Name: Um Método Não Invasivo para Gerar o Modelo de Lesão da Cartilagem Intra-Articular Induzida por Carga Cíclica do Joelho de Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 4 s
Description: Aprenda a criar lesões de cartilagem intra-articular em joelhos de ratos usando carga cíclica não invasiva de 20 N. Este método reprodutível permite estudar danos mecânicos sem intervenção cirúrgica.

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Este estudo foi apoiado em parte por uma bolsa JSPS KAKENHI (números JP18H03129 e JP18K19739). Esta pesquisa também recebeu financiamento da Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), que é apoiada pelo Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) e National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de Prêmio P2CHD086843. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Kyoto (número de aprovação: Med kyo 17616).
1. Realizar compressão cíclica in vivo no joelho do rato
<ol><li>Induzir anestesia experimental em animais<ol><li>Induzir anestesia em um rato Wistar de 12 semanas de idade (256,8 ± 8,7 g) por inalação de solução de isoflurano a 5% na caixa de anestesia.</li>
		<li>Injetar por via intraperitoneal uma mistura de três agentes anestésicos9, incluindo medetomidina, midazolam e butorfanol, a 2 mg/kg do peso corporal do rato, e raspar a área ao redor da articulação do joelho direito. Confirme anestesia suficiente por falta de reflexo do pedal para uma beliscão do dedo do pé.</li>
	</ol></li>
	<li>Monte o rato anestesiado no dispositivo de fixação.<ol><li>Colocar o rato anestesiado deitado de barriga para baixo sobre a placa de base (Figura 1), com o joelho direito preso a um pequeno pedaço de resina com sulco côncavo. Coloque o membro posterior direito nas posições de extensão do quadril, flexão do joelho e extensão do tornozelo, com o joelho flexionado a aproximadamente 140°. Acomodem o calcanhar do rato no sulco em forma de cunha no acessório móvel.</li>
		<li>Mova o dispositivo de fixação para o instrumento de ensaio de tensão/tração (consulte o Quadro de Materiais). Depois de garantir que não há contatos com a célula de carga, abra o software de controle do instrumento de teste de tensão/tração (Tabela de Materiais) e clique no botão Calibração . Após a calibração, prenda a parte superior do quadro à célula de carga com cuidado. Para manter a articulação do joelho intimamente ligada ao quadro, ligue o botão rotativo no painel operacional principal móvel lentamente até que a pré-carga atinja 5 N.</li>
	</ol></li>
	<li>Crie um método de carregamento e configure o teste de compressão.<ol><li>No menu Principal, clique em Criar um novo método | Rótulo do sistema . Defina Modo de teste como Ciclo e Tipo de teste como Compactação. Clique na etiqueta Sensor e selecione a guia Teste para verificar se o limite está dentro de 60 N. Além disso, selecione a guia Traçado e verifique se o limite está dentro de 500 mm. NOTA: A etapa acima interromperá a operação imediatamente se houver um grande deslocamento no ponto de tensão.</li>
		<li>No rótulo Controle de teste, selecione Origem do crescimento para iniciar o programa principal com 0,3%/escala completa. Das quatro seções em um ciclo de carregamento, defina a velocidade de curso no controle na 1ª e3ª seções para 1 mm / s. Defina a Força máxima de teste na 2ª seção como 20 N e a Força mínima de teste na4ª seção como 5 N. Defina "a Duração da suspensão" como 0,5 s para a carga de pico e 10 s para a carga mínima (Figura 2). NOTA: Como esta etapa define cada ciclo, certifique-se de que as superfícies articulares estão em contato umas com as outras e estão se movendo a uma velocidade razoável e que o movimento é mantido.</li>
		<li>Na guia Pré-carregamento na parte inferior da página, verifique se Ativado está marcado, a Velocidade de remoção de deflexão está definida como 100 mm/min e a força máxima é de 5 N. No rótulo Espécime , defina o Material como Metal. Observação : essas configurações detalhadas podem ser específicas para cada fabricante.</li>
		<li>No menu Principal, na seção Selecionar método e teste, selecione o método que acabou de ser criado e clique em Iniciar para iniciar o teste. NOTA: A tabela na parte inferior mostra as medidas reais da carga de pico e do deslocamento.</li>
		<li>Defina o número de ciclos como 60. NOTA: Toda a sessão de carregamento inclui 60 ciclos, que dura aproximadamente 12 minutos. No grupo controle, os ratos foram submetidos a pré-carga de 5 N por 12 min de pré-carga nas mesmas condições.</li>
	</ol></li>
	<li>Após o carregamento, devolva o rato à sua gaiola e monitore até a recuperação completa. Mantenha um horário claro-escuro de 12-12 h na gaiola com espaço suficiente e comida ad libitum. Após os períodos experimentais necessários, sacrificar os ratos com uma overdose da mistura dos três agentes anestésicos injetados por via intraperitoneal ou inalação de dióxido de carbono para análise (1 h-8 semanas).</li>
</ol>

<ol><li>De Souza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+axial+loading+of+mouse+tibiae+increases+cortical+bone+formation+and+modifies+trabecular+organization%3A+a+new+model+to+study+cortical+and+cancellous+compartments+in+a+single+loaded+element%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element.</a> Bone. 37 (6), 810-818 (2005).</li>
<li>Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+a+novel+and+adjustable+noninvasive+murine+joint+loading+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).</li>
<li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+response+of+mouse+joint+tissue+to+noninvasive+knee+injury+suggests+treatment+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets.</a> Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).</li>
<li>Poulet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+applied+mechanical+loading+induces+subchondral+bone+thickening+that+may+be+intensified+locally+by+contiguous+articular+cartilage+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).</li>
<li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+cell-mediated+changes+in+articular+cartilage+and+bone+in+mice+are+initiated+by+a+single+session+of+controlled+cyclic+compressive+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).</li>
<li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+subchondral+bone+properties+and+changes+in+development+of+load-induced+osteoarthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice.</a> Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).</li>
<li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cyclic+compression+causes+cartilage+degeneration+and+subchondral+bone+changes+in+mouse+tibiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae.</a> Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+cyclic+compressive+loading+on+the+distribution+of+local+Col2+and+superficial+lubricin+in+rat+knee+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).</li>
<li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li>
<li>Iijima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+medial+meniscus+leads+to+subchondral+bone+defects+and+site-specific+cartilage+degeneration+in+an+experimental+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model.</a> Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Pela primeira vez, o presente protocolo mostra como estabelecer um modelo de lesão cartilaginosa induzida por carga no côndilo femoral lateral em ratos, semelhante ao modelo de dano intra-articular em roedores menores, como o camundongo2. No entanto, o protocolo de carga em camundongos causou grave formação de osteófitos e lesões do ligamento cruzado, o que não foi ideal para avaliar os efeitos da compressão cíclica. O protocolo atual criou uma lesão focal da cartilagem em ratos com uma força de c...

Tradicionalmente, a transecção do ligamento cruzado anterior (LCA) ou a desestabilização do menisco medial tem sido considerada ideal para investigar a osteoartrite pós-traumática (POTP) em pequenos animais. Nos últimos anos, modelos de compressão cíclica não invasiva têm sido usados para estudar a POTP. Este modelo foi originalmente desenhado para investigar a resposta óssea esponjosa à carga mecânica1 e, em seguida, foi modificado como um modelo animal não cirúrgico para estudos de OTP 2,3,4,5,6. A lógica é colidir a cartilagem articular aplicando uma força externa periódica, que desencadeia uma série de respostas inflamatórias. No entanto, este modelo só foi aplicado a camundongos, e a magnitude apropriada da carga em animais maiores não foi discutida.
Outro problema com o modelo anterior é que o protocolo de alto volume incluiu muitos ciclos, o que causou espessamento excessivo do osso subcondral, um efeito colateral indesejado, em várias amostras7. Portanto, um novo método de compressão cíclica com a magnitude apropriada para animais de grande porte e um efeito colateral de menor carga foi desenvolvido8. O objetivo geral do presente artigo é descrever o protocolo do modelo de compressão cíclica não invasiva em ratos e observar os resultados representativos da degeneração da cartilagem. O protocolo atual ajudaria os leitores interessados na aplicação do modelo de compressão cíclica não invasiva em ratos.

<table><tbody><tr><td>Aparelho anestésico para pequenos animais</td><td>SHINANO MFG CO.,LTD.</td><td>SN-487-0T</td><td></td></tr><tr><td>Autógrafo AG-X</td><td>Shimadzu Corp</td><td>N.A.</td><td>Testador de precisão universal / elástico</td></tr><tr><td>Microscópio Fluoview FV10i</td><td>Olympus Corp</td><td>N.A.</td><td>Um microscópio confocal de varredura a laser totalmente automatizado</td></tr><tr><td>Solução para inalação de ISOFLURANO</td><td>Pfizer Japan Inc.</td><td>(01)14987114133400</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidade/Citotoxicidade LIVE/DEA</td><td>Thermo Fisher Scientific Japan Inc</td><td>L3224</td><td>Um ensaio rápido e fácil de duas cores para determinar a viabilidade das células</td></tr><tr><td>TRAPEZIUM X Software</td><td>Shimadzu Corp</td><td>N.A.</td><td>Software de processamento de dados para Autograph AG-X</td></tr></tbody></table>

um método não invasivo para gerar o modelo de lesão da cartilagem intra-articular induzida por carga cíclica do joelho de rato

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

A fisiopatologia da osteoartrite primária (OA) permanece obscura. No entanto, uma subclassificação específica da OA em grupos etários relativamente mais jovens provavelmente está correlacionada com uma história de dano da cartilagem articular e avulsão ligamentar. Modelos animais cirúrgicos de OA do joelho desempenham um papel importante na compreensão do início e progressão da OA pós-traumática e auxiliam no desenvolvimento de novas terapias para esta doença. No entanto, modelos não cirúrgicos têm sido recentemente considerados para evitar inflamações traumáticas que poderiam afetar a avaliação da intervenção. 
Neste estudo, foi desenvolvido um modelo de lesão de cartilagem intra-articular induzido por carga compressiva cíclica in vivo , o que permitiu aos pesquisadores (1) determinar a magnitude, velocidade e duração ideais da carga que poderia causar danos focais à cartilagem; (2) avaliar alterações patológicas espaço-temporais pós-traumáticas na vitalidade dos condrócitos; e (3) avaliar a expressão histológica de moléculas destrutivas ou protetoras envolvidas nos mecanismos de adaptação e reparo contra cargas compressivas articulares. Este relato descreve o protocolo experimental para esta nova lesão cartilaginosa em um modelo de rato.

Obteve-se um resultado representativo das mudanças de curto prazo (1 h e 12 h) na viabilidade do condrócitos em amostras submetidas à carga cíclica de 20 N. Como mostra a Figura 3, o número de condrócitos mortos (fluorescência vermelha) aumentou às 12 h pós-trauma. Por outro lado, o número de condrócitos vivos (fluorescência verde) continuou a diminuir, com algumas amostras não contendo condrócitos vivos na área afetada.
A histologia mostrou que a cartilagem artic...

Aqui, apresentamos o modelo de lesão da cartilagem intra-articular induzida por carga cíclica do joelho de rato, gerado por 60 compressões cíclicas acima de 20 N, resultando em danos à cartilagem condilar femoral em ratos.

Um Método Não Invasivo para Gerar o Modelo de Lesão da Cartilagem Intra-Articular Induzida por Carga Cíclica do Joelho de Rato

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

Este protocolo mostra que é possível causar danos na cartilagem em animais, animais maiores, sem qualquer intervenção cirúrgica ou destruição estruturada do joelho animal. A maior vantagem é que o demonstra ser repetitivo em operadores mesmo sem experiência, o que é difícil de conseguir com qualquer método cirúrgico. Comece montando o rato anestesiado no dispositivo de fixação.Coloque o rato anestesiado deitado de barriga para baixo na placa de base com o joelho direito preso a um pequeno pedaço de resina com um sulco côncavo. Coloque o membro posterior direito nas posições de extensão do quadril, flexão do joelho e extensão do tornozelo com o joelho flexionado a aproximadamente 140 graus. Acomodem o calcanhar do rato no sulco em forma de cunha no acessório móvel.Mova o dispositivo de fixação para o instrumento de ensaio de tensão e tração e certifique-se de que não há contacto com a célula de carga. Abra o software de controle do instrumento de teste de tensão e tração e clique no botão de calibração. Após a calibração, prenda cuidadosamente a parte superior do quadro à célula de carga.Ligue o botão rotativo no painel operacional principal móvel lentamente até que a pré-carga atinja cinco Newtons para manter a articulação do joelho intimamente ligada ao quadro. No menu principal, clique em criar um novo método e rótulo do sistema. Defina o modo de teste como ciclo e o tipo de teste como compactação.Clique na etiqueta do sensor e selecione a guia de teste para verificar se o limite está dentro de 60 Newtons. Em seguida, selecione a guia traçado e verifique se o limite está dentro de 500 milímetros. Sob o rótulo de controle de teste, selecione a origem do crescimento para iniciar o programa principal com 0,3% ou escala total.Defina a velocidade de curso no controle na primeira e terceira seções para um milímetro por segundo e, em seguida, defina a força máxima de teste na segunda seção para 20 Newtons e a força mínima de teste na quarta seção para cinco Newtons. Defina a duração de todo para 0,5 segundos para a carga de pico e 10 segundos para a carga mínima. Na guia de pré-carregamento na parte inferior da página, verifique se on está marcado, a velocidade de remoção de deflexão é definida como 100 milímetros por minuto e a força máxima é de cinco Newtons.Defina o material como metal no rótulo do espécime. No menu principal, na seção Selecionar método e teste, selecione o método que acabou de ser construído e clique em Iniciar para iniciar o teste. Defina o número de ciclos como 60.Devolva o rato à sua gaiola após o carregamento e mantenha um horário escuro claro de 12-12 horas em uma gaiola com espaço suficiente e comida ad libitum até que seja hora de análise. Foram estudadas as mudanças de curto prazo na viabilidade dos condrócitos em amostras submetidas a 20 Newtons de carga cíclica. O número de condrócitos mortos aumentou às 12 horas após o trauma.Por outro lado, o número de condrócitos vivos continuou a diminuir. A cartilagem articular dos joelhos de ratos submetidos a 20 Newtons de carga dinâmica foi danificada e uma zona de lesão focal foi confirmada no côndilo femoral lateral em todas as amostras. O tamanho da lesão não aumentou progressivamente durante o período observacional de oito semanas.A borda correspondente à interface da lesão e da cartilagem não afetada pôde ser observada na área afetada. O mais importante são as configurações adequadas da força de teste e o número de ciclos. Com esta técnica, pode-se controlar a carga mecânica para a cobertura articular do sangue, abrindo caminho para explorar como a carga mecânica afeta o desenvolvimento ou a prevenção da osteoartrite.

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Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

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Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

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