Name: Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a quantificar a eferocitose microglial in vitro usando macrófagos derivados de iPSC e células de neuroblastoma SH-SY5Y marcadas com corante pH-sensível. Este ensaio de imagem de alto conteúdo permite avaliar moduladores genéticos e farmacológicos.

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Os autores agradecem ao Dr. Val Millar e ao Dr. Sohaib Nizami por sua assistência com microscopia de alto conteúdo, e o Dr. Daniel Ebner pelo acesso aos microscópios de alto conteúdo. Além disso, os autores agradecem à Dra. Este trabalho foi apoiado pelo Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, referência de subvenção ARUK-2020DDI-OX), com apoio adicional à James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) da Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award do Reino Unido de Parkinson (J-1403); a MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 e Momentum MC_PC_16034 Awards.

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<li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+Alzheimer%27s+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout%2C+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151(2020).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer%27s+disease+not+evident+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li>
<li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+robust+Z%27+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699(2020).</li>
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<li>Diaz-Aparicio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+actively+remodel+adult+hippocampal+neurogenesis+through+the+phagocytosis+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome.</a> Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A microglia tem funções importantes que afetam a iniciação e progressão de doenças neurodegenerativas, incluindo fagocitose de neurônios apoptóticos. A fagocitose microglial prejudicada e a fagocitose inadequada das sinapses têm sido associadas a doenças neurodegenerativas, embora os mecanismos e causalidades subjacentes não sejam bem compreendidos4,23. Este artigo descreve um ensaio de fagocitose para medir a fagocitose de células apoptóticas por macrófagos iPSC, com uma leitura de imagem de lapso de tempo de células vivas ou microscopia de alto conteúdo de células fixas, ou uma combinação de ambos em um único ensaio. Essa versatilidade significa que o ensaio pode ser usado para estudar eventos fagácticos individuais ao longo do tempo em alguns poços ou usado para triagem de alto conteúdo com múltiplas condições ou tratamentos. Uma vez que o ensaio de alto teor é fixado em um único ponto de tempo, várias placas de ensaio podem ser preparadas simultaneamente. O ensaio de alto teor tem utilidade potencial para caracterizar macrófagos/microglia com variantes genéticas associadas à doença ou triagem de inibidores de pequenas moléculas para alterações na fagocitose. O ensaio também pode ser facilmente adaptado para estudar fagocitose de outros modelos de microglia, ou potencialmente astrócitos. O ensaio de fagocitose pode potencialmente ser multiplexado com manchas de imagem de células vivas, por exemplo, mitocôndrias, cálcio ou indicadores ROS, e coloração imunofluorescente pós-fixação para proteínas de interesse pode ser realizada. Em comparação com os ensaios de fagocitose existentes que utilizam células neuronais apoptóticas, as principais vantagens que este protocolo confere é que a preparação da carga fagocítica é relativamente simples e rápida, e resulta em um produto uniforme. Outros ensaios induzem apoptose de neurônios ou SH-SY5Ys com S-nitroso-L-cisteína por 2 h25, ácido okadaico para 3 h22, staurospor para 4-16 h26,27,28,29 ou UV-irradiação para 24 h30, e pode resultar em células em diferentes estágios da apoptose. Além disso, as imagens de células vivas e leituras de imagens de alto conteúdo não foram descritas anteriormente, tanto quanto os autores sabem. A principal limitação do uso da fixação do paraformaldeído para preparar a carga fagocítica é que ela não recapitule totalmente o processo de apoptose, uma vez que a fixação impede que as células separem em corpos apoptóticos, que provavelmente serão fagocitados mais rapidamente devido ao seu tamanho menor. Não se sabe qual efeito a fixação tem sobre a secreção de sinais nucleotídeos de "me encontre" (por exemplo, ATP, UDP) da célula alvo que atraem fagocitos. Semelhante às células apoptóticas, os SH-SY5Ys fixos exibem alguma permeabilidade de membrana ao iodeto propidium. A permeabilidade da membrana está associada à liberação de sinais de "encontre-me"; no entanto, isso não foi estudado nos SH-SY5Ys fixos, e se o nucleotídeo for liberado muito rapidamente, eles serão lavados antes que os SH-SY5Ys sejam adicionados aos macrófagos iPSC.
O primeiro passo crítico no protocolo é a coloração de SH-SY5Ys mortos com um éster STP de um corante fluorescente vermelho sensível ao pH. Este corante reage rapidamente e covalentemente com aminas primárias livres na superfície dos SH-SY5Ys mortos. A duração da coloração não precisa ser otimizada; no entanto, deve-se tomar cuidado com o manuseio do corante antes da rotulagem. A reação de rotulagem não deve ser realizada em buffers contendo aminas livres. Além disso, há risco de precipitação se o estoque de DMSO for diluído em tampão aquoso frio ou em alta concentração final. Precipitados aparecerão como objetos escuros densos sob o microscópio. Além disso, a solução de corante sensível ao pH gruda em tubos regulares de centrífugas plásticas e lava lentamente; portanto, são recomendados tubos de baixa ligação para a etapa de rotulagem. O uso de um corante sensível ao pH, em vez de um corante permanentemente fluorescente, auxilia na identificação de partículas engolfadas, contra partículas que vizinhos à membrana plasmática. Uma vez que há alguma fluorescência no pH neutro, a densidade da carga fagocítica e dos macrófagos iPSC precisam ser mantidos baixos o suficiente para uma segmentação precisa, embora alto o suficiente para que numerosos eventos fagocíticos sejam capturados. A microscopia de alto teor foi capaz de identificar com precisão a fagocitose com uma densidade média de carga no poço (mais de 2 SH-SY5Ys por iPSC-macrófago). Por outro lado, devido à sensibilidade mais fraca do microscópio no espectro vermelho profundo, a segmentação de macrófagos iPSC nos dados de imagem de lapso de tempo de células vivas foi menos confiante e foi necessário usar uma densidade muito baixa de carga para reduzir a probabilidade de falsos positivos (1 SH-SY5Y para cada dois macrófagos iPSC). A validação da segmentação adequada e da densidade da carga deve ser realizada com comparações entre poços não tratados e citochalasin D tratados. Em um ensaio bem otimizado, a citochalasina D deve reduzir o número médio de manchas por célula em 90% em relação a amostras não tratadas.
Outro passo crítico no protocolo é a coloração iPSC-macrófago, que permite que a célula seja identificada e segmentada na análise de imagens para que quaisquer SH-SY5Ys externos sejam excluídos da contagem. O corante recomendado é permeante celular, convertido em um produto fluorescente insolúvel dentro do citoplasma, fixável e não tóxico (ver Tabela de Materiais). A etapa de coloração foi otimizada para o uso de macrófagos iPSC com o ensaio de fagocitose de imagem de alto teor, e sugerimos que ele deve ser retim otimizado se outros tipos de células forem usados. A duração da coloração celular pode ser aumentada para melhorar a deposição do produto fluorescente insolúvel dentro das células. Se a concentração de corante for otimizada, deve-se tomar cuidado para evitar níveis tóxicos do veículo solvente orgânico.
O terceiro fator crítico para o sucesso do ensaio é a análise dos dados. Os gasodutos de análise fornecidos destinam-se a ser de orientação e não prescritivo, pois diferenças na intensidade de coloração ou morfologia celular podem reduzir a eficácia da segmentação dos gasodutos conforme escrito. Algumas otimizações serão, portanto, necessárias, com testes do pipeline sobre controles positivos e negativos adequados, e os parâmetros que devem ser otimizados estão indicados no texto do protocolo. Os controles negativos devem incluir uma condição em que os macrófagos iPSC são pré-tratados com um potente inibidor de fagocitose, como a citochalasina D antes da adição de SH-SY5Ys. Outro possível controle negativo é a adição dos SH-SY5Ys a poços não tratados anteriormente de macrófagos iPSC no final do ensaio, 10 minutos antes da fixação, o que permite algum ajuste da carga, mas é muito curto para que ocorra uma quantidade considerável de fagocitose. Um evento de fagocitose é definido como um objeto vermelho-fluorescente dentro das bordas de um iPSC-macrophage, definido pelo algoritmo de software usando o canal de fluorescência vermelho profundo. Se a segmentação das células for ruim(Figura 2),muitas SH-SY5Ys não fagocytosed em proximidade com iPSC-macrófagos podem ser erroneamente incluídas na análise, ou seja, falsos positivos. O fator mais importante para alcançar uma boa segmentação é o delineamento rigoroso dos macrófagos iPSC. A segmentação para ambas as análises é automatizada, portanto não é possível obter uma segmentação perfeita para cada célula; no entanto, alguns parâmetros podem ser ajustados para tornar a segmentação mais ideal, usando algumas imagens de teste como referência. O controle de citochalasina D é importante para avaliar a segmentação ideal, pois um alto número de eventos fagocíticos detectados nesta condição indica que a segmentação é sub-ideal. A otimização do pipeline de análise de dados deve ser idealmente repetida até que o número de eventos fagocíticos por célula seja 80%-90% menor na condição de citochalasina D versus nenhum inibidor.
Os problemas com o ensaio de fagocitose que são mais propensos a ocorrer são: (1) fluorescência fraca sensível ao pH em controles positivos, (2) distribuição esparsa ou desigual de macrófagos no final do ensaio, ou (3) alto número de falso-positivos na análise de SH-SY5Ys não fagoctos. A solução de problemas da fluorescência fraca sensível ao pH deve primeiro verificar que a coloração dos SH-SY5Ys resultou em uma pelota celular com uma cor magenta forte. Se a cor for fraca, certifique-se de que um estoque de corante fresco seja usado, certifique-se de que o buffer de rotulagem esteja livre de amina, adicione uma lavagem extra aos SH-SY5Ys antes de colorir, verifique se o número correto de SH-SY5Ys foi manchado, certifique-se de que não há precipitações de corante e otimize a concentração de rotulagem do corante. Se os SH-SY5Ys estiverem fortemente manchados, verifique se a concentração adicionada à placa de ensaio está correta e certifique-se de que os macrófagos iPSC são saudáveis e não muito velhos. O segundo tipo de problema, a distribuição desigual do macrófago, pode resultar da perda de células durante a tubulação e devem ser tomadas medidas para reduzir as forças de tubulação experimentadas pelas células, evitando pontas estreitas. Se o problema permanecer, reduza o tempo de incubação do carregamento dos macrófagos iPSC com corante permeante celular. O terceiro problema, em relação à inclusão errônea de partículas não fagocitas na análise, indica que é necessária mais otimização do pipeline de análise. A solução de problemas deve se concentrar em primeiro lugar na segmentação celular e se o software está incluindo objetos adjacentes. Parâmetros específicos que podem ser ajustados são sugeridos nas notas abaixo das etapas relevantes (etapas 6.1.11-6.1.15 para a análise de lapso de tempo de célula viva e etapas 6.2.4-6.2.8 para a análise de alto teor de conteúdo). Se a segmentação celular não puder ser melhorada, a análise de alto teor tem um passo extra (etapa 6.2.8) que exclui macrófagos iPSC segmentados incorretamente. Além disso, o módulo que filtra pontos aceitos de fluorescência sensível ao pH dentro de macrófagos iPSC pode ser otimizado, aumentando a intensidade limiar dos objetos aceitos, o que deve ajudar a excluir sh-SY5Ys não fagocitados (etapa 6.1.17 para a análise de lapso de tempo de células vivas e passo 6.2.11 para a análise de alto teor).
Desenvolvemos dois tipos de leitura de microscopia para o ensaio de fagocitose que cada um tem vantagens e limitações. A imagem de lapso de tempo de células vivas tem o mérito de fornecer informações extras sobre cinética de fagocitose e está mais amplamente disponível do que plataformas de imagem de alto conteúdo. O software de código aberto recomendado é agnóstico para a fonte do microscópio e pode ser usado com qualquer microscópio fluorescente de boa qualidade, com ou sem capacidade de lapso de tempo de célula viva. A principal limitação da imagem de células vivas é a sensibilidade e a óptica limitadas, o que torna mais desafiador detectar e executar uma boa segmentação de macrófagos iPSC. Essa limitação pode ser atenuada, aumentando a duração da coloração iPSC-macrófago, ou mudando para um microscópio mais sensível, se disponível. O ensaio de phagocytosis de imagem de alto conteúdo é a leitura recomendada se um sistema de imagem de alto conteúdo estiver disponível. Sistemas de imagem de alto teor de conteúdo permitem maior rendimento e dados mais confiáveis, permitindo que este ensaio seja usado para triagem, no qual seria esperado um Z' robusto de ≥0,7 para a saída "número de pontos por célula"20. Em comparação com o método de lapso de tempo de células vivas, a leitura de microscopia de alto conteúdo tem maior sensibilidade, maior grau de automação e velocidade, mais poços e campos de imagem podem ser processados e imagens confocal de alta resolução são produzidas. A segmentação celular é mais eficaz com boas imagens, e a segmentação é adicionalmente auxiliada pelo software de análise de imagens de alto conteúdo, fornecendo mais métodos de segmentação celular adequados para células altamente irregulares. O software de análise de imagens de alto teor de conteúdo também calculou mais parâmetros de fagocitose, em comparação com o software de código aberto, como a porcentagem de células fagocíticas. A principal limitação do ensaio de fagocitose de alto teor é de custo e acessibilidade do sistema de imagem e software de análise.
Em conclusão, o ensaio quantitativo de fagocitose apresentado neste artigo é uma ferramenta útil para modelar a fagocitose de microglia de neurônios mortos in vitro. As microglias são modeladas por macrófagos iPSC e os neurônios mortos são modelados por SH-SY5Ys fixos em paraformaldeído. Embora não sejam os modelos de neurônios mais autênticos e mortos/apoptóticos publicados, estes são fáceis de preparar e escaláveis. O ensaio em si é altamente versátil, com dois tipos de leitura de imagem detalhados, e tem potencial para ser adaptado para uso com diferentes modelos de monocultura microglia/macrófago, ou um tipo de célula diferente para atuar como carga fagocítica. A leitura de imagens de alto teor é vantajosa para a obtenção de dados quantitativos e pode ser dimensionada para avaliar pequenos moduladores de moléculas de fagocitose, ou tela variantes genéticas nos macrófagos iPSC. No entanto, uma vez que os sistemas de imagem de alto conteúdo são caros e pesados em dados, uma leitura alternativa de imagem foi incluída no protocolo usando um microscópio de lapso de tempo de células vivas, que poderia ser substituído por qualquer microscópio convencional de fluorescência de boa qualidade, se necessário.

Microglia são macrófagos residentes em tecido cerebral, e suas funções incluem vigilância imunológica, coordenação de respostas inflamatórias a lesões/infecções, remodelação sináptica e fagocitose de células mortas, mielina, agregados de proteínas e patógenos. A fagocitose é o processo pelo qual a microglia reconhece a carga com receptores superficiais e reorganiza seu citoesqueleto para engolir o objeto em um fagosome, que então se funde com lisosomos para degradação da carga. Microglia saudável fagocytose células cerebrais apoptóticas para removê-las antes de se tornarem necrosas1. A fagocitose das células apoptóticas também é conhecida como eferocisose, e requer a exibição de um sinal de fosfatidídeserina "comer-me" pela célulamoribunda 2. Numerosos receptores de microglia se ligam diretamente à fosfatidíserina, incluindo TIM-4, BAI1, Stabilin-2 e TREM2. Receptores TAM microglial (por exemplo, MERTK) e integrinos indiretamente se ligam à fosfatidíserina, utilizando proteínas acessórias GAS6 ou MFG-E8, respectivamente. Outros sinais de "comer-me" podem ser necessários para o reconhecimento de células moribundas, estes incluem alterações na glicoseção ou carga de proteínas superficiais; expressão de proteínas intracelulares ICAM3, calreticulina, anexo-I na superfície celular; LDL oxidado; ou revestimento da célula apoptótica por complemento produzido por microglia C1q1,2.
Doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson, doença de Alzheimer, demência frontotemporal e esclerose lateral amiotrófica têm sido associadas ao comprometimento da função microglia, incluindo o acúmulo de resíduos cerebrais, como células mortas, fragmentos de mielina e agregados proteicos, e respostas inflamatórias exageradas a esses estímulos3. A fagocitose pode ser prejudicada em doenças neurodegenerativas e contribuir para a patologia, devido a uma combinação de envelhecimento, inflamação ou variantes específicas de risco genético4,5. Por outro lado, há também evidências de modelos animais de doenças neurodegenerativas de que a microglia pode inapropriadamente fagocytose neurônios viáveis ou sinapses6,7,8. É provável que o mecanismo seja instigado pela exibição fosfatidylserina de neurites danificados, que é diretamente sentido pelos receptores de fagocitose microglial TREM2 ou GPR56, ou indiretamente sentido pelo complemento solúvel C1q revestimento da membrana enriquecida com fosfartidylserina, levando à fagocitose mediada por CR39,10,11.
Ensaios in vitro da função fagocitose, por exemplo, para avaliar o impacto fenotípico de uma variante de risco genético na microglia, são frequentemente realizados utilizando cargas não fisiológicas, como contas de látex4. Bactérias fluorescentes e zimosãs também são utilizadas, que são fisiológicas, mas não relevantes para doenças neurodegenerativas. Cargas fagocíticas não fisiológicas podem ser usadas para detectar defeitos no maquinário básico do engolamento fagocítico, mas não modelam com precisão o primeiro passo de "reconhecimento" na fagocitose dos neurônios apoptóticos. O tamanho, a forma, a rigidez e o tipo de carga também ditam as vias de sinalização intracelular que são ativadas, levando a diferentes resultados do estado de ativação da microglia. Por exemplo, as bactérias E.coli são pequenas e rígidas, ao contrário das células humanas, e os lipopólises em sua superfície são reconhecidos pelo receptor Toll-like 4 (TLR4) que ativa a fagocitose e as vias de sinalização pró-inflamatórias2,12.
No contexto de estudos de doenças neurodegenerativas, uma carga fagocítica mais relevante teria exibição de fosfatidylserina em membranas plasmáticas de mamíferos, e seria idealmente humana e neuronal, para incluir sinais que a microglia provavelmente encontrará. Para este protocolo de fagocitose, a linha celular neuroblastoma humana SH-SY5Y foi escolhida como um modelo de neurônio fácil de cultivar. A exposição permanente de fosfatidylserina foi artificialmente induzida por paraformaldeído, que já foi mostrado para causar exibição de fosfatidíserina de plaquetas13. Para o modelo microglia foram utilizados macrófagos humanos iPSC-macrófagos, que imitam o perfil ontogenia e transcricional da microglia humana, e são phagocyticamente competentes14,15,16,17. os macrófagos iPSC não são o modelo de microglia mais autêntico disponível, por exemplo, eles não imitam a morfologia da microglia; no entanto, pode-se substituí-lo por um modelo iPSC de monocultura mais autêntico, se desejar, como Haenseler et al.15. Os modelos humanos de iPSC são preferíveis à microglia de roedores primários para estudar a neurodegeneração, devido a preocupações com a sobreposição limitada dos módulos transcricionais de microglia observados nos tecidos da doença neurodegenerativa humana versuscamundongos 18. Os SH-SY5Ys mortos são manchados com um corante sensível ao ácido que fluoresce fracamente no pH neutro e mais fortemente dentro dos fagolicosomos de iPSC-macrófagos após fagocitose. O uso de um corante sensível ao ácido melhora a precisão da detecção de eventos fagocíticos, com versatilidade para diferentes leituras de macrófagos vivos e fixos19. Este protocolo descreve tanto a imagem de lapso de tempo de célula viva da fagocitose, quanto um ensaio de imagem fixo de alto teor de conteúdo para fagocitose, com as mesmas etapas de preparação celular antes da leitura(Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático da metodologia. O esboço do ensaio de fagocitose, onde a preparação dos SH-SY5Ys e a coloração dos macrófagos iPSC são realizados em paralelo, e então os SH-SY5Ys são pipetados sobre os macrófagos iPSC. Ou a imagem de lapso de tempo de células vivas é realizada imediatamente, ou as células são incubadas a 37 °C/5% de CO2 para a duração necessária e fixadas antes de realizar microscopia de alto conteúdo. PFA: paraformaldeído, HBM: mídia sem fenol sem fenol, pHr: solução de corante fluorescente vermelho sensível ao pH STP Ester, PRFMM: mídia macrófago sem fenol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>Para centrifugação de células</td></tr><tr><td>2-20 &micro; L, 20-200 e micro; L, 100-1000 &micro; L micropipetas</td><td></td><td></td><td></td>de canal único</tr><tr><td>2-mercaptoetanol 50</td><td>mM Gibco</td><td>31350010</td><td>Componente do meio de fábrica</td></tr><tr><td>4% paraformaldeído em PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>Para fixação de células</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços, tratada com cultura de tecidos</td> AggreWell-800 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>Placa de 24 poços de baixa aderência de micropoços para formação de corpos embrióides</td></tr><tr><td>Kit de coloração / detecção de apoptose de anexina V-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab14085</td><td>Kit para coloração de anexina V-FITC, como um ensaio para controle de qualidade de SH-SY5Ys fixos. O kit contém tampão de ligação de anexina, anexina V-FITC e iodeto de propídio.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> bancada <tr><td>CellCarrier-96 Ultra Microplacas</td><td></td><td></td><td></td>, tratadas para cultura de tecidos, pretas, 96 poços com tampa Microplaca tratada com cultura de tecidos (TC) Perkin Elmer 6055302 96 poços com paredes de poço preto e fundo opticamente transparente, para ensaio</tr><tr><td></td> de fagocitose <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> de <td>código aberto para análise de imagens de fagocitose obtidas por microscópio de lapso de tempo de células vivas. Baixe gratuitamente no site (http://cellprofiler.org/), este protocolo utilizou a versão 2.2.0.</td></tr><tr><td>Corante CellTracker Deep Red Thermo</td><td>Fisher</td><td>C34565</td><td>Corante fluorescente profundo, permeável a células, reativo a éster succinimidílico para coloração de citoplasma de macrófagos iPS. Dissolva o corante CellTracker Deep Red em DMSO a 2 mM (1,4 mg/mL). Use em 1 &mu; M, por diluição do estoque de DMSO com meios de macrófagos.</td></tr><tr>Gabinete <td></td><td></td><td></td><td>de segurança de fluxo de ar laminar classe 2</td></tr><tr><td>CO2 garrafa</td><td></td><td></td> de gás Acessório para incubadora <td>EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>CO2, ajustada para 37&deg; C e 5 % CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columbus Sistema de armazenamento e análise de dados de imagem</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Plataforma de armazenamento e análise de dados para o Opera Phenix. Suporta todos os principais instrumentos de triagem de alto conteúdo.</td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Cayman</td><td>11330</td><td>Tratamento de controle negativo para ensaio de fagocitose. Reconstituir em DMSO a 10 mM e armazenar alíquotas a -20 graus; C, evite mais ciclos de congelamento e descongelamento. Use na concentração final 10 &micro;M.</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>Componente da mídia SH-SY5Y</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Solvente para CellTracker e corantes pHrodo</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Imaging System</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMF4300</td><td>Microscópio de imagem com lapso de tempo de célula viva</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube CY5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4656</td><td>Acessório para EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube DAPI</td><td>Thermo Acessório Fisher</td><td>AMEP4650</td><td>para EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube RFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4652</td><td>Acessório para EVOS FL</td></tr><tr><td>Auto EVOS Incubadora Onstage</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMC1000</td><td>Acessório para EVOS FL</td></tr><tr><td>Auto Fetal Soro</td><td>Bovino Sigma</td><td>F4135</td><td>Componente do meio SH-SY5Y Citômetro de</td></tr><tr><td>fluxo Citometria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de fluxo software</td><td></td><td></td><td></td>de análise</tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, qualificado para hESC, fator de crescimento reduzido Matriz de membrana basal</td><td>Invitrogen</td><td>A1413302</td><td>matriz de membrana basal qualificada para hESC para cultura iPSC</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Componente de mídia de fábrica e macrófagos</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>BE 10-547F</td><td>Hank' s solução salina balanceada para etapas de lavagem</td></tr><tr><td>BMP4 recombinante humano</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td>Componente do meio corporal embrióide</td></tr><tr><td>IL-3 recombinante humano Gibco</td><td></td><td>PHC0033</td><td>Componente do meio de fábrica e macrófagos</td></tr><tr><td>SCF recombinante humano</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>Componente do meio corporal embrióide</td></tr><tr><td>VEGF recombinante humano</td><td>Gibco</td><td>PHC9394</td><td>Componente do meio do corpo embrióide</td></tr><tr><td>Solução de imagem de células vivas</td><td>Thermo Fisher</td><td>A14291DJ</td><td>Meios tamponados com HEPES sem vermelho de fenol para rotulagem de mortos SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>Baixa ligação a proteínas Tubos de 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108.132</td><td>Para coloração SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC9501</td><td>Componente de meios de fábrica e macrófagos</td></tr><tr><td>mTeSR1 Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Pipeta</td></tr><tr><td></td><td></td><td>multicanal 20-200 uL</td><td>para manuseio de líquidos de placas de 96 poços</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagente</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37605</td><td>Hoechst 33342 formulação em um frasco conta-gotas para coloração de núcleos de macrófagos iPS, use 0,5 gotas/mL em meios de macrófagos.</td></tr><tr><td>Sistema de triagem de alto conteúdo Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14000000</td><td>microscópio de imagem de alto conteúdo, usado com o software Harmony versão 4.9.</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Componente de Fábrica, Macrófago e SH-SY5Y mídia</td></tr><tr><td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36011</td><td>corante fluorescente vermelho sensível ao pH para rotulagem de SH-SY5Ys mortos. Reconstitua o pó de éster pHrodo iFL Red STP em DMSO a uma concentração de 5 mg/mL. Para cada 1 milhão de SH-SY5Ys, adicione 2,5 &mu; L (12,5 &mu; g) de estoque de éster pHrodo iFL Red STP para células pré-aquecidas suspensas em solução de imagem de células vivas.</td></tr><tr>Enchimento <td></td><td></td><td></td>de <td>pipetas serológicas</td></tr><tr><td>Balão T175, tratado</td><td></td><td></td><td>com cultura de tecidos Recipiente para diferenciações de precursores de macrófagos iPSC, conhecido como "Fábricas"</td></tr><tr><td>Frasco</td><td></td><td></td> T75 <td>Recipiente para cultura SH-SY5Y</td></tr><tr><td>Seladores de placas transparentes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676001</td><td>Para armazenamento e transporte de placas de ensaio</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1X), sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>tampão de dissociação celular contendo enzimas recombinantes semelhantes à tripsina e 1,1 mM EDTA, use puro.</td></tr><tr><td>Banho-maria, ajustado para 37&graus; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Meio com L-glutamina, gentamicina e vermelho de fenol</td><td>Lonza</td><td>BE04-418F</td><td>Componente de meio de fábrica e macrófagos</td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Meio com L-glutamina; sem gentamicina ou vermelho de fenol</td><td>Lonza</td><td>04-744Q</td><td>Meio de macrófagos sem vermelho de fenol, para uso em fagocitose sem aditivos ou fatores de crescimento</td></tr></tbody></table>

ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por ipsc-macrófagos

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orquestra respostas neuroimunes em várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Microglia limpa neurônios mortos e moribundos através do processo de eferócitose, uma forma especializada de fagocitose. A função fagocitose pode ser interrompida por fatores de risco ambientais ou genéticos que afetam a microglia. Este artigo apresenta um protocolo de microscopia in vitro rápido e simples para o estudo da equecriose microglial em um modelo de microglia (célula-tronco pluripotente) induzida, utilizando uma linha celular neuroblastoma humana (SH-SY5Y) rotulada com um corante sensível ao pH para a carga fagocítica. O procedimento resulta em um alto rendimento de células neuroblastoma mortas, que exibem fosfartidylserina superficial, reconhecida como um sinal de "comer-me" por fagocitos. O ensaio de placa de 96 poços é adequado para imagens de lapso de tempo de células vivas, ou a placa pode ser corrigida com sucesso antes de processamento adicional e quantificada por microscopia de alto conteúdo. A microscopia de alto teor de células fixas permite que o ensaio seja dimensionado para triagem de inibidores de pequenas moléculas ou avaliando a função fagocítica das linhas iPSC da variante genética. Embora este ensaio tenha sido desenvolvido para estudar fagocitose de células de neuroblastoma mortas por macrófagos iPSC, o ensaio pode ser facilmente adaptado para outras cargas relevantes para doenças neurodegenerativas, como sinapstos e mielina, e outros tipos de células fagocíticas.

A imagem de lapso de tempo de células vivas foi realizada utilizando-se o protocolo previamente delineado, com macrófagos iPSC-macrófagos do tipo selvagem semeados em 20.000 células por poço. Foram aplicadas diferentes quantidades de SH-SY5Ys (10.000-30.000 por bem como estimadas da contagem celular na etapa 3.1), e o inibidor de fagocitose cytochalasin D foi pré-incubado (1 h) com alguns poços, agindo como um controle para inibir a fagocitose para cada quantidade de SH-SY5Ys. A imagem começou 40 minutos após a adição de SH-SY5Ys e as imagens foram capturadas em intervalos de 5 minutos para as próximas 3 horas (os dados incluem o atraso inicial de 40 min). Um vídeo de lapso de tempo representativo é incluído nos Dados Suplementarese analisados dados quantitativos mostrados na Figura 3. Com a quantidade de 10.000 SH-SY5Ys por poço, o número de partículas fagocitas (manchas) por célula aumentou linearmente com o tempo, e foi inibido em aproximadamente 50% por citochalasina D. A inibição por citochalasina D foi mais fraca do que o previsto, provavelmente causada por insuficientes réplicas técnicas ou biológicas, pois apenas um poço por condição foi imageado com três campos de imagem. Com maiores quantidades de SH-SY5Ys por poço (20.000 e 30.000), a fagocitose apresentou baixa linearidade, provavelmente devido à má segmentação de macrófagos iPSC e SH-SY5Ys em um campo de visão mais lotado.
A imagem de alto teor de células fixas foi realizada utilizando-se o protocolo previamente delineado, com macrófagos iPSC-macrófagos do tipo selvagem a 20.000 células por poço, várias quantidades diferentes de SH-SY5Ys (10.000-80.000 por bem), e a placa de ensaio foi fixa e imageda após 5h. Uma imagem representativa da fagocitose é apresentada na Figura 4A, e os dados analisados mostrados na Figura 4B17. O aumento da quantidade de SH-SY5Ys resultou em um maior número de partículas fagocitas (manchas) por célula; no entanto, uma duplicação da quantidade SH-SY5Y leva apenas a um aumento de 1,5x no número de pontos por célula. Isso indica que os valores testados não são limitadores de taxa à fagocitose. Posteriormente, o ensaio de phagocytose por imagem de alto teor foi validado utilizando vários inibidores da fagocitose(Figura 4C)17. Os inibidores de polimerização de actina citochalasin D e jasplakinolide inibiram significativamente a fagocitose em 91% e 90%, respectivamente, quando pré-incubado por 1h antes da fagocitose. O robusto Z' do ensaio quando a citochalasina D ou jasplakinolide são utilizadas como controles negativos é calculada como 0,7 e 0,8, respectivamente20. O inibidor de acidificação lysososome bafilomicina A1 reduziu significativamente a fagocitose em 31%, quando incubado 1h antes da fagocitose. O efeito mais fraco do inibidor de acidificação lisososome versus inibidores de actina sugere que a detecção da carga internalizada pode não exigir acidificação total do fagosome. A anexação recombinante V foi usada como controle para bloquear especificamente a fosfatidíserina exposta na superfície dos SH-SY5Ys, impedindo que receptores fagocíticos acessem o ligante, um importante sinal de "come-me". A adição de anexação recombinante V reduziu significativamente a fagocitose em 30%, quando adicionada a poços imediatamente antes da adição sh-SY5Y. Sh-SY5Ys fixos foram confirmados para expor fosfatidylserine, usando uma sonda fluorescente anexa V, enquanto sh-SY5Ys vivos foram negativos para coloração anexa em V(Figura 4D).
O receptor de fagocitose microglial TREM2 tem sido anteriormente mostrado importante para a fagocitose dos neurônios apoptóticos21. A mutação R47H do TREM2 é um gene de risco para o início tardio da doença de Alzheimer, e é hipótese para reduzir a ligação de ligante de TREM223. Com o objetivo de avaliar a função fagocítica de R47H TREM2 e TREM2 KO, o ensaio de fagocitose de alto teor de célula fixa foi realizado utilizando linhas isogênicas iPSC-macrófagos com WT/R47H/KO TREM217. Vários comprimentos de duração da fagocitose de 1 a 5 h foram testados, utilizando-se uma adição escalonada de carga fagocítica (40.000 SH-SY5Ys). O sinal resultante aumenta linearmente para 4h, nivelando ligeiramente a 5 h(Figura 5)17. A redução da taxa de fagocitose e da capacidade (% das células positivas spot) ficou evidente no KO TREM2 em comparação com a TMC, enquanto o mutante R47H TREM2 não apresentou fagocitose alterada. O defeito fagocítico nas células KO TREM2 não é fenocópido pela mutação R47H TREM2, aparentemente porque a função TREM2 é suficiente para suportar fagocitose normal.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figura 3: Exemplos de dados para ensaiode fagocitose de lapso de tempo de células vivas. Absorção de SH-SY5Ys mortos por macrófagos iPSC-macrófagos do tipo selvagem BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) imagens em intervalos de 5 minutos por 3 h. Os tempos exibidos no gráfico são do início da fagocitose, incluindo os primeiros 40 minutos sem medição. O número médio de pontos por célula de três poços de réplica são plotados. A fagocitose de 10.000 SH-SY5Ys é inibida com 10 μM de citochalasina D com pré-tratamento de 1 h, enquanto maiores quantidades de SH-SY5Ys (20.000 e 30.000) têm quantificação subotimal de fagocitose. Desvio padrão ± médio (SD), N = 1 experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figura 4: Otimização e validação de ensaio de fagocitose de alto teor de células fixas. (A) Imagem representativa de microscopia de alto teor de alto conteúdo da SH-SY5Ys phagocytos por iPSC-macrófagos do tipo selvagem BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Um ponto de tempo de 3h com 40.000 SH-SY5Ys é mostrado. Os canais de fluorescência são mesclados, com a mancha iPSC-macrófago mostrada como vermelho, núcleos como azul e SH-SY5Ys como amarelo. O painel de entrada é uma seção da imagem ampliada 3x. (B) O número de pontos por célula de SH-SY5Ys mortos phagocytos após 5h, usando diferentes quantidades de adição de carga para macrófagos do tipo selvagem iPSC. Erro padrão ± médio (SEM), para N = 3 colheitas. (C) A fagocitose (3 h) é inibida com 10 μM cytochalasin D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (com 1 h pré-tratamento; Jas), e 13 μg/mL anexo recombinante V (adicionado simultaneamente aos SH-SY5Ys mortos; Ann). os macrófagos iPSC sem sh-SY5Ys adicionados foram usados como um controle negativo (-ve), e o controle positivo (+ve) é iPSC-macrófagos não tratados com SH-SY5Ys adicionados. Os dados foram normalizados para a média para a repetição do experimento. Significa ± SEM, para N = 3-6 colheitas e com duas linhas celulares de tipo selvagem (SFC840-03-03, a caracterização desta linha é descrita em (Fernandes et al.21 e BIONi010-C). ANOVA de 1 via com o teste pós-hoc de Dunnett, comparações com células não tratadas. *p &lt; 0,05, ***p &lt; 0,001. (D) Mancha sh-SY5Ys recém-fixada uniformemente para exibição de fosfatidylserina (anexo V-FITC) e tem permeabilidade celular limitada (iodeto de propídio). Sh-SY5Ys vivos não mancham para anexar V-FITC ou iodeto de propídio, exceto para coloração focal presente nas poucas células mortas na cultura. Os números são reproduzidos com permissão da Alzheimer's Research &amp; Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figura 5: A fagocitose é reduzida em KO TREM2, mas não em R47H TREM2 iPSC-macrófagos. Ensaio de fagocitose de alto teor realizado com 40.000 SH-SY5Ys por poço com adições escalonadas. Os meios foram quantificados para os parâmetros: número de manchas por célula, soma de áreas spot (μm2) por célula e percentual de células contendo partículas fagocitas por campo. Os dados foram normalizados para significar para cada genótipo por experimento. Média ± SEM, para N = 3 colheitas. ANOVA de duas formas repetidas, teste pós-hoc de Dunnett, comparações em pares com o WT para cada vez: *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001. Os números são reproduzidos com permissão da Alzheimer's Research &amp; Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar S1: Exemplo QC para preparação sh-SY5Ys. Os SH-SY5Ys dissociados foram fixados por 10 minutos com 0% (células vivas), 1% e 2% de paraformaldeído (PFA), depois lavados. As células foram manchadas com anexo V-FITC e iodeto de propidium (PI) e imediatamente medidas por citometria de fluxo. As parcelas de pontos de densidade de cores foram criadas no software de análise de citometria de fluxo, usando os controles de uma única mancha e sem manutenção para colocar um portão do quadrante. Os quadrantes são anotados com a porcentagem de eventos dentro desse quadrante. As células vivas estão principalmente no 4º trimestre, e as células fixas estão principalmente no 2º trimestre. Q1 = anexo V-/PI-, Q2 = anexo V+/PI+, Q3 = anexo V+/PI-, Q4 = anexo V-/PI- (células vivas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Vídeo suplementar: Fagocitose de lapso de tempo de célula viva. Vídeo de lapso de tempo representativo de SH-SY5Ys phagocytos por iPSC-macrófagos do tipo selvagem BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). As imagens foram tiradas a cada 5 minutos por 3 h. O vídeo é cortado e roda a 3 quadros por segundo, mostrando as últimas 1,5 h do ensaio. Os SH-SY5Ys manchados de corante sensíveis ao ácido são mostrados em vermelho, intensidade de sinal aumentando com acidificação fagosome. Núcleos celulares manchados com Hoechst 33342 são mostrados em azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Este ensaio de imagem in vitro permite quantificar o efeito de diferentes tratamentos celulares ou genótipos diferentes sobre a fagocitose microglial. Usando dois tipos de células relevantes para doenças neurodegenerativas, usamos células de neuroblastoma mortas para a carga fagocítica, que são preparadas de uma forma que pode ser facilmente e baratamente dimensionada por grandes telas de imagem de alto conteúdo. Em um gabinete de segurança biológica classe 2, dissociar SH-SY5Ys aspirando o meio.Adicione 4 ml de tampão de dissociação celular e remova o buffer imediatamente para que menos de 1 ml permaneça como uma película fina que reveste as células. Incubar por 2 a 3 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, a 10 ml de HBSS para o frasco T-75.E pipeta o SH-SY5Ys em um tubo de centrífuga cônica de 15 ml. Centrifugar a 400xG por 5 minutos. Aspire o supernascimento e suspenda as células em 2 ml de mídia tamponada hepes sem fenol, certificando-se de quebrar aglomerados antes da fixação.Fixar as células adicionando 2 ml de formaldeído de 4% de potência ao tubo e incubando por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave ocasional. Adicione 10 ml de HBSS ao tubo. Em seguida, centrífuga a 1200xG por 7 minutos.Aspire o supernasciente, e suspenda a pelota celular em 2 ml de mídia tamponada hepes sem fenol. Conte e remova 1 milhão de células HS-SY5Y em um tubo de baixa ligação de proteínas de 2 ml. Leve o volume total para 300 a 500 microliters com mídia tamponada HEPES sem fenol.Em seguida, aqueça brevemente o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius. Reconstitua o éster stp de corante vermelho sensível ao pH de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione 12,5 microgramas de corante por milhão de células SH-SY5Y.Misture suavemente apertando o tubo. E incubar o tubo em temperatura ambiente por 30 minutos, protegido da luz. Adicione 1 ml de HBSS e centrífuga a 1200xG por 7 minutos e 4 graus Celsius.Descarte o supernatante. E lave com 2 ml de HBSS. Suspenda a pelota celular na mídia de macrófago livre de fenol para uma concentração de 0,2 a 1,2 milhões de células por ml, de modo que 50 microlitres contêm de 10.000 a 60.000 células.Em um gabinete de segurança biológica, prepare uma solução de células fluorescentes vermelhas profundas com corante éster-reativo em meios de macrofago. Adicione Hoechst 33342, e aqueça a solução de trabalho a 37 graus Celsius em um banho de água. Aspire o meio macrófago iPSC suavemente, tubondo a célula supernante com uma pipeta multicanal em um reservatório estéril.Adicione 70 microliters por poço da solução de corante aos macrófagos iPSC usando uma pipeta multicanal. Incubar por 1 hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Reparar tratamentos experimentais em mídia de macrófago sem fenol.Após a incubação, aspire o meio macrófago iPSC muito suavemente com uma pipeta multicanal, e adicione 100 microliters de HBSS por poço. Remova imediatamente o HBSS por tubulação suave. Em seguida, adicione 100 microliters de mídia de macrófago sem fenol, além de tratamentos experimentais em poços separados.Incubar por 10 minutos a 1 hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters dos SH-SY5Ys rotulados por poço dos lados de cada poço na borda do líquido. Em seguida, incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 3 a 5 horas.Após a incubação da fagocitose, aspira suavemente os supernantes celulares por pipetar com uma pipeta multicanal e descartar. Lave uma vez com 100 microliters de PBS. Em seguida, fixar as células adicionando 100 microliters de 2% de energia formaldeído e incubando por 15 minutos à temperatura ambiente.Aspirar poços e adicionar 100 microliters de PBS. Ou proceda diretamente à imagem com o microscópio de alto teor, ou cubra com selador de placa e papel alumínio, e armazene a placa a 4 graus Celsius, até que seja necessário. Ligue o microscópio de imagem de alto conteúdo e abra o software de captura de imagens.Carregue a placa de ensaio no microscópio clicando no ícone LOAD na parte superior da tela. Selecione a guia CONFIGURAÇÃO". Nos menus suspensos na caixa superior esquerda, selecione o tipo de placa apropriada.A opção de foco automático:dois pico "O objetivo:40x Água, na forma DE 1.1"Confocal" e Binning de 1. Lave o objetivo de 40x Água antes de usar através do menu de configurações. Na caixa de seleção do canal, use o ícone plus para adicionar os canais DAPI, Alexa 647 e Alexa 568.Defina isso para medir em um único plano de um micrômetro. Otimize o tempo e as configurações de potência para a eficiência de coloração da placa de ensaio. Certifique-se de que os canais não são medidos simultaneamente, clicando na sequência do canal para separar os canais.Em navegação e definir layout, selecione os poços de medição e selecione de 9 a 12 campos por poço. Durante a configuração, clique em um campo representativo no mapa da placa. E verifique cada canal de medição, por sua vez, para garantir que a mancha esteja presente, e que as imagens estejam focadas ajustando o deslocamento do canal.Para carregar os dados em um servidor para análise remota, clique na caixa de trabalhos online e no nome de tela relevante. Salve o protocolo de ensaio clicando no botão salvar"e clique na guia executar experimento"na parte superior. Nomeie a placa de experimento, em seguida, clique em iniciar "Um tempo de célula ao vivo vive phagocytosis ensaio mostrou que com 10, 000 SH-SY5Ys por poço, o número de partículas de fagocitose por célula aumentou linearmente com o tempo e foi inibido em aproximadamente 50% por Cytochalasin D.Com maiores quantidades de SH-SY5Ys por poço, a fagocitose apresentou baixa linearidade, provavelmente devido à má segmentação do iPSC, macrófagos, e SH-SY5Ys em um campo de visão mais lotado.Os seguintes resultados foram obtidos por meio da realização de uma imagem de alto teor de célula fixa, incluindo esta imagem representativa da fagocitose. O aumento da quantidade de SH-SY5Ys resultou em um maior número de partículas fagocitas por célula. O ensaio de fagocitose foi validado utilizando vários inibidores da fagocitose.Cytochalasin D e Jasplakinolide inibiram significativamente a fagocitose em 91 e 90%, respectivamente. E a Bafilomicina A1 reduziu significativamente a fagocitose em 31%, quando pré-incubada por 1 hora antes da fagocitose. A adição de anexo recombinante 5 reduziu significativamente a fagocitose em 30% quando adicionada aos poços imediatamente antes da adição sh-SY5Y.Sh-SY5Ys fixos estamos confirmados para expor Phosphatidylserine usando uma sonda fluorescente Annexin 5. Considerando que os SH-SY5Ys vivos foram negativos para a coloração de Anexo 5. Vários comprimentos de duração da fagocitose, de 1 a 5 horas, foram testados utilizando-se adição escalonada de carga fagocítica.O comprimento total deste protocall pode ser encurtado preparando a carga fagítica e manchando os macrófagos iPSC em paralelo. Se você quiser fazer isso, trabalhe os tempos com antecedência e use suas incubações para preparar soluções para os próximos passos.

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fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

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