Name: Colheita e Desagregação: Um passo negligenciado na pesquisa de métodos de biofilme (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Aprenda três técnicas de colheita e desagregação de biofilmes para superfícies de policarbonato, vidro borossilicato e tubo de silicone. Este método padronizado aumenta a reprodutibilidade e minimiza vieses em pesquisas microbiológicas.

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Queremos reconhecer Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers e Fei San Lee por suas contribuições para este artigo.

1. Vórtice e sônica
<ol><li>Cresça um biofilme P. aeruginosa maduro de 15442 cultivado de acordo com o ASTM Standard E25622.</li>
	<li>Ao final do período de crescimento de 48 horas, prepare-se para tratar os cupons de biofilme e amostra de acordo com o ASTM Standard E28718
</li>
	<li>Asepticamente insira protetores de respingo autoclaved em tubos cônicos estéreis de 50 mL usando fórceps esterilizados por chamas. Repita para todos os tubos que receberão tratamento. Tubos para cupons de controle não precisam de um protetor de respingo.</li>
	<li>Remova asepticamente uma haste selecionada aleatoriamente do Reator de Biofilme CDC. Enxágüe cupons para remover células frouxamente anexadas mergulhando suavemente a haste em 30 mL de água tampão estéril.</li>
	<li>Segure a haste paralela à parte superior do banco, sobre um tubo cônico vazio e estéril de 50 mL e usando uma chave Allen esterilizada por chamas, solte o parafuso definido para soltar um cupom revestido de biofilme no tubo. Repita para o número desejado de cupons. Remova os protetores de respingo e coloque em um recipiente separado para esterilização.</li>
	<li>Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, pipeta lentamente 4 mL do tratamento ou controle nos tubos para que o líquido flua pelo interior da parede do tubo.</li>
	<li>Toque suavemente na parte inferior do tubo para que quaisquer bolhas de ar sob o cupom sejam deslocadas. Permitir 30 - 60 s entre cada adição.</li>
	<li>Ao final do tempo de contato especificado, pipeta 36 mL de neutralizador nos tubos na mesma ordem que o tratamento (ou controle) foi aplicado. NOTA: O volume final de tratamento combinado e neutralizador é importante para determinar com precisão a densidade do tronco de biofilm.</li>
	<li>Vórtice cada tubo na configuração mais alta para 30 ± 5 s. Certifique-se de que um vórtice completo seja alcançado. NOTA: Deve-se ter cuidado ao emitir cupons pesados, como aço inoxidável em frascos de vidro onde possa ocorrer quebra.</li>
	<li>Determine o número ideal de tubos por banho e colocação dentro do rack do tubo de ensaio antes de processar amostras reais. Se processar várias amostras, confirme que a temperatura da água no banho sonicating é de 21 ± 2 oC.</li>
	<li>Coloque tubos no rack de tubo suspensos no sonicator desgassed de tal forma que o nível de água no banho seja igual ao nível líquido em tubos. Sonicate a 45 kHz, 100% de potência e função Normal para 30 ± 5 s. Repita os ciclos de vórtice e sônica e termine com um vórtice final (5 ciclos no total). NOTA: Estes tubos com o biofilme colhido e desagregado são a diluição 100 ou 0.</li>
	<li>Amostra diluída em série em água tamponada. Placa no ágar R2A usando método de revestimento apropriado. Incubar a 36 ± 2 oC por 24 h. Conte colônias conforme apropriado para o método de chapeamento usado e dados de registro.</li>
</ol>2. Raspagem e homogeneização
<ol><li>Cresça um biofilme P. aeruginosa maduro ATCC 15442 de acordo com o ASTM Standard E264713.</li>
	<li>Configure a estação de amostragem para incluir placa de amostragem, 95% de etanol em um béquer, queimador de álcool, hemostats, ferramenta de remoção de cupom, béquers com água de diluição estéril e tubos de diluição para enxaguar os cupons.</li>
	<li>Desligue a bomba. Remova uma tampa de canal e use uma ferramenta de remoção de cupom estéril e hemostats para remover o cupom, tomando cuidado para não perturbar o biofilme.</li>
	<li>Enxágüe o cupom imergindo suavemente, com um movimento fluido, em 45 mL de água de diluição estéril (contida em um tubo de centrífuga de 50 mL). Inverta imediatamente o movimento para remover o cupom.</li>
	<li>Coloque o cupom em um béquer contendo 45 mL de água de diluição estéril. Raspe a superfície do cupom coberto de biofilme em uma direção descendente por aproximadamente 15 s, usando uma espátula estéril ou raspador. Enxágüe a espátula ou raspadora mexendo-a no béquer. Repita o processo de raspagem e lavagem 3-4 vezes, garantindo a cobertura completa da superfície do cupom.</li>
	<li>Enxágüe o cupom segurando-o em um ângulo de 60° sobre o béquer estéril e tubos de 1 mL de água de diluição estéril sobre a superfície do cupom. Repita para um total de 5 enxágues. O volume final no béquer é de 50 mL. NOTA: O volume final de tratamento combinado e neutralizador é importante para determinar com precisão a densidade do tronco de biofilm.</li>
	<li>Substitua cada tampa do canal à medida que os cupons forem removidos.</li>
	<li>Trabalhando no armário de biossegurança, homogeneize a amostra de biofilme raspada. Conecte uma sonda homogeneizadora estéril ao homogeneizador, coloque a ponta da sonda no líquido, ligue o homogeneizador e aumente até 20.500 rpm.</li>
	<li>Homogeneize a amostra para 30 s. Abaixe os RPMs e desligue o homogeneizador.</li>
	<li>Higienize a sonda entre amostras de biofilme homogeneizando um 9 mL de diluição estéril em branco a 20.500 rpm por 30 s como descrito acima. Homogeneize um tubo de 9 mL de 70% de etanol para 30 s, desprende a sonda e deixe ficar no tubo de etanol por 1 min. Homogeneize dois espaços adicionais de diluição. NOTA: Pode ser utilizado um teste homogeneizador descartável para cada amostra.</li>
	<li>Diluir as amostras em água tamponada. Placa no ágar R2A usando o método de revestimento apropriado. Incubar placas a 36 ± 2oC por 24 h, contar colônias conforme apropriado ao método de chapeamento utilizado e registrar dados.</li>
</ol>3. Raspagem, vórtice e sônica
<ol><li>Cresça um biofilme Escherichia coli maduro ATCC 53498 em tubos de cateter de silicone10.</li>
	<li>Prepare materiais de amostragem: tubos de lavagem, tubo de centrífugas estéril, placa de Petri estéril vazia, hemostato de aço inoxidável esterilizado e tesoura, temporizador e régua.</li>
	<li>Com a bomba pausada, use 70% de etanol para limpar a parte externa da tubulação. Meça 2 cm a partir da extremidade, evitando a área anexada ao conector, e marque a tubulação para determinar os locais de corte.</li>
	<li>Com a tesoura esterilizada da chama, corte o tubo na marca de 2 cm e coloque o segmento em placa de Petri estéril vazia. Limpe a tubulação com 70% de etanol e reconecte a extremidade distal ao tubo de resíduo.</li>
	<li>Enxágüe o segmento de tubos para remover células planctônicas. Com fórceps esterilizados pela chama, mergulhe suavemente o segmento de tubos em 20 mL de água de diluição estéril e, em seguida, remova imediatamente. Coloque o segmento em 10 mL de neutralizador.</li>
	<li>Com fórceps esterilizados de chama, segure o segmento de tubulação e raspe com vara de aplicador de madeira estéril até que todas as áreas internas do tubo tenham sido raspadas. Ocasionalmente enxágue a vara nos 10 mL de neutralizador e coloque o segmento de volta no tubo de amostra. O segmento de tubulação raspada é a diluição de 100 ou 0. NOTA: O volume final de tratamento combinado e neutralizador é importante para determinar com precisão a densidade do tronco de biofilm.</li>
	<li>Vórtice cada tubo na configuração mais alta para 30 ± 5 s. Coloque o tubo no rack de tubo suspenso no sonicator de tal forma que o nível de água no banho seja igual ao nível líquido nos tubos. Sonicate a 45 kHz, 100% de potência e função Normal por 30 ± 5 segundos. Repita os ciclos de vórtice e sônica e termine com um vórtice final. NOTA: Este tubo com o biofilme colhido e desagregado é a diluição de 100 .</li>
	<li>Diluir as amostras em água tamponada. Placa no Tryptic Soy Agar usando o método de revestimento apropriado.</li>
	<li>Incubar placas a 36 ± 2 oC por 24 h. Conde colônias conforme apropriado para o método de chapeamento usado, registrar dados e calcular a média aritmética.</li>
</ol>

<ol><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASTM+Standard+E2562%2C+2017%2C+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+with+High+Shear+and+Continuous+Flow+using+CDC+Biofilm+Reactor%5BTitle%5D)+AND+%22ASTM+International%22%5BJournal%5D)">ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.</a> ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2017).</li>
<li>Environmental Protection Agency (USEPA). Efficacy Test Methods, Test Criteria, and Labeling Guidance for Antimicrobial Products with Claims Against Biofilm on Hard, Non-Porous Surfaces. Environmental Protection Agency (USEPA). , Available from: 
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<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Gomes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+reactors+for+the+study+of+medical+biofilms%3A+a+review+of+the+principles+and+latest+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).</li>
<li>Goeres, D. M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoeres%2C+DM+%22Recent+Trends+in+Biofilm+Sciences+and+Technology%22">Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology</a>. Simoes, M., et al. , Elsevier Science and Technology. 71-88 (2020).</li>
<li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).</li>
<li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASTM+Standard+E2871%2C+Standard+Test+Method+for+Determining+Disinfectant+Efficacy+Against+Biofilm+Grown+in+the+CDC+Biofilm+Reactor+Using+the+Single+Tube+Method%5BTitle%5D)+AND+%22ASTM+International%22%5BJournal%5D)">ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method.</a> ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2019).</li>
<li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Biofilm+Efficacy+Test%3A+The+Single+Tube+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method.</a> Journal of Microbiological Methods. , (2019).</li>
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<li>Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checking+the+Validity+of+the+harvesting+and+Disaggregating+Steps+in+Laboratory+Tests+of+Surface+Disinfectants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants.</a> Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).</li>
<li>Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConlon%2C+BP+%22Biofilm-based+Healthcare-associated+Infections%22">Biofilm-based Healthcare-associated Infections</a>. Donelli, G. , (2015).</li>
<li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASTM+Standard+E2647%2C+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+Using+Drip+Flow+Biofilm+Reactor+with+Low+Shear+and+Continuous+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22ASTM+International%22%5BJournal%5D)">ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow.</a> ASTM International. , West Conshohocken, PA. (2020).</li>
<li>Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propidium+iodide+staining+underestimates+viability+of+adherent+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells.</a> Scientific Reports. , (2019).</li>
<li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li>
<li>Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Ultrasonication+Improves+Detection+of+Biofilm-formative+Bacteria+Around+a+Metal+Implant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).</li>
<li>Lourenco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+information+about+a+biofilm+experiment+%28MIABiE%29%2C+standards+for+reporting+experiments+and+data+on+sessile+microbial+communities+living+at+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces.</a> Pathogens and Disease. 0, 1-7 (2014).</li>
<li>Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Ultrasonic+Baths+for+Analytical+Applications%3A+A+New+Approach+for+Optimisation+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Brazilian+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions.</a> Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).</li>
<li>Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Elma+GmbH+%26+Co%22">Elma GmbH & Co</a>. , Singen, Germany. (2009).</li>
<li>Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+times+and+energy+densities+for+ultrasonic+disinfection+of+Escherichia+coli%2C+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Enterococcus+avium+and+sewage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Engineering+and+Science%22%5BJournal%5D)">Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage.</a> Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).</li>
<li>Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sonochemistry.</a> Science. 247 (4949), (1990).</li>
</ol>

Os autores não têm revelações.

Informações mínimas para métodos de colheita e desagregação Para criar dados reprodutíveis de biofilme em toda a comunidade científica, é imprescindível que os autores incluam o máximo de detalhes possível em relação a cada uma das etapas de crescimento, tratamento, amostragem e análise de um método de biofilme. A padronização dos métodos de biofilme tem auxiliado nesse esforço, pois permite ao pesquisador referenciar um método específico e quaisquer modificações relevantes. No entanto, muitos artigos...

A definição de biofilme evoluiu ao longo das últimas décadas e engloba a associação microbiana com uma variedade de superfícies biológicas e/ou não biológicas, inclusão de componentes nãocelulares1 que apresentam crescimento diferente e expressão genética2 dentro de uma matriz. O biofilme fornece proteção contra estresses ambientais, como a secagem, pode tornar a ação de desinfetantes químicos menos eficaz, resultando na sobrevivência de micróbios. Os sobreviventes dentro de um biofilme podem potencialmente fornecer uma fonte de microrganismos patogênicos que são uma preocupação de saúde pública3.
Os métodos de biofilme são compostos por quatro etapas, crescimento, tratamento, amostragem (colheita e desagregação) e análise. O crescimento, o primeiro passo, onde o usuário determina as condições de crescimento do organismo, temperatura, mídia, etc., é o mais considerado e relatado na literatura de biofilme4,5,6,7. A etapa de tratamento avalia os antimicrobianos (por exemplo, desinfetantes) para determinar sua eficácia, seja contra um biofilme maduro3,8,9 ou o antimicrobiano pode ser incorporado à superfície para determinar a capacidade do produto de prevenir ou reduzir o crescimento do biofilme10. O terceiro passo, amostragem, inclui etapas para colher o biofilme da superfície em que estava crescendo e desagregar os aglomerados removidos3,8,11. A quarta etapa, análise, pode incluir contagem de células viáveis, microscopia, medidas de fluorescência, desfechos moleculares e/ou uma avaliação de componentes matricia8,9. A avaliação dos dados fornece informações sobre o resultado de um experimento. Dos quatro, a amostragem é muitas vezes o passo mais negligenciado porque presume que a técnica de colheita de biofilme e/ou desagregação escolhida é 100% eficaz, muitas vezes sem verificação11.
Suspensões planctônicas de bactérias, muitas vezes consideradas homogêneas, requerem vórtice simples antes da análise. Os biofilmes, no entanto, são comunidades complexas compostas por microrganismos (procarióticos e/ou eucarióticos), exopolysacarídeos, proteínas, lipídios, DNA extracelular e células hospedeiras12. Passos além dos métodos tradicionais de cultura microbiológica planctônica são necessários para colher adequadamente o biofilme de uma superfície e, em seguida, desagregá-lo em uma suspensão celular única homogênea. Uma extensa revisão da literatura (informações não incluídas nesta publicação) demonstrou que a escolha da técnica de remoção e desagregação depende de uma série de fatores, incluindo espécies presentes no biofilme, superfície a que o biofilme está ligado (não poroso ou poroso), acessibilidade a superfícies de crescimento (cupom facilmente removível ou destruição física de aparelhos nos quais o biofilme está crescendo), geometria da superfície (área e forma), densidade de biofilme em superfícies de crescimento e equipamentos de laboratório disponíveis.
Quando o biofilme é colhido de uma superfície, a suspensão celular resultante é heterogênea. Se essa suspensão não uniforme for enumerada com precisão, ela deve ser desagregada em células individuais. As placas viáveis assumem que uma unidade formadora de colônias se origina de uma bactéria. Se os agregados de biofilme forem colocados no meio de crescimento, é impossível distinguir células individuais que poderiam levar a estimativas imprecisas. Por exemplo, durante o teste de eficácia desinfetante, se um tratamento remover o biofilme de forma muito eficaz de uma superfície em comparação com o controle, a redução do tronco pode parecer artificialmente grande em comparação com o controle. Por outro lado, um desinfetante químico que fixa biofilme em uma superfície em comparação com o controle parecerá ter uma redução menor do tronco11. Esse tipo de cenário pode levar a uma interpretação tendenciosa dos dados experimentais.
Em preparação para a publicação, uma revisão da literatura determinou que abordagens comuns à colheita e desagregação do biofilme incluem raspagem, swabbing, sonicação, vórtice ou uma combinação destes. A raspagem é definida como remoção física de biofilme de superfícies com uma vara estéril, espátula ou outra ferramenta. Swabbing refere-se à remoção de biofilme de superfícies com uma vara de ponta de algodão ou outro material absorvente fixo. A sônica refere-se à interrupção do biofilme das superfícies através de ondas ultrassônicas distribuídas através da água. Vortexing refere-se ao uso de uma batedeira para alcançar um vórtice líquido da amostra dentro de um tubo. A homogeneização utiliza lâminas rotativas para tesourar aglomerados de biofilme colhidos em uma única suspensão celular. Neste artigo, apresentamos três métodos de colheita e desagregação para dois tipos de superfície diferentes, duros/não porosos e porosos.
Uma lista de informações mínimas recomendadas que os pesquisadores devem incluir nos métodos seções de publicações é fornecida. Esperamos que a inclusão dessas informações permita que outros pesquisadores reproduzam seu trabalho. Não há um método perfeito de colheita e desagregação, portanto, recomendações de como verificar a técnica também são fornecidas.
Três métodos comuns para colher e desagregar biofilme de superfícies comuns de crescimento são demonstrados neste artigo. Essas informações permitirão aos pesquisadores entender melhor a precisão e o viés geral de um método de teste de biofilme. Os métodos descritos são os seguintes: (1) Um biofilme pseudomonas aeruginosa cultivado em cupons de policarbonato (superfície não porosa dura) sob cisalhamento de fluidos elevados no Reator de Biofilme CDC é colhido e desagregado após uma combinação de cinco passos de vórtice e sonicação para alcançar a colheita de biofilme e desagregação (2) A Aeruginosa biofilme cultivado em cupons de vidro borossilicato (superfície não porosa dura) no reator de fluxo de gotejamento sob cisalhamento de baixo fluido é colhido e desagregado usando raspagem e homogeneização (3) Um biofilme Escherichia coli cultivado em tubos de silicone (superfície porosa) é colhido e desagregadoreg usando raspagem, seguido de sonicação e vórtice.

<table><tbody><tr><td>Frascos cônicos de 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>copos de vidro de 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB102100</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas de 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-12D</td><td>Para adicionar tratamento a frascos contendo cupons.</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-14C</td><td>Para adicionar neutralizador aos frascos no final do tempo de contato do tratamento.</td></tr><tr><td>Bastões aplicadores</td><td>Puritan</td><td>807</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-115</td><td></td></tr><tr><td>Espátula metálica</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373</td><td></td></tr><tr><td>Policiais em PTFE</td><td>Saint-Gobain</td><td>06369-04</td><td></td></tr><tr><td>S 10 N - 10 G - ST Ferramenta de dispersão</td><td>IKA</td><td>4446700</td><td>Para homogeneização de amostras de biofilme.</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Cateter de Foley de silicone, tamanho 16 French</td><td>Medline Industries</td><td>DYND11502</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone, tamanho 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW96400-16</td><td></td></tr><tr><td>Protetores contra respingos BioSurface</td><td>Technologies, Inc.</td><td>CBR 2232</td><td></td></tr><tr><td>T 10 Dispersor básico ULTRA-TURRAX</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td>Para homogeneização de amostras de biofilme.</td></tr><tr><td>Conectores de tubulação</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW02023-86</td><td></td></tr><tr><td>Limpador Ultrassônico</td><td>Elma</td><td>TI-H15</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 Suporte de Tubo Vertical de 50 mL</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-V506</td><td></td></tr></tbody></table>

colheita e desagregação: um passo negligenciado na pesquisa de métodos de biofilme

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Os métodos de biofilme consistem em quatro etapas distintas: o crescimento do biofilme em um modelo relevante, o tratamento do biofilme maduro, a colheita do biofilme da superfície e a desagregação dos aglomerados e a análise da amostra. Das quatro etapas, a colheita e a desagregação são as menos estudadas, mas ainda assim críticas quando se considera o potencial de viés de teste. Este artigo demonstra técnicas de colheita e desagregação comumente utilizadas para biofilme cultivado em três superfícies diferentes. As três técnicas de coleta e desagregação de biofilmes, obtidas a partir de uma extensa revisão da literatura, incluem vórtice e sônica, raspagem e homogeneização, raspagem, vórtice e sônicação. Dois tipos de superfície são considerados: duro não poroso (policarbonato e vidro borossilicato) e poroso (silicone). Além disso, fornecemos recomendações para as informações mínimas que devem ser incluídas ao relatar a técnica de colheita seguida e um método de acompanhamento para verificar o viés.

Validação/Confirmação de um Método de Colheita Vários estudos realizados em nosso laboratório examinaram a capacidade de vórtice e sônica para colher efetivamente o biofilme cultivado no reator biofilme (ASTM E2562)2 utilizando o Método Único do Tubo (ASTM E2871)8.
Um biofilme P. aeruginosa ATCC 15442 foi cultivado de acordo com aSTM E25622 em cupons de vidro borossilicato. Após 48 horas, quatr...

Este artigo detalha métodos que demonstram três técnicas comuns de coleta e desagregação de biofilmes em dois tipos de superfície, testes de robustez de um método de colheita e informações mínimas a serem consideradas ao escolher e otimizar técnicas de colheita e desagregação para aumentar a reprodutibilidade.

Colheita e Desagregação: Um passo negligenciado na pesquisa de métodos de biofilme

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

O objetivo geral desses procedimentos é colher e desagregar biofilmes da maneira ideal para aumentar a reprodutibilidade. Três técnicas serão demonstradas neste vídeo, cada uma com foco na colheita e desagregação de um tipo de superfície diferente. Este vídeo demonstrará as técnicas adequadas para um, vórtice e sonicação biofilm de uma superfície não porosa dura, como um cupom de policarbonato do reator de biofilme CDC.Segundo, a raspagem e homogeneização do biofilme da superfície de vidro borossilicato dura não porosa comumente encontrada no reator de fluxo de gotejamento. E três, a raspagem, vórtice e sonicação de biofilme de uma superfície de tubo de silicone porosa comumente encontrada no modelo de cateter. Oi, meu nome é Kelly Buckingham-Meyer aqui no Laboratório de Métodos Padronizados de Biofilm.Em nosso laboratório, dividimos os métodos de biofilme em quatro componentes: crescimento, tratamento, amostragem e análise. Na literatura revisada por pares, detalhes de como os biofilmes são amostrados ou colhidos e desagregados de uma superfície são tipicamente escassos. Esta é a razão deste vídeo.Como nosso laboratório desenvolve e testa métodos padronizados de biofilme, realizam

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Biologia

Biofilmes formados nas superfícies dos dentes são altamente complexos e expostos a constante inata e exógenos desafios ambientais, que modulam sua arquitetura, fisiologia e transcriptoma. Nós desenvolvemos uma caixa de ferramentas para examinar a composição, organização estrutural e expressão gênica de biofilmes orais, que pode ser adaptado para outras áreas de pesquisa biofilme.

Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans

Um protocolo para a quantificação e comparação simultânea de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes é apresentado. A metodologia envolve o uso de microscopia confocal de varredura a laser, software de análise e visualização estrutural de biofilme e software de análise estatística.

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

O objectivo deste trabalho é métodos para descrever o uso de um sistema de microfluidos para o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies que contêm espécies normalmente identificados na placa dental supragengival humano. Métodos para descrever arquitetura biofilme, a viabilidade de biofilme, e uma abordagem para a colheita de biofilme para análises dependentes de cultura ou independentes de cultivo são realçados.

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

Os biofilmes têm interações complexas com o ambiente circundante. Para investigar de forma abrangente as interações biofilme-ambiente, apresentamos aqui uma série de métodos para criar um ambiente químico heterogêneo para o desenvolvimento do biofilme, quantificar a velocidade do fluxo local e analisar o transporte de massa dentro e ao redor das colônias de biofilme.

Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade

Este estudo apresenta o desenvolvimento de metodologias reprodutíveis para estudar inibidores de biofilme e seus efeitos sobre a multicelularidade de Bacillus subtilis.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Citometria de fluxo em combinação com o cluster visual oferece um método fácil de usar e rápido para o estudo de biofilmes aquáticos. Pode ser usada para a caracterização do biofilme, detecção de mudanças na estrutura da comunidade de biofilme e detecção de partículas abióticas incorporado no biofilme.

Caracterização de biofilmes aquáticos com citometria de fluxo

A imunoprecipitação de cromatina, juntamente com o sequenciamento de última geração (ChIP-seq), é um método usado para estabelecer interações entre fatores de transcrição e as sequências genômicas que eles controlam. Este protocolo descreve técnicas para a realização de ChIP-seq com biofilmes bacterianos, usando salmonella enterica serovar Typhimurium biofilme bacteriano como um exemplo.

Descobrindo metas regulatórias csgd em salmonella biofilme usando imunoprecipitação de cromatina e sequenciamento de alta produtividade (ChIP-seq)

Um procedimento rápido e padronizado para estabelecer comunidades sinérgicas de biofilmes multiespécies de vários solos da rizosfera é apresentado aqui. É um protocolo único projetado para sondar e simular a complexa microbiota do solo da rizosfera.

Uma abordagem para a construção de comunidades de biofilme multiespécies a partir do solo da rizosfera

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho modular BSL-2 que combina ensaios de biomassa cristal-violeta, cinética de contraste de fase em time-lapse, mapeamento confocal 3D/matricial, ultraestrutura SEM e um módulo in vivo de infecção por hamster para cultivar, quantificar, caracterizar e investigar o papel funcional do biofilme de Leptospira , possibilitando avaliação padronizada de mutantes e intervenções anti-biofilme em laboratórios.

Um Fluxo de Trabalho Modular para Análise Quantitativa, Estrutural e Funcional de Biofilmes de Leptospira

Aprenda três técnicas de colheita e desagregação de biofilmes para superfícies de policarbonato, vidro borossilicato e tubo de silicone. Este método padronizado aumenta a reprodutibilidade e minimiza vieses em pesquisas microbiológicas.

Colheita e Desagregação: Um passo negligenciado na pesquisa de métodos de biofilme

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