Colheita e Desagregação: Um passo negligenciado na pesquisa de métodos de biofilme

O objetivo geral desses procedimentos é colher e desagregar biofilmes da maneira ideal para aumentar a reprodutibilidade. Três técnicas serão demonstradas neste vídeo, cada uma com foco na colheita e desagregação de um tipo de superfície diferente. Este vídeo demonstrará as técnicas adequadas para um, vórtice e sonicação biofilm de uma superfície não porosa dura, como um cupom de policarbonato do reator de biofilme CDC.

Segundo, a raspagem e homogeneização do biofilme da superfície de vidro borossilicato dura não porosa comumente encontrada no reator de fluxo de gotejamento. E três, a raspagem, vórtice e sonicação de biofilme de uma superfície de tubo de silicone porosa comumente encontrada no modelo de cateter. Oi, meu nome é Kelly Buckingham-Meyer aqui no Laboratório de Métodos Padronizados de Biofilm.

Em nosso laboratório, dividimos os métodos de biofilme em quatro componentes: crescimento, tratamento, amostragem e análise. Na literatura revisada por pares, detalhes de como os biofilmes são amostrados ou colhidos e desagregados de uma superfície são tipicamente escassos. Esta é a razão deste vídeo.

Como nosso laboratório desenvolve e testa métodos padronizados de biofilme, realizamos uma extensa revisão bibliográfica onde foram identificados os três métodos mais comuns de coleta e desagregação de biofilmes. Esses métodos são vórtices e sonicização de biofilme de um cupom de policarbonato, raspagem e homogeneização de biofilme de um cupom de vidro borossilicato, e raspagem, vórtice e biofilme sonicating de tubos de silicone. Embora os métodos escritos no papel sejam poderosos, esperamos que o vídeo com os detalhes técnicos apresentados pela minha colega lindsey Miller e eu seja útil.

Para começar, cresça o biofilme pseudomonas aeruginosa aeruginosa 15442 de acordo com o ASTM Standard E2562, o Método Padrão de Teste para Quantificação de Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cultivado com Alta Tesoura e Fluxo Contínuo usando o Reator de Biofilme CDC. Ao final do período de crescimento de 48 horas, prepare-se para tratar e provar cupons de acordo com o ASTM Standard E2871, o Método padrão de teste para determinar a eficácia de desinfetante contra o biofilme cultivado no reator de biofilme CDC usando o método do tubo único. Em seguida, asepticamente insira protetores de respingo autoclaved em tubos cônicos estéreis de 50 mililitros usando fórceps esterilizados pela chama.

Repita para todos os tubos que receberão tratamento. Tubos para cupons de controle não precisam de um protetor de respingo. Remova asepticamente uma haste do reator de biofilme CDC e enxágue-a em 30 mililitros de água de diluição estéril.

Isso removerá as células frouxamente ligadas do biofilme. Segure a haste paralela ao topo do banco sobre os tubos de amostra com protetores de respingo. Usando uma chave Allen esterilizada por chamas, solte os parafusos do conjunto para soltar um cupom revestido de biofilm no tubo.

Repita para o número desejado de cupons. Remova os protetores de respingo e coloque os protetores de respingo em um recipiente separado para esterilização. Usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros, pipeta lentamente quatro mililitros de tratamento ou controle nos tubos para que o líquido flua pelo interior da parede do tubo.

Gire suavemente a parte inferior do tubo para que quaisquer bolhas de ar sob o cupom sejam deslocadas. Deixe por 30 a 60 segundos entre cada adição. Ao final do tempo de contato especificado, pipeta 36 mililitros de neutralizador nos tubos na mesma ordem que o tratamento ou controle foi aplicado.

Vórtice de cada tubo na configuração mais alta por 30 mais ou menos cinco segundos e certifique-se de que um vórtice completo seja alcançado. Coloque tubos no rack de tubo suspensos no sonicador desgassed de tal forma que o nível de água no banho seja igual ao nível de água nos tubos. Sonicar as amostras a 45 kilohertz, 100% de potência e função normal por 30 mais ou menos cinco segundos.

Repita os ciclos de vórtice e sônica e termine com um vórtice final, para um total de cinco ciclos. Por fim, dilui a amostra em série, emplaque a diluição no ágar R2A e incuba as placas por 24 horas a 36 graus Celsius. Conte as colônias conforme apropriado ao método de chapeamento e regise os dados.

Esta próxima técnica de colheita e desagregação de biofilmes é útil para cupons não porosos duros que são o padrão no reator de fluxo de gotejamento. Cresça um biofilme pseudomonas aeruginosa maduro 15442 de acordo com o ASTM Standard E2647 o Método padrão de teste para quantificação de pseudomonas aeruginosa Biofilm Cultivado usando reator de biofilme de fluxo de gotejamento com cisalhamento baixo e fluxo contínuo. Configure a estação de amostragem para incluir uma placa de amostragem, 95% de etanol em um béquer, um queimador de álcool, hemostats, uma ferramenta de remoção de cupom, béquers com água de diluição estéril e tubos de diluição para enxaguar os cupons.

Desligue a bomba, remova a tampa do canal e use a ferramenta de remoção de cupom estéril e hemostats para remover o cupom, tomando cuidado para não perturbar o biofilme. Enxágüe o cupom imergindo suavemente com um movimento fluido em 45 mililitros de água de diluição estéril contida em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Inverta imediatamente o movimento para remover o cupom.

Coloque o cupom em um béquer contendo 45 mililitros de água de diluição estéril. Raspe a superfície do cupom coberto de biofilme em uma direção descendente por aproximadamente 15 segundos usando uma espátula ou raspador estéril. Enxágüe a espátula ou raspadora mexendo-a no béquer.

Repita o processo de raspagem e lavagem três a quatro vezes, garantindo a cobertura completa da superfície do cupom. Enxágüe o cupom segurando-o em um ângulo de 60 graus sobre o béquer estéril e tubos de um mililitro de água de diluição estéril sobre a superfície do cupom. Repita para um total de cinco enxágues.

O volume final no béquer agora é de 50 mililitros. Trabalhando no armário de biossegurança, homogeneize a amostra de biofilme raspada. Conecte uma sonda homogeneizadora estéril ao homogeneizador.

Coloque a ponta da sonda no líquido e ligue o homogeneizador e aumente até 20,500 RPM. Homogeneize a amostra por 30 segundos. Abaixe o RPM e desligue o homogeneizador.

Higienize a sonda entre amostras de biofilme homogeneizando em nove mililitros de diluição estéril em branco a 20.500 RPM por 30 segundos como descrito acima. Homogeneize um tubo de nove mililitros de 70% de etanol por 30 segundos e desprende a sonda e deixe-a parada no tubo de etanol por um minuto. Homogeneize dois espaços adicionais de diluição.

Além disso, uma sonda homogeneizadora descartável estéril pode ser usada para cada amostra. Diluir em série a amostra homogeneizada, emplacar as diluições em R2A usando o método de revestimento apropriado e incubar as placas por 24 horas a 36 graus Celsius. Conte as colônias e regissou os dados.

Esta técnica final de coleta e desagregação de biofilmes é útil para o biofilme cultivado em tubos porosos como a tubulação de silicone usada no modelo do cateter. Para iniciar este procedimento, crie um biofilme E.coli 53498 maduro em tubos de cateter de silicone. Prepare os materiais de amostragem: tubos enxaguados, um tubo de centrífuga estéril, uma placa de Petri estéril vazia, hemostats de aço inoxidável esterilizado por chamas, tesoura, temporizador e uma régua.

Com a bomba pausada, use 70% de etanol para limpar a parte externa da tubulação. Meça dois centímetros a partir do final, evitando a área anexada ao conector e marque tubos para determinar locais de corte. Com uma tesoura esterilizada pela chama, corte o tubo na marca de dois centímetros.

Enxágüe o segmento de tubos para remover células planctônicas. Com fórceps esterilizados por chamas, mergulhe suavemente o segmento de tubos em 20 mililitros de água de diluição estéril e, em seguida, remova imediatamente. Coloque o segmento em 10 mililitros de neutralizador.

Com fórceps esterilizados por chamas, segure o segmento de tubos e raspe com uma vara aplicadora de madeira estéril até que todas as áreas internas do tubo tenham sido raspadas. Ocasionalmente enxágue a vara nos 10 mililitros de neutralizador e coloque o segmento de volta no tubo de amostra. O segmento de tubulação raspada é agora o 10 para o zero ou a diluição zero.

Vórtice cada tubo na configuração mais alta por 30 mais ou menos cinco segundos. Coloque os tubos no rack de tubo suspensos no banho do sonicator, de talto que o nível de água no banho seja igual ao nível líquido nos tubos. Sonicate a 45 kilohertz, 100% de potência, e função normal por 30 mais ou menos cinco segundos.

Repita este vórtice e ciclo de sônica, em seguida, termine com o vórtice final. Diluir as amostras em água tamponada. Placa no ágar de soja tripptic usando o método de revestimento apropriado e, em seguida, incubar os tubos a 36 mais ou menos dois graus Celsius por 24 horas.

Conte as colônias conforme apropriado ao método de chapeamento utilizado e regise os dados para calcular a média aritmética. Estas quatro imagens tiradas por Danielle Or e Blaine Fritz ajudam a ilustrar a importância deste procedimento de colheita e desagregação. Todos esses quatro cupons foram manchados com violeta cristalina para ajudar a visualizar a quantidade de pseudomonas aeruginosa biofilm presente nos cupons antes e depois do vórtice e processo de sônica.

O cupom A é completamente coberto em biofilme, enquanto os cupons B, C e D têm substancialmente menos biofilme em sua superfície. Os cupons B, C e D foram todos submetidos ao vórtice e processo de sônica descrito anteriormente. Estas duas imagens tiradas por Lindsey Miller em um microscópio confocal em 12,5X de ampliação retrata um biofilme Pseudomonas aeruginosa que foi tratado com a luz traseira viva/morta mancha.

A imagem à esquerda foi sônica a 45 kilohertz e 10% de potência, enquanto a imagem à direita foi sônica a 45 kilohertz e 100% de potência. Claramente, o cupom à esquerda tem muito mais biofilmes remanescentes em sua superfície em comparação com o cupom à direita. Esta figura final mostra como a manipulação de diferentes parâmetros de sônica afeta a quantidade de pseudomonas aeruginosa biofilm removido da superfície do cupom.

Todos esses cupons foram sonicados a 45 kilohertz, 100% de potência, e na configuração normal por 30 mais ou menos cinco segundos. Estas imagens foram tiradas em 12,5X de ampliação por Lindsey Miller. Os cupons na primeira fila foram sonicados em água de diluição, enquanto os cupons da linha dois foram sonicados em caldo neutralizante DE.

Parece que há menos biofilme remanescente nos cupons que foram sonicados no caldo DE que contém um surfactante em comparação com a água de diluição. Os cupons A, B, E e F foram todos sonicados em um volume de 10 mililitros, enquanto os cupons C, D, G e H foram sonicados em 40 mililitros de solução. Há claramente menos biofilm nos cupons que foram sonicados nos volumes menores.

Os cupons A, C, E e G foram sonicados no banho com três tubos ao mesmo tempo, enquanto os cupons B, D, F e H foram sonicados em um banho com 12 tubos ao mesmo tempo. Parece que as amostras sonicadas com menos tubos apresentaram colheita superior de biofilme. Em última análise, minimizar o volume nos tubos, reduzir o número de tubos sonicados de uma só vez, e o uso de caldo neutralizante DE parecem contribuir para uma maior colheita de biofilmes.

Não há um método perfeito para colher e desagregar o biofilme, mas algumas abordagens são melhores para diferentes superfícies e/ou aplicações. As técnicas demonstradas neste vídeo são os três métodos mais comuns de acordo com uma revisão biblio literatura. Essas três técnicas podem fornecer um ponto de partida para os pesquisadores.

É importante aproveitar o tempo para validar o método de colheita e desagregação escolhido. Todos os equipamentos são ligeiramente diferentes, por isso, mesmo que o método tenha sido padronizado, ainda é prudente confirmar o processo para o equipamento utilizado. Pesquisas demonstraram que escolhas inadequadas podem levar a resultados de testes tendenciosos.

Depois de assistir a este vídeo, essas informações, esperançosamente, ajudarão os pesquisadores a tomar decisões mais informadas sobre qual método usar e fornecer orientações sobre a melhoria da reprodutibilidade para os três tipos de superfície e técnicas de colheita e desagregação complementares.