Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo
12 de abril de 2021
Este estudo apresenta a aplicação de fatias de tecido pancreático vivo ao estudo da fisiologia da ilhota e interações ilhotas-células imunes.
Nosso protocolo ajudará a responder o impacto que as interações com células imunes têm na funcionalidade da ilhota. O método de fatia de tecido pancreático vivo permite que a fisiologia e a função da ilhota sejam estudadas, mantendo os tecidos subjacentes às patologias e ao microambiente nativo. Esse método poderia fornecer insights sobre os processos da doença de doenças pancreáticas, como pancreatite, diabetes tipo I e diabetes tipo II.
Para começar, organize os blocos no suporte da amostra de forma que eles não excedam a largura da lâmina, garantindo que a lâmina possa mover para a frente a distância menos possível quando o vibratome se mover lentamente. Aplique uma linha de super cola no suporte da amostra, fazendo uma camada fina usando a extremidade do distribuidor de cola, em seguida, vire os blocos de tecido sobre a cola para que o lado próximo ao tecido fique virado para cima. Empurre suavemente os blocos e deixe a cola secar por três minutos.
Em seguida, conecte a placa ao vibratome com um parafuso e ajuste a altura e distância da lâmina que está sendo percorrida para que a lâmina se mova sobre o comprimento dos blocos e apenas pouco acima deles. Empurre suavemente os blocos com os fórceps para verificar secar a cola e, em seguida, encha a bandeja de vibratome com uma solução extracelular resfriada até que a lâmina esteja coberta. Coloque o vibratome para fazer fatias de 120 micrômetros de espessura e inicie-o, em seguida, observe as fatias saindo dos blocos de tecido.
Levante as fatias quando flutuarem para fora do bloco colocando um pincel ou fórceps abaixo delas e coloque as fatias no tampão de bicarbonato Krebs-Ringer contendo três milimães de glicose D e inibidor de trypsina. Coloque as placas contendo as fatias em um roqueiro e incubar em temperatura ambiente por uma hora a 25 RPM. Se as fatias precisarem ser mantidas por mais tempo, coloque as fatias em 15 mililitros de cultura de fatia e coloque a placa em uma incubadora.
Incubar as fatias preparadas a 37 graus Celsius para estudos no mesmo dia ou transferir as fatias que são cultivadas a 24 graus Celsius durante a noite para 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes do experimento. Ligue o microscópio pelo menos uma hora antes da gravação e equilibre a incubadora superior do palco para 37 graus Celsius. Fixar a placa de vidro de vidro de cobertura contendo a fatia no palco.
Concentre o microscópio definindo o objetivo de 10X no modo brightfield e localize as ilhotas usando o modo de campo brilhante procurando ovais cor-de-laranja dentro da fatia. Mude o microscópio para imagens confocal, pressionando o botão CS no controlador de tela de toque do microscópio. Para ver as ilhotas usando reflectância, ligue o detector de laser 638 e o detector PMT.
Defina a potência do laser entre um e 2% e desligue os filtros de entalhe. Use o laser de 405 nanômetros e o detector PMT para observar a mancha de ácido nucleico. O detector híbrido para a detecção de anticorpos CD8 e o laser de 488 nanômetros e detector híbrido para visualizar o tetramer de insulina.
Centralize a ilhota de interesse no campo de visão usando os botões X e Y do controlador de palco. Uma vez localizada uma ilhota de interesse, mude para o objetivo de 20X e amplie para que a ilhota assuma a maior parte do quadro. Pegue uma pilha de z da ilhota, então encontre as melhores seções ópticas onde as células estão vivas e todas as células imunes circundantes estão em foco.
Defina o microscópio para gravar no modo XYZT e otimize as configurações para gravar uma pilha de z das etapas selecionadas a cada 20 minutos durante um período de várias horas. As ilhotas em uma fatia de tecido pancreático foram visualizadas usando campo brilhante e microscopia de luz refletida. A insulina nas ilhotas aumenta a granularidade e causa absorção de grandes quantidades de luz refletida, aumentando a visibilidade das ilhotas.
A viabilidade de uma fatia de tecido pancreático humano vivo foi avaliada pela coloração. As células vivas são indicadas em verde e as células mortas em azul. Outro indicador positivo para viabilidade é a atividade basal observável.
Quando uma fatia pancreática viva foi carregada com um indicador de cálcio permeável celular, a estimulação de glicose foi observada em fatias de camundongos e pancreáticos humanos. A fluorescência de células individuais durante a estimulação da glicose também foi quantificada. Ilhotas intactas e doentes foram observadas utilizando-se manchas de dithizone e microscopia de luz refletida.
As ilhotas doentes começam a perder granularidade devido à infiltração de células imunes e morte celular. Populações de células imunes podem ser identificadas usando anticorpos CD8 e coloração de tetramer de insulina. A co-coloração indica que as células são efeitos ou células T que estão especificamente mirando o antígeno de insulina.
A coisa mais crítica a ser lembrada neste procedimento é manter as fatias em soluções inibidoras de protease o tempo todo. Após esse procedimento, inúmeras funcionalidades em experimentos com células imunes podem ser realizadas permitindo que o efeito das interações com células imunes e a função de ilhotas sejam estudados.
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Visão Geral
Este estudo apresenta a aplicação de fatias de tecido pancreático vivo ao estudo da fisiologia das ilhotas e das interações entre ilhotas e células imunes. O método permite a examinação da funcionalidade das ilhotas, preservando o microambiente nativo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imunologia
Fundamentos
- As células das ilhotas desempenham um papel crucial no metabolismo da glicose.
- As interações com células imunes podem impactar a função das ilhotas.
- Compreender essas interações é vital para abordar doenças pancreáticas.
- Fatias de tecido vivo mantêm o contexto fisiológico das células.
Propósito do Estudo
- Investigar o impacto das interações de células imunes na funcionalidade das ilhotas.
- Fornecer insights sobre doenças pancreáticas como diabetes tipo I e tipo II.
- Desenvolver um método que preserve patologias e microambientes do tecido.
Métodos Utilizados
- Preparação de fatias de tecido pancreático vivo.
- Utilização de um vibratomo para fatiamento preciso.
- Aplicação de super cola para estabilização do bloco de tecido.
- Observação das interações entre ilhotas e células imunes em tempo real.
Principais Resultados
- O método de fatias de tecido pancreático vivo preserva efetivamente a fisiologia das ilhotas.
- As interações de células imunes mostraram-se afetar significativamente a função das ilhotas.
- Esta abordagem permite o estudo de patologias subjacentes.
- Os insights obtidos podem informar estratégias de tratamento para doenças pancreáticas.
Conclusões
- Fatias de tecido pancreático vivo são uma ferramenta valiosa para estudar a fisiologia das ilhotas.
- O método pode melhorar a compreensão das interações imunes na função das ilhotas.
- Pesquisas futuras podem se basear nesses achados para abordar distúrbios pancreáticos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Live pancreatic tissue slices enable direct observation of islet-immune cell interactions within a preserved native microenvironment, offering a physiologically relevant system for mechanistic de-risking in diabetes target validation. This approach supports predictive confidence by maintaining tissue viability and underlying pathologies such as type 1 and type 2 diabetes, allowing R&D teams to assess therapeutic hypotheses in a disease-relevant context. The method bridges discovery biology and translational research by providing quantitative, real-time readouts of islet function and immune cell dynamics critical for go/no-go decisions in early diabetes drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing immune cell infiltration and its direct impact on islet granule integrity and insulin release.
- Operational Value: Preserves native tissue architecture and cellular interactions, reducing mechanistic ambiguity in target validation for immunomodulatory diabetes therapies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking immune cell activity to functional islet decline, providing a biomarker-aligned readout for target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts from calcium indicators and insulin tetramer staining to assess dose-dependent compound effects on islet function.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging protocols, ensuring reproducible baseline measurements across experimental runs and model systems.
- Scalability: Compatible with time-lapse microscopy and z-stack acquisition, enabling longitudinal monitoring of immune cell dynamics over several hours.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains underlying pathologies from human and mouse pancreatic tissue, allowing study of type 1 and type 2 diabetes mechanisms in a disease-relevant system.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation by preserving intercellular interactions critical for immune-mediated islet dysfunction.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables visualization of effector T-cell interactions with insulin antigens via CD8 and insulin tetramer co-staining, supporting mechanism-based go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The live pancreatic tissue slice method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical research, providing a disease-relevant system that maintains tissue viability and microenvironment for mechanistic studies of islet-immune interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time observation of immune cell impact on islet physiology, clarifying pathways involved in diabetes pathogenesis.
- Screening: Delivers assay-ready tissue slices with quantitative outputs from glucose-stimulated calcium flux and insulin tetramer binding, facilitating reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates XYZT time-lapse data and z-stack optical sections, allowing teams to quantify cellular responses and immune cell localization over time.
- Translational Research: Maintains disease-relevant pathologies and native microenvironment, supporting continuity from discovery through preclinical validation of immunomodulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying islet function across multiple disease models and therapeutic modalities, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct visualization of islet-immune interactions in intact tissue.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via controlled slicing, incubation, and imaging protocols that maintain slice viability and function.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immune cell activity to functional islet decline, reducing late-stage biological risk in diabetes drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on their ability to mitigate immune-mediated islet dysfunction in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, vibratome sectioning, and confocal microscopy for live imaging of immune cell dynamics.
- Dependent on instrumentation including a vibratome, confocal microscope with laser detectors (405nm, 488nm, 638nm), and stage-top incubator for environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation, buffer composition (Krebs-Ringer bicarbonate with D-glucose and trypsin inhibitor), and incubation conditions to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems (human vs. mouse) or disease states (T1D vs. T2D) to maintain tissue viability and pathological relevance.
- Includes practical limitations such as the need for protease inhibitors to preserve slice integrity and the technical challenge of maintaining optical clarity during long-term time-lapse imaging.
