Detecção direta de isolevuvolinas em tecidos usando uma proteína de fusão D11 scFv-fosfatase alcalina e imunofluorescência

As isolevuvolinas têm sido implicadas em várias doenças, particularmente nas cardiovasculares. Este protocolo foi desenvolvido para detectar isolevuglandinas em tecidos com proteína de fusão fosfatase alcalina D11 e imunofluorescência. Os métodos atuais de detecção são caros ou requerem um anticorpo secundário para um E-tag.

Encontrar um anticorpo secundário confiável é difícil, mas esse protocolo remove a etapa de anticorpos secundários. Mergulhe as lâminas de tecidos de camundongos e humanos embebidos em parafina em xileno três vezes por cinco minutos para deparrafinizar os tecidos. Para a reidratação do tecido, lavar os tecidos duas vezes com etanol 95%, seguidas de duas lavagens com etanol 70% e duas vezes com etanol 50% preparado em água.

Lave as lâminas em solução salina tamponada com 0,1% Tween 20 três vezes, preenchendo o suporte de lâmina com TBST. Em seguida, descarte o TBST. Colocar as lâminas em tampão citrato de sódio pré-aquecido e incubar em panela de pressão regulada para quatro minutos em alta pressão, para um tempo total de recuperação do antígeno de 20 minutos.

Ao final da incubação, retire as lâminas da panela de pressão e deixe esfriar por 20 minutos em temperatura ambiente. Dê três lavagens rápidas aos slides com TBST como demonstrado. Bloqueie os slides adicionando 2% BSA dissolvido em TBST.

Cubra as lâminas com fita parafínica e incube à temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, descarte o buffer de bloqueio. Adicione 200 microlitros de fosfatase alcalina D11 preparada em TBST às lâminas e cubra as lâminas com fita parafina.

Após incubar as lâminas em câmara umidificada por três horas à temperatura ambiente, lavá-las três vezes com TBST. Desenvolver as lâminas com um revelador calorimétrico de fosfatase alcalina para imunohistoquímica, ou um revelador de fosfatase alcalina fluorescente para imunofluorescência. Lave as lâminas uma vez com TBST para remover o revelador em excesso e evitar o desenvolvimento de cores.

Contramanchar as lâminas com um micrograma por mililitro de coloração nuclear HEX preparada em PBS para imunofluorescência. Em seguida, lave as lâminas uma vez com TBST para remover qualquer excesso de mancha. Use o meio de montagem para colocar a tampa nas corrediças desenvolvidas.

Observe as lâminas em microscópio de luz invertida para imunohistoquímica ou em microscópio confocal fluorescente para imunofluorescência. Quatro experimentos de controle negativo podem ser realizados para confirmar a especificidade da coloração D11 AP para isolevuvignina. No primeiro experimento de controle negativo, incubar os tecidos com D11 AP diluído em TBST, ou TBST sozinho.

Em seguida, incubar os tecidos com D11 AP diluído e extrato pariplasmático bacteriano diluído em TBST sem o ligante D11 AP. Para o ensaio competitivo, preparar isoLG e isoLG aduzidos à albumina sérica de camundongos em uma razão molar de oito para um. Diluir D11 AP de um a 10 em TBST.

Em seguida, incubar o D11 AP diluído com 50 microgramas por mililitro de MSA aduzida por isolevuvignina, ou MSA não aduzida por uma hora à temperatura ambiente. Adicionar D11 AP com isolevuglandina MSA ou D11 AP com MSA não aduzida aos tecidos para coloração. Use um anticorpo variável de fragmento de cadeia única D20 relevante para corar os tecidos para o conjunto de controle negativo final.

A imunofluorescência da aorta em camundongos hipertensos e normotensos foi estudada usando este protocolo. A coloração com D11 AP indicou um aumento da concentração de isoLGs na aorta de camundongos com hipertensão induzida por angiotensina II em comparação com os camundongos controle. O D11 AP foi utilizado para detectar as isolevuglandinas presentes nos tecidos intestinais de pacientes humanos hipertensos e humanos normotensos.

Os tecidos dos pacientes com hipertensão apresentaram concentrações elevadas de isolevuvolinas. Os tecidos foram corados com extrato pariplasmático e sem D11 AP. A coloração mais brilhante foi observada no tecido corado com D11 AP em relação ao tecido corado com extrato pariplasmático, confirmando que a coloração não foi devida à fosfatase alcalina bacteriana não conjugada presente no extrato pariplasmático. No ensaio competitivo, o tecido corado com D11 AP pré-incubado com o competidor isoLG apresentou coloração diminuída, semelhante à coloração observada em tecidos com D11 AP, que mostra especificidade para D11 AP para isolevuglandinas.

No controle negativo, a coloração da aorta de camundongos com D11 AP resultou em forte coloração em relação a D20, indicando a especificidade de D11 AP para isolevuglandinas na aorta hipertensiva. É importante inativar qualquer fosfatase alcalina endógena presente no tecido para limitar a coloração de fundo.