Proteínas de carregamento de contas e ácidos nucleicos em células humanas aderentes
1 de junho de 2021
O carregamento de contas introduz proteínas, plasmídeos e partículas em células de mamíferos aderentes. Esta técnica de carregamento celular é barata, rápida e não afeta substancialmente a saúde celular. É mais adequado para imagens de células vivas.
O carregamento de contas é um ensaio barato para carregar membrana, partículas impermeáveis em células aderentes vivas. Este protocolo provou ser extremamente útil para carregar sondas para uma única célula ou uma única molécula ou experimentos de microscopia de fluorescência. O carregamento de contas permite que os pesquisadores carreguem rapidamente todos os tipos de moléculas, incluindo proteínas, DNA, RNA, partículas sintéticas ou uma combinação delas simultaneamente em células únicas.
Ao realizar o carregamento de contas pela primeira vez, é importante testar a força de toque. As linhas celulares respondem de forma diferente ao carregamento de contas. E assim o número e a força das torneiras podem ser modificados para o carregamento ideal da célula, minimizando o pealing celular.
Para demonstrar o procedimento Matthew Saxton e eu estaremos acompanhados por nossos colegas, Dr. Amanda Cook e Gabriel Galindo. Comece medindo aproximadamente cinco mililitros de contas de vidro em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 25 mililitros de dois hidróxido de sódio molar ao tubo e misture delicadamente por duas horas usando um agitador ou um rotor.
Gire o tubo de contas brevemente em uma centrífuga se as contas estiverem suspensas, em seguida, decantar o hidróxido de sódio enquanto retém o máximo de contas possível. Lave as contas cuidadosamente com água de grau de cultura celular até que o pH seja neutro e decante a água todas as vezes. Use a tira de teste de pH no efluente para confirmar um pH neutro e depois lave as contas bem com 100% de etanol, duas a três vezes.
Decantando o etanol todas as vezes. Seque as contas e polvilhe-as para formar uma camada fina dentro de um recipiente estéril. Em seguida, deixe o recipiente aberto dentro de um armário de biossegurança para secar as contas durante a noite.
Bata suavemente ou agite o recipiente e verifique se as contas têm uma textura Sandy sem aglomeração ou descamação para garantir que as contas estejam completamente secas. Adicione as contas ao aparelho e cubra toda a abertura da câmara de retenção de contas usando uma malha de polipropileno ou material equivalente com aberturas de 105 micrômetros para permitir que as contas passem. Fixar a malha entre as extremidades masculina e feminina de uma câmara de imagem reutilizável metálica, em seguida, selá-la firmemente com o filme ceroso e UV esterilizar o aparelho por 15 minutos.
O aparelho de carregador de contas agora pode ser usado para realizar centenas de ensaios de carregamento. Armazene o aparelho em um recipiente seco dessecado por gel de sílica ou outro meio dessecante e selá-lo. Se as contas se tornarem despejar completamente secas e esterilizar o carregador de contas e substituí-lo por contas frescas, como demonstrado anteriormente.
Remova o meio das células e aspire suavemente todos os meios ao redor das bordas da câmara. Em seguida, incline a câmara em aproximadamente um ângulo de 45 graus e remova a gota restante de mídia no micro poço central. Pipeta a solução de carregamento de contas suavemente sobre o micro de vidro bem presente no centro da câmara.
Use o aparelho de carregamento de contas para dispersar suavemente uma monocamada de contas de vidro em cima das células. Certifique-se de que as contas cobrem completamente as células. Aperte a câmara com dois dedos, levante-a em torno de duas polegadas e traga-a firmemente para baixo usando uma força aproximadamente equivalente a deixar o prato dessa altura suavemente adicionar o meio de volta para a câmara, pipetando lentamente para o lado plástico da câmara.
Aspirar quaisquer contas flutuantes sem perturbar as células, todo o procedimento de carregamento de contas deve ser realizado relativamente rapidamente. Assim, as células não secam quando estão sem meio. Em seguida, incubar as células de 4,5 a duas horas na incubadora.
Antes de fotografar, lave as células três vezes com o meio para remover contas e componentes de carregamento excessivos na solução de carregamento. Imagem as células imediatamente ou quando exigido pelo experimento usando instruções no manuscrito de texto. Células que foram carregadas com sucesso, quase sempre tinham Cy3-Pa57 e A488-H3K11ac rotuladas as proteínas juntas.
Um micrograma de DNA plasmídeo e codificação GFP e 0,5 microgramas de proteína rotulada Cy3 também foi introduzido nas células através do carregamento de contas expresso e visualizado. 40% das células eram repletas de proteína fab e 21% das células carregadas de contas expressam o núcleo carregado plasmid. As células carregadas de contas expressavam diferentes níveis de plasmídeo.
O resultado desse teste de razão de Fisher mostrou que, embora as proteínas um e dois tivessem distribuições de intensidade semelhantes, cada proteína tinha uma distribuição significativamente menor do que o plasmídeo. Os níveis de proteínas carregadas de contas tinham pouca variância celular para célula e os níveis de duas proteínas carregadas simultaneamente estavam altamente correlacionados entre si. O carregamento adequado de contas não teve quase nenhum efeito perceptível no número de células U2OS humanas ou sua morfologia quando imagens diretamente antes, diretamente depois e 24 horas após o carregamento de contas.
O mau carregamento de contas com contas excessivas e força de toque causou perda celular, morfologia celular ruim e agrupamentos de contas remanescentes no vidro de cobertura. embora as células sejam consideradas submetidas a danos mecânicos durante as células de carregamento de contas cresceram e proliferaram na câmara devidamente carregada de contas. Observou-se também que as células carregadas de contas, submetidas à divisão celular.
As linhas celulares RPE1 e heLa foram carregadas com fab para demonstrar a versatilidade da técnica de carregamento de contas. As células U2OS também foram carregadas com um Cy5-RNA 9-mer, e Cy3-DNA 28-mer juntos. Ao tentar este protocolo, certifique-se de adicionar apenas uma monocamada de contas às células, já que muitas contas fazem com que as células se desprendem.
Assim, depois de um breve post de recuperação de 30 minutos para células de carregamento de contas estão prontos para imagens imediatamente ou horas depois, se o procedimento exigir outras etapas, como a coloração, que pode ser feito após o período de recuperação também.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a carga com microesferas, uma técnica econômica e simples para introduzir DNA, RNA, proteínas e partículas sintéticas em células aderentes de mamíferos vivas. A carga com microesferas interrompe temporariamente a membrana celular por meio de agitação mecânica, permitindo a entrega eficiente de macromoléculas para aplicações como imagem de células vivas e microscopia de fluorescência. O método é adaptável, causa estresse mínimo às células e adequado para diversas linhagens celulares.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Imagem em células vivas
- Microscopia de fluorescência
Antecedentes
- A introdução de macromoléculas exógenas em células vivas é desafiadora devido à impermeabilidade da membrana.
- Os métodos existentes frequentemente apresentam baixa eficiência, exigem equipamentos caros ou são tecnicamente complexos.
- A carga com microesferas oferece uma alternativa simples e econômica para a entrega de diversas moléculas nas células.
- Essa técnica é particularmente útil para experimentos de imagem em nível de célula única e molécula única.
Objetivo do Estudo
- Descrever um protocolo confiável e de baixo custo para o carregamento de células aderentes vivas de mamíferos com microesferas.
- Demonstrar a versatilidade do carregamento com microesferas para introduzir proteínas, DNA, RNA e partículas sintéticas.
- Avaliar o impacto do carregamento com microesferas na viabilidade celular e na morfologia.
Métodos Utilizados
- Preparação e esterilização de esferas de vidro utilizando lavagens com hidróxido de sódio e etanol.
- Montagem e esterilização de um aparato de carregamento de esferas com um filtro de malha.
- Aplicação de uma monocamada de esferas e batidas mecânicas para facilitar a disruptura da membrana e a entrada de macromoléculas.
- Otimização da força de batida e da quantidade de esferas para minimizar a desanexação celular e maximizar a eficiência de carregamento.
- Lavagem pós-carregamento, recuperação e imagem celular.
Resultados Principais
- A carga com microesferas introduziu com sucesso proteínas, DNA plasmidial e RNA em células U2OS, RPE1 e HeLa.
- A carga simultânea de múltiplas macromoléculas (por exemplo, proteínas e plasmídeos) foi alcançada com alta eficiência.
- 40% das células foram carregadas com proteína Fab, e 21% expressaram o plasmídeo carregado em conjunto.
- As células adequadamente carregadas com microesferas mantiveram morfologia, viabilidade e proliferação normais, com perda celular mínima.
- O excesso de microesferas ou força de impacto elevada levou à dessanexação celular e má morfologia.
Conclusões
- A carga com microesferas é um método rápido, econômico e eficaz para introduzir diversas macromoléculas em células aderentes vivas.
- A técnica é adaptável a diferentes linhagens celulares e necessidades experimentais.
- Quando otimizada, a carga com microesferas não afeta significativamente a saúde ou a proliferação celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A entrega intracelular eficiente de proteínas e ácidos nucleicos é um gargalo persistente na descoberta precoce e no desenvolvimento de ensaios, limitando a capacidade de investigar a biologia de células vivas com precisão. A técnica de carregamento com esferas oferece uma solução escalável e de baixo custo para introduzir diversas macromoléculas em células humanas aderentes, apoiando a imagem de alto conteúdo e estudos mecanicistas. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva nas etapas de validação de alvo e desenvolvimento de ensaios, permitindo uma avaliação robusta da função molecular em sistemas fisiologicamente relevantes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a introdução direta de proteínas, RNA e DNA funcionais para a investigação mecanicista de vias celulares.
- Auxilia na desmistificação biológica ao facilitar testes rápidos de hipóteses em contextos de células vivas.
- Melhora a confiança preditiva ao permitir estudos com entrega multiplexada e co-localização.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prepara sistemas de células vivas validados para ensaios downstream de alto conteúdo e baseados em fluorescência.
- Permite a entrega reprodutível e quantitativa de sondas e repórteres para padronização de ensaios.
- Facilita a configuração de ensaios escalonáveis e economicamente eficazes para triagem de compostos e análise fenotípica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Apóia o desenvolvimento de modelos relevantes para doenças ao permitir a introdução de biomoléculas exógenas em diversas linhagens celulares.
- Mantém a viabilidade e a morfologia celulares, assegurando continuidade translacional desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Reduz o risco de resultados artifatos ao minimizar o estresse celular e efeitos fora do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A carga de microesferas integra-se na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, conectando a validação de alvos e os fluxos de trabalho de triagem para aplicações com células vivas.
- Biologia de Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses e a análise de vias ao permitir a manipulação direta do conteúdo intracelular.
- Triagem: Fornece células prontas para ensaios com entrega consistente de sondas e variabilidade mínima.
- Análise: Fornece leituras quantitativas para comparar a captação molecular e a expressão em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Garante fidelidade ao modelo e apoia estudos de biomarcadores em sistemas de células vivas.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e adaptável para diversos tipos celulares e cargas moleculares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos com células vivas.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de entrega, melhora a reprodutibilidade e reduz os custos por experimento.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de prosseguir/não prosseguir e o avanço eficiente em termos de capital da carteira de projetos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer uma entrega robusta e escalável para programas em estágios iniciais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de células vivas e na otimização dos parâmetros de carregamento de microesferas para cada linhagem celular.
- Necessita de infraestrutura laboratorial básica para preparação, esterilização e análise de microesferas.
- Exige padronização entre equipes para garantir reprodutibilidade e minimizar a perda celular.
- Adaptável a modelos de células aderentes de mamíferos, com ajustes no protocolo conforme a sensibilidade celular.
- O controle cuidadoso da quantidade de microesferas e da força de impacto é essencial para evitar a dessanexação e o estresse celular.
