Ensaio in vitro de alta produtividade usando organoides tumorais derivados do paciente

Organoides tumorais derivados do paciente recapitulam a arquitetura e a função do tecido tumoral com precisão com melhor reprodutibilidade da doença. Portanto, a resposta do paciente aos medicamentos anticâncológicos pode ser avaliada com precisão usando este modelo. Organoides tumorais são inadequados para um sistema de ensaio de alto rendimento in vitro ou análise celular devido à formação de grandes aglomerados na cultura.

Utilizando-se esta técnica, foi desenvolvido HTS simples e mais preciso para avaliação de medicamentos moleculares direcionados. Como a cultura organoide é muito diferente da cultura 2D, pode-se sentir confuso sobre a cultura no início, mas é importante observar cuidadosamente as mudanças morfológicas dos organoides. Depois de remover o vil congelado do armazenamento de nitrogênio líquido, agitar suavemente os organoides tumorais derivados do paciente em um banho de água a 37 graus Celsius por um minuto.

Retire o vil do banho d'água e limpe com 70% de etanol. Em seguida, coloque o frasco no armário de biossegurança. Transfira os organoides tumorais em um tubo de 15 mililitros contendo o meio para organoides.

Use uma pipeta de transferência de três mililitros para misturar suavemente os organoides tumorais e médios, pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Pelota para baixo os organoides tumorais por centrifugação. Descarte o supernasal e resuspenque a pelota organoide tumoral em cinco mililitros de meio fresco.

Transfira a suspensão organoide tumoral em um frasco T25 e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após uma semana da primeira passagem, transfira a suspensão organoide tumoral de dois frascos T25 em dois tubos de centrífugas e pelota para baixo os organoides tumorais por centrifugação. Estime o volume de pelotas organoides tumorais e resuspense a pelota em 2,5 mililitros de meio fresco por tubo.

Acumule a suspensão organoide tumoral em um tubo. Transfira a suspensão agrupada em um frasco T75 contendo 10 mililitros de meio fresco e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas de mudança média, pique os organoides tumorais usando um instrumento de fragmentação e dispersão celular equipado com um suporte de filtro contendo um filtro de malha de 70 micrômetros.

Diluir 15 mililitros de suspensão organoide tumoral 10 vezes. Use o dispensador de suspensão celular para semear 40 microliters de suspensão organoide tumoral diluída em uma microplacão esferoide de 384 poços ultra baixo. Após 24 horas, use um manipulador líquido para adicionar 0,04 microliters de soluções de agente de teste de 10 diluições seriais em faixas de concentração final de 20 micromolar a 1,0 nanomolar nos poços, e incubar a placa por seis dias.

No final da incubação, adicione reagente de medição ATP intracelular nos poços de teste. Use uma batedeira para misturar o conteúdo da placa e incubar a placa por 10 minutos a aproximadamente 25 graus Celsius. Use um leitor de placas para medir o conteúdo ATP intracelular como luminescência.

Após 24 horas da terceira passagem, coloque uma microplacar esferoide de 384 poços ultra baixos com 40 microliters de médio por bem como uma placa de destino no sistema de captação e imagem celular. Construa a câmara de colheita com seis mililitros de cultura média e centrífuga a 1.500 vezes G por dois minutos para remover as bolhas de ar. Adicione quatro microliters de suspensão organoide tumoral na câmara de colheita, e coloque a câmara de colheita no sistema.

Permita que os aglomerados celulares se instalem no fundo da câmara por um minuto após a dispersão e, em seguida, inicie a varredura da câmara. Ajuste o tamanho da colheita para 140 a 160 micrômetros no sistema para seleção automática de clusters celulares. Em seguida, verifique a qualidade dos clusters celulares selecionados nas imagens digitalizadas e transfira 10 clusters de células por poço usando dicas de colheita na placa de destino.

No presente estudo, foi avaliado o efeito dos agentes anticâncológicos no organoide tumoral derivado do paciente. A alta sensibilidade para todos os agentes anticancerígenos foi indicada pela concentração inibitória meia maximal inferior a dois micromolars na área abaixo dos valores de curva inferiores a 282. Para uma avaliação de citotoxicidade celular dependente de anticorpos, foi medida uma citolise percentual de organoides tumorais na presença de dois anticorpos diferentes.

A citolise percentual aumentou com o tempo. Sem os anticorpos em seis horas com a razão celular do efeito para a célula-alvo de um para um, a citolise atingiu 45% Enquanto na proporção de dois para um, a citolise atingiu 70% A citolise mediada por células assassinas naturais usando trastuzumabe era de aproximadamente 60% na relação efeitoor para célula-alvo de um para um, e 80% na proporção de dois para um em seis horas. Em contraste, cetuximabe teve um impacto dependente da dose na citolise mediada da célula assassina natural.

Na maior concentração de cetuximabe, observou-se 90% de citolise no efeito para a razão celular-alvo de um para um, e 100% citolise foi observada na razão de dois para um, indicando alta effecttividade do cetuximabe. Um sistema de ensaio de alto rendimento usando organoides tumorais derivados do paciente é superior à avaliação de potenciais agentes anticâncológicos e apresenta oportunidades de avaliação de medicamentos e avanços na medicina personalizada.