infecção nos tecidos da córnea que imita a infecção in vivo.

Modelo de Córnea Ex vivo de Ceratite Bacteriana em Suínos: Uma Técnica para Estabelecer Infecção Bacteriana em Células Epiteliais da Córnea

Este vídeo demonstra um procedimento não invasivo assistido por laser para danificar seletivamente as células endoteliais da córnea no olho suíno. O modelo ex vivo desenvolvido de dano às células endoteliais pode ser usado para estudar doenças do endotélio da córnea.

Ablação seletiva assistida por laser de células endoteliais da córnea suína: uma técnica para induzir lesão endotelial da córnea suína focada para estudos ex vivo

Este vídeo demonstra o método para realizar um ensaio de placa usando um vírus obtido da córnea suína infectada. A córnea suína é usada para testar a eficácia antiviral de drogas experimentais.

Determinando a eficácia antiviral de drogas experimentais por meio de um ensaio de placa

A pele é um tecido-alvo do patógeno humano vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Para explorar a rota de invasão do HSV-1 no tecido, estabelecemos um modelo de infecção ex vivo de lâminas epidérmicas murinas que representam a camada mais externa da pele.

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

Este artigo descreve um protocolo passo a passo para criar um modelo de ceratite porcina ex vivo de ceratite bacteriana. Pseudomonas aeruginosa é usado como organismo prototípico. Este modelo inovador imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea.

Estabelecendo um modelo de córnea porcina ex vivo para estudar tratamentos medicamentosos contra ceratite bacteriana

Desenvolvemos um modelo de rato de inflamação grave da córnea por meio de curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea. O estudo avaliou os padrões de inflamação da córnea, proliferação epitelial e alterações nas células-tronco límbicas sob condições inflamatórias.

Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

A cultura de órgãos ex vivo da córnea suína e a cicatrização de feridas epiteliais fornecem um meio econômico, ético, reprodutível e quantitativo para testar a toxicidade ocular de produtos químicos. Eles também ajudam a elucidar os mecanismos subjacentes à regulação da epitelização e reparo tecidual e na avaliação terapêutica para o tratamento de ceratopatia diabética e cicatrização retardada de feridas.

Avaliação da toxicidade terapêutica e química usando córneas suínas cultivadas em órgãos e cicatrização de feridas epiteliais

O sistema de genética reversa para o vírus da febre Rift Vale cepa vacinal MP-12 é uma ferramenta útil para a criação de adicionais MP-12 mutantes com atenuação aumentada e imunogenicidade. Nós descrevemos o protocolo para gerar e caracterizar NSS cepas mutantes.

Usando genética reversa para manipular o NSS Gene do vírus da febre Rift Valley MP-12 Strain para melhorar a segurança e eficácia da vacina

Aprenda a isolar e tratar córneas porcinas ex vivo para testar a eficácia de drogas antivirais contra Herpes Simplex-1. Este método oferece uma alternativa econômica e menos trabalhosa aos modelos animais tradicionais.

Explante de tecido córnea porcina para estudar a eficácia do vírus Herpes Simplex-1

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