Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

Este protocolo é útil para campanhas de descoberta de chumbo de base fragmentada como uma ferramenta adicional para selecionar fragmentos promissores como candidatos a calor. Nano DSO para triagem de fragmentos usa uma quantidade limitada de amostra de proteína sem rótulo e pode ser usado rotineiramente para quase todos os alvos proteicos. Este método pode ser usado para tela de quaisquer coleções de ligantes.

ou verificar calores dos outros métodos. Retire uma placa de fragmento do congelador menos 20 ou menos 80 graus Celsius e deixe descongelar à temperatura ambiente com um tremor suave em um shaker de bancada. Centrifugar a placa a 500 vezes G durante 30 segundos para coletar quaisquer gotas grudando na lateral dos poços.

Pegue uma placa de cristalização MRC 2-well e pipeta 15 microliters da solução de estoque de proteínas em cada sub-poço usando uma pipeta multicanal. Para verificar as definições de fragmentos e placas proteicas no Mosquito, ligue o distribuidor de nano e certifique-se de que não há obstáculos ao redor dos componentes móveis. Abra a interface gráfica do usuário, clique na guia Configuração e em Configuração de Deck verifique se o tipo de placa em que os compostos são fornecidos e aquele em que a proteína é transferida já estão presentes na lista de placas disponíveis.

Caso não, clique em Opções e, em seguida, Placas e crie uma nova definição de placa preenchendo os valores corretos para o tipo de propriedade. Na guia Configuração, especifique as posições da placa sob a configuração Deck. Usando o menu suspenso, escolha grainier u placa inferior para a posição um e placa MRC 2-well para a posição dois e salve o protocolo.

Coloque a placa de fragmento na posição um e a placa de proteína na posição dois do convés. Na guia protocolo, clique em Arquivo e escolha o protocolo salvo na etapa anterior para dispensar os fragmentos. Defina o volume dos fragmentos a serem dispensados como microliters 0,3.

Para uma placa típica onde as colunas um e 12, não contenha fragmentos, defina o local Iniciar para a coluna dois e o local final da coluna 11. Em algumas placas, se as colunas duas ou 11 estiverem vazias, use as colunas três e 10 como valores de início e fim. Clique em Executar para iniciar o programa.

Após a dispensa, que leva cerca de dois minutos é concluída, remova a proteína e as placas de fragmento do robô e sele-as com um filme de vedação adesivo. Centrifufique brevemente a placa de proteína a 500 vezes G durante 30 segundos para coletar qualquer gota grudando nas laterais dos poços antes de prosseguir para o próximo passo. Inspecione visualmente os poços da placa de proteína para precipitação que pode ter ocorrido devido à adição dos fragmentos.

Se a precipitação for observada em muitos poços, reduza a concentração dos fragmentos e repita o experimento. Ligue o instrumento Prometeu. Na tela de toque, pressione a Gaveta Aberta para acessar o módulo de carregamento capilar do instrumento.

Remova a tira magnética do módulo de carga e limpe o espelho com etanol para remover quaisquer partículas de poeira. Para transferir uma solução da placa de fragmentos de proteína para os capilares, coloque a placa de proteína e os capilares ao lado do instrumento para fácil acesso ao módulo de carregamento capilar. Pegue um capilar segurando-o em uma extremidade e toque a solução na placa de proteína com a outra extremidade do capilar para transferir a amostra.

Use sempre luvas e certifique-se de não tocar no capilar no meio, pois as impurezas das luvas afetariam a medida. Coloque o capilar na posição designada do titular, certificando-se de que está devidamente alinhado e centrado, repita essas etapas para preencher todas as posições no módulo de carregamento. No final, coloque a tira magnética em cima dos capilares para mantê-los no lugar e pressione a Gaveta De Perto para iniciar o experimento Nano-DSF.

Abra o aplicativo Prometheus PR. ThermControl e criar um novo projeto clicando em Iniciar nova sessão. Primeiro, faça uma varredura de descoberta para detectar a fluorescência das amostras. Altere o sinal fluorescente das amostras ajustando o poder de excitação do laser.

Para uma desnaturação térmica, clique na guia Melting Scan, defina a temperatura inicial para 20 graus Celsius, a temperatura final para 95 graus Celsius e a inclinação da temperatura para um grau Celsius por minuto. Em seguida, clique em Iniciar medição. Distribuição de frequência da mudança e temperatura de fusão para o exterior, cinético ou altamente expresso em câncer uma proteína, tetratricopeptida reguladora repetição domínio do fuso monopolar quinase 1, e SARS-CoV-2 3c-like protease são mostrados aqui.

Valores negativos indicam uma redução da temperatura de fusão na presença de um fragmento, enquanto um valor positivo indica um aumento na temperatura de fusão. Para O Nsp5, todos os fragmentos têm um efeito de estabilização, enquanto para Hec1 e Mps1, tanto os acertos estabilizadores quanto de estabilização são observados. Este é um método barato e rápido para tela de bibliotecas de fragmentos.

Outros métodos como NMR ou Cristalografia de raios-X podem mostrar a ligação exata dos fragmentos e eles também estão disponíveis através da descoberta do INX. Os resultados com protease coronavírus ajudaram a propor novos compostos que podem ser desenvolvidos em drogas contra o COVID-19.