Name: Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Aprenda a preparar fatias de tecido pancreático ao vivo para estudar a fisiologia das ilhotas e interações com células imunes. Este método preserva o microambiente nativo e permite investigar doenças como diabetes tipo I e II.

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Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 e P01 AI042288. Esta pesquisa foi realizada com o apoio da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), um projeto colaborativo de pesquisa de diabetes tipo 1 patrocinado pela JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e o Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Os conteúdos e opiniões expressos são de responsabilidade de seus autores e não refletem necessariamente a visão oficial do nPOD. As Organizações de Aquisição de Órgãos (OPO) em parceria com a nPOD para fornecer recursos de pesquisa estão listadas em http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Obrigado ao Dr. Kevin Otto, universidade da Flórida, por fornecer o vibratome usado para gerar fatias de rato.

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
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<li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine%2C+porcine%2C+and+bovine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses concorrentes.

O objetivo deste protocolo é explicar a geração de fatias de pâncreas e os procedimentos necessários para empregar as fatias em estudos funcionais e imunológicos. Há muitos benefícios em usar fatias pancreáticas vivas. No entanto, existem várias etapas críticas que são essenciais para que o tecido permaneça viável e útil durante os protocolos de experimento descritos. É imperativo trabalhar rapidamente. O tempo entre injetar o pâncreas e gerar as fatias no vibratome deve ser minimizado para manter a viabilidade do tecido...

O envolvimento do pâncreas é pathognomônico a doenças como pancreatite, T1D e T2D1,2,3. O estudo da função em ilhotas isoladas geralmente envolve a remoção das ilhotas de seu ambiente circundante4. O método de fatia de tecido pancreático vivo foi desenvolvido para permitir o estudo do tecido pancreático, mantendo microambientes intactos de ilhotas e evitando o uso de procedimentos estressantes de isolamento de ilhotas5,6,7. Fatias de tecido pancreático do tecido doador humano têm sido usadas com sucesso para estudar T1D e demonstraram processos de perda e disfunção de células beta, além da infiltração de células imunes8,9,10,11,12,13. O método de fatia de tecido pancreático vivo pode ser aplicado tanto no tecido pancreático humano5,6,8. As fatias de tecido pancreático humano de tecidos doadores de órgãos são obtidas através de uma colaboração com a Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD). As fatias do mouse podem ser geradas a partir de uma variedade de cepas diferentes de mouse.
Este protocolo se concentrará na recombinação diabética não obesa ativando gene-1-nulo (NOD). Rag1-/-) e receptor de células T transgênicos (AI4) (NOD. Rag1-/-. Cepas de camundongos AI4 α/β). ACENO. Os camundongos são incapazes de desenvolver células T e B devido a uma interrupção no gene ativador de recombinação 1 (Rag1)14. ACENO. Rag1-/-. Camundongos aI4 α/β são usados como modelo para diabetes tipo 1 acelerado porque produzem um único clone de células T que tem como alvo um epítope de insulina, resultando em infiltração consistente de ilhotas e desenvolvimento rápido de doenças15. O protocolo aqui apresentado descreve procedimentos para estudos funcionais e imunológicos utilizando fatias pancreáticas humanas e de camundongos vivas através da aplicação de abordagens de microscopia confocal. As técnicas aqui descritas incluem avaliações de viabilidade, identificação e localização de ilhotas, registros citosóicos do Ca2+, bem como coloração e identificação de populações de células imunes.

<table><tbody><tr><td>#3 Estilo Bisturi Punho</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>HEPES Buffer, Solução 1M</td></tr><tr><td>10 cm Prato de Cultura Não Tratado</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer-Lok de 10 mL Seringa</td><td>BD</td><td>301029</td><td>BD com Pontas Luer-Lok</td></tr><tr><td>Agulha de 27 G</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>Agulhas hipodérmicas BD de uso geral e precisãoGlide</td></tr><tr><td>35 mm placa de Petri com fundo de lamínula</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro;-Dish 35 mm,</td></tr><tr><td>seringa alta de 50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>lamínula com câmara de 8 poços</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro;-Slide 8 Well</td></tr><tr><td>APC anticorpo CD8a anti-rato</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (di-hidratado)</td></tr><tr><td>Compact Digital Rocker</td><td>Thermo Fisher Microscópio</td> de varredura a <td>laser confocal 88880020</td><td></td></tr><tr><td>científica</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Pinhole&thinsp;= 1,5-2 unidades arejadas; adquirido com objetivas HC PL APO CS2 secas de abertura numérica de 10x/0,40 e HC PL APO CS2 secas de abertura numérica de 20x/0,75 a 512 e thinsp; &vezes; &thinsp; Resolução de 512 pixels</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>Dimethyl sulfoxide</td></tr><tr><td></td><td>Ethanol Decon Laboratories</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos Falcon 35 mm</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Falcon Placas de cultura de tecidos de fácil aderência</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Feather No. 10 Surgical Blade</td><td>Microscopia</td> eletrônica <td>Ciências 7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>indicador Ca2+ permeável a células</td></tr><tr><td>Super Cola</td> <td>de controle de gelLoctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina Endurecida</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks Solução Saleira Balanceada</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Fisherbrand</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>Grampo de Bulldog Johns Hopkins</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-7440</td><td>&nbsp; Reto; 500-900 gramas de pressão; Kimwipes de 1,5" de Comprimento</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td></td><td>Kimtech Science&trade; Kimwipes&trade; Limpadores de Tarefas Delicadas, Kit de Viabilidade</td></tr><tr><td>/Citotoxicidade VIVO/MORTO</td> de 2 Camadas <td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Este kit contém o corante de células vivas calceína-AM.</td></tr><tr><td>Baixo teor de glicose DMEM</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl2 (hexahidratado)</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO4 (heptahidratado)</td></tr><tr><td>Plataforma aquecida magnética</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-1</td><td>Plataforma para câmara de imagem para estimulação dinâmica gravações</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Filtro de seringa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>No.4 Pincel</td><td>Michaels</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de imagem de banho de diamante aberto</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td>Câmara de imagem para gravações de estimulação dinâmica</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>permeável a células Ca2+ indicador</td></tr><tr><td>Câmara de imagem noturna</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td>Para fazer agarose para geração de fatias</td></tr><tr><td>Tetrâmero de insulina marcado com PE</td><td>Emory Tetramer Research Sequência central</td><td>YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>71998</td><td>para vibratome; Aço inoxidável de borda dupla, não revestido</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque agarose de baixo ponto de fusão Lonza</td><td></td><td>50101</td><td>Para fazer agarose para geração de fatias</td></tr><tr><td>Âncora de fatia</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>Âncora de fatia (imagem dinâmica)</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Âncora de fatia para câmara</td></tr> <tr><td>de imagem dinâmicaBicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monohidratado</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4 (monohidratado)</td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina de soja</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>Inibidor de tripsina de Glycine max (soja)</td></tr><tr><td>Estágio Adaptador</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>Para ajustar a câmara de imagem para gravações de estimulação dinâmica no estágio do microscópio</td></tr><tr><td>Incubadora de palco</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscópio</td><td>Leica</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Coloração de Células Mortas Azuis</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>coloração de ácido nucleico fluorescente azul</td></tr><tr><td>Pipeta de Transferência</td><td>Falcão</td><td>357575</td><td>Falcon&trade; Sistema de controle de válvula de pipetas de transferência descartáveis de plástico</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>VCS-8</td><td>Sistema para gravações de estimulação dinâmica</td></tr><tr><td>Vibratome VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td>Fisherbrand Isotemp Banho-maria de luxo de uso geral GPD 02</td></tr></tbody></table>

observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

As fatias vivas de tecido pancreático permitem o estudo da fisiologia da ilhota e funcionam no contexto de um microambiente de ilhotas intactos. As fatias são preparadas a partir de tecido pancreático humano vivo e rato embutido em agarose e cortado usando um vibratome. Este método permite que o tecido mantenha viabilidade e função, além de preservar patologias subjacentes como diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D). O método de fatia permite novas direções no estudo do pâncreas através da manutenção das estruturas complexas e de diversas interações intercelulares que compõem os tecidos endócrinos e exócrinos do pâncreas. Este protocolo demonstra como realizar a coloração e microscopia de lapso de tempo de células imunes endógenas vivas dentro de fatias pancreáticas, juntamente com avaliações da fisiologia da ilhota. Além disso, essa abordagem pode ser refinada para discernir populações de células imunes específicas para antígenos de células ilhotas usando grandes reagentes complexos-multimers de histocompatibilidade.

Este protocolo produzirá fatias de tecido pancreático ao vivo adequadas tanto para estudos de funcionalidade quanto para gravações de células imunes. A aparência de fatia em campo brilhante e sob luz refletida são mostradas na Figura 1A,B. Como discutido, as ilhotas podem ser encontradas em fatias usando luz refletida devido à sua granularidade aumentada que ocorre devido ao seu teor de insulina (Figura 1C) e são claramente observadas em compara...

Este estudo apresenta a aplicação de fatias de tecido pancreático vivo ao estudo da fisiologia da ilhota e interações ilhotas-células imunes.

Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Nosso protocolo ajudará a responder o impacto que as interações com células imunes têm na funcionalidade da ilhota. O método de fatia de tecido pancreático vivo permite que a fisiologia e a função da ilhota sejam estudadas, mantendo os tecidos subjacentes às patologias e ao microambiente nativo. Esse método poderia fornecer insights sobre os processos da doença de doenças pancreáticas, como pancreatite, diabetes tipo I e diabetes tipo II.Para começar, organize os blocos no suporte da amostra de forma que eles não excedam a largura da lâmina, garantindo que a lâmina possa mover para a frente a distância menos possível quando o vibratome se mover lentamente. Aplique uma linha de super cola no suporte da amostra, fazendo uma camada fina usando a extremidade do distribuidor de cola, em seguida, vire os blocos de tecido sobre a cola para que o lado próximo ao tecido fique virado para cima. Empurre suavemente os blocos e deixe a cola secar por três minutos.Em seguida, conecte a placa ao vibratome com um parafuso e ajuste a altura e distância da lâmina que está sendo percorrida para que a lâmina se mova sobre o comprimento dos blocos e apenas pouco acima deles. Empurre suavemente os blocos com os fórceps para verificar secar a cola e, em seguida, encha a bandeja de vibratome com uma solução extracelular resfriada até que a lâmina esteja coberta. Coloque o vibratome para fazer fatias de 120 micrômetros de espessura e inicie-o, em seguida, observe as fatias saindo dos blocos de tecido.Levante as fatias quando flutuarem para fora do bloco colocando um pincel ou fórceps abaixo delas e coloque as fatias no tampão de bicarbonato Krebs-Ringer contendo três milimães de glicose D e inibidor de trypsina. Coloque as placas contendo as fatias em um roqueiro e incubar em temperatura ambiente por uma hora a 25 RPM. Se as fatias precisarem ser mantidas por mais tempo, coloque as fatias em 15 mililitros de cultura de fatia e coloque a placa em uma incubadora.Incubar as fatias preparadas a 37 graus Celsius para estudos no mesmo dia ou transferir as fatias que são cultivadas a 24 graus Celsius durante a noite para 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes do experimento. Ligue o microscópio pelo menos uma hora antes da gravação e equilibre a incubadora superior do palco para 37 graus Celsius. Fixar a placa de vidro de vidro de cobertura contendo a fatia no palco.Concentre o microscópio definindo o objetivo de 10X no modo brightfield e localize as ilhotas usando o modo de campo brilhante procurando ovais cor-de-laranja dentro da fatia. Mude o microscópio para imagens confocal, pressionando o botão CS no controlador de tela de toque do microscópio. Para ver as ilhotas usando reflectância, ligue o detector de laser 638 e o detector PMT.Defina a potência do laser entre um e 2% e desligue os filtros de entalhe. Use o laser de 405 nanômetros e o detector PMT para observar a mancha de ácido nucleico. O detector híbrido para a detecção de anticorpos CD8 e o laser de 488 nanômetros e detector híbrido para visualizar o tetramer de insulina.Centralize a ilhota de interesse no campo de visão usando os botões X e Y do controlador de palco. Uma vez localizada uma ilhota de interesse, mude para o objetivo de 20X e amplie para que a ilhota assuma a maior parte do quadro. Pegue uma pilha de z da ilhota, então encontre as melhores seções ópticas onde as células estão vivas e todas as células imunes circundantes estão em foco.Defina o microscópio para gravar no modo XYZT e otimize as configurações para gravar uma pilha de z das etapas selecionadas a cada 20 minutos durante um período de várias horas. As ilhotas em uma fatia de tecido pancreático foram visualizadas usando campo brilhante e microscopia de luz refletida. A insulina nas ilhotas aumenta a granularidade e causa absorção de grandes quantidades de luz refletida, aumentando a visibilidade das ilhotas.A viabilidade de uma fatia de tecido pancreático humano vivo foi avaliada pela coloração. As células vivas são indicadas em verde e as células mortas em azul. Outro indicador positivo para viabilidade é a atividade basal observável.Quando uma fatia pancreática viva foi carregada com um indicador de cálcio permeável celular, a estimulação de glicose foi observada em fatias de camundongos e pancreáticos humanos. A fluorescência de células individuais durante a estimulação da glicose também foi quantificada. Ilhotas intactas e doentes foram observadas utilizando-se manchas de dithizone e microscopia de luz refletida.As ilhotas doentes começam a perder granularidade devido à infiltração de células imunes e morte celular. Populações de células imunes podem ser identificadas usando anticorpos CD8 e coloração de tetramer de insulina. A co-coloração indica que as células são efeitos ou células T que estão especificamente mirando o antígeno de insulina.A coisa mais crítica a ser lembrada neste procedimento é manter as fatias em soluções inibidoras de protease o tempo todo. Após esse procedimento, inúmeras funcionalidades em experimentos com células imunes podem ser realizadas permitindo que o efeito das interações com células imunes e a função de ilhotas sejam estudados.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos assistidos por computador romance de grande escala de aquisição e análise de amostras de imunohistoquímica do pâncreas manchadas são descritos: (1) capturar Slice Virtual de toda a seção, (2) a análise em massa de dados em grande escala, (3) Reconstrução de 2D Slices Virtual ; (4) mapeamento 3D ilhéu, e (5) Análise Matemática.

Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Este protocolo esboça um método para a análise quantitativa da formação complexa da proteína do mitofagia especificamente em pilhas beta das amostras preliminares do Islet humano. Esta técnica permite assim a análise da mitofagia do material biológico limitado, que são cruciais em amostras pancreatic humanas preciosas da pilha beta.

Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.

Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

Apresentamos a preparação de fatias agudas de tecido pancreático e seu uso em microscopia de escaneamento a laser confocal para estudar a dinâmica do cálcio simultaneamente em um grande número de células vivas, durante longos períodos de tempo, e com alta resolução espástica.

Microscopia confocal de varredura a laser da dinâmica do cálcio em fatias agudas de tecido pancreático do rato

A imagem in vivo de alta resolução do pâncreas foi facilitada com a janela de imagem intravital pancreática.

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Este protocolo descreve como gerar fatias de pâncreas humano de doadores de órgãos falecidos para estudar a função celular em condições quase fisiológicas. Essa abordagem inovadora permite a investigação de ilhotas normais e estruturalmente danificadas e a intrincada interação entre os compartimentos endócrino e exócrino.

Geração de fatias de tecido pancreático humano para estudar a fisiologia endócrina e exócrina do pâncreas

Aprenda a preparar fatias de tecido pancreático ao vivo para estudar a fisiologia das ilhotas e interações com células imunes. Este método preserva o microambiente nativo e permite investigar doenças como diabetes tipo I e II.

Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

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