Name: Captura assistida por resina juntamente com marcação de massa em tandem isobárica para quantificação multiplexada da oxidação de proteína tiol (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a identificar e quantificar resíduos de cisteína oxidados em proteínas usando captura assistida por resina e marcação isobárica em tandem. Este método de espectrometria de massas fornece dados quantitativos específicos de sítio para estudos de proteômica redox.

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Partes do trabalho foram apoiadas pelo NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 e U24 DK112349

Todos os procedimentos descritos no protocolo relacionados a amostras/tecidos animais ou humanos foram aprovados e seguiram as diretrizes institucionais do comitê de ética em pesquisa com seres humanos e animais.
1. Homogeneização/lise da amostra
<ol><li>Amostras de tecido congelado<ol><li>Carne de tecido congelado picado (~ 30 mg) em uma lâmina de microscópio de vidro em gelo seco usando uma lâmina de barbear pré-resfriada e pinças. Transferir o tecido picado para um tubo de poliestireno de fundo redondo pré-refrigerado de 5 ml contendo 700 μL de tampão A (ver Tabela 1) e incubar no gelo durante 30 minutos, protegido da luz.</li>
		<li>Interrompa o tecido por 30 s ou até homogeneizar completamente com um homogeneizador de tecido portátil. Coloque as amostras no gelo e deixe a espuma diminuir por mais 10 minutos. NOTA: Uma assadeira de alumínio colocada em gelo seco fornece uma superfície de trabalho estável e uma plataforma para o processamento inicial / picagem do tecido.</li>
	</ol></li>
	<li>Alternativamente, use culturas de células aderentes em placas de cultura de 100 mm como material de partida.<ol><li>Mantenha as células no gelo e use uma pipeta sorológica para enxaguar as células duas vezes com 10 mL de PBS gelado contendo 100 mM NEM.</li>
		<li>Lise as células adicionando 1 mL de tampão de homogeneização/lise a frio e raspando vigorosamente com um raspador de células rígidas. Transfira o lisado para um tubo de centrífuga de 2 mL usando uma micropipeta. NOTA: O tampão de enxágue e o tampão de lise podem ser dimensionados de acordo com vasos de cultura de tamanhos diferentes. Normalmente, 2-5 milhões de células são necessárias; no entanto, isso varia dependendo da eficiência de lise e do rendimento de proteínas para tipos específicos de células. O tampão de homogeneização pode ser preparado sem NEM para amostras que estão sendo analisadas para tióis totais.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferir o homogeneizado resultante (passo 1.1.2 ou 1.2.2) para um tubo de centrifugação de 2 ml utilizando uma micropipeta e centrifugar a toda a velocidade (≥16 000 × g) a 4 °C durante 10 minutos.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante (~700 μL ou ~1 mL para cultura celular) usando uma micropipeta para um tubo de microcentrífuga cônica de 5 mL e incubar por 30 min a 55 °C no escuro com agitação a 850 rpm.</li>
	<li>Usando uma pipeta sorológica de vidro, adicionar 4 mL de acetona gelada às amostras e incubar a -20 °C durante a noite para precipitação de proteína e remoção do excesso de N-etilmaleimida.</li>
</ol>2. Captura assistida por resina
<ol><li>Lavar os pellets de proteína precipitada duas vezes com acetona centrifugando a 20.500 g × a 4 °C durante 10 minutos, decantando a acetona, removendo qualquer acetona restante utilizando uma micropipeta e adicionando 3 ml de acetona fresca e gelada utilizando uma pipeta serológica de vidro. Inverta várias vezes para misturar. Após a segunda lavagem, deixe os pellets secarem ao ar por 1-2 min, tomando cuidado para não secar demais, pois a ressuspensão pode se tornar difícil.</li>
	<li>Usando uma micropipeta, adicione 1 mL de tampão B (ver Tabela 1) e solubilize a proteína usando sonicação repetida por 15-30 s de cada vez usando um sonicator de banho com uma saída de 250 W e breve vórtice. Meça a concentração de proteína usando o ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Para padronizar as concentrações de proteína entre as amostras para processamento posterior e garantir a remoção completa do NEM, transfira 500 μg de proteína para um filtro centrífugo de 0,5 mL 10 kDa usando uma micropipeta e ajuste para um volume final de 500 μL com tampão de ressuspensão.</li>
	<li>Centrifugar a 14.000 × g à temperatura ambiente até que o volume no filtro centrífugo seja inferior a 100 μL. Recolher as amostras invertendo o filtro num tubo de recolha. Centrifugar a 1 000 × g durante 2 min e ajustar para um volume final de 500 μL utilizando o tampão C (ver quadro 1).</li>
	<li>Reduzir os tióis proteicos adicionando 20 μL de ditiotreitol (TDT) a 500 mM utilizando uma micropipeta até uma concentração final de 20 mM e incubando as amostras durante 30 min a 37 °C enquanto agita a 850 rpm.</li>
	<li>Após redução, transferir as amostras utilizando uma micropipeta para filtros centrífugos de 0,5 ml 10 kDa e centrífuga durante 15 minutos a 14.000 × g à temperatura ambiente ou até que o volume no filtro centrífugo seja inferior a 100 μL. Adicionar tampão D (ver Tabela 1) para compor o volume no filtro centrífugo a 500 μL.<ol><li>Repetir a centrifugação e a adição a 500 μL na etapa 2.6 três vezes e, após a quarta centrifugação, coletar as amostras invertendo o filtro em um tubo de coleta e centrifugando a 1.000 × g por 2 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Meça a concentração de proteína usando o ensaio de BCA de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Durante esta troca tampão, prepare a resina de afinidade tiol pesando a quantidade apropriada de resina (30 mg/amostra) usando uma microbalança e transferindo-a para um tubo de centrífuga de 50 mL. Em seguida, utilizando uma pipeta sorológica, adicionar água para uma concentração final de 30 mg/mL de resina e incubar à temperatura ambiente por 1 h com agitação para hidratação adequada da resina. NOTA: A resina de afinidade de tiol mencionada acima foi descontinuada pelo fabricante. Um possível substituto para esta resina de afinidade de tiol está comercialmente disponível. No entanto, essa substituição tem uma capacidade de ligação quase 5 vezes menor (consulte Informações suplementares). Alternativamente, a resina de afinidade tiol pode ser sintetizada usando cloridrato de etilamina 2-(pirindiltio) e resina ativada por N-hidroxisuccinimida (ver Informações Suplementares).<ol><li>Após a hidratação da resina, colocar as colunas de rotação num colector de vácuo e transferir 500 μL da pasta de resina utilizando uma micropipeta para cada coluna. Aplicar vácuo para remoção de água; repita esta etapa uma vez para obter um total de 30 mg de resina por coluna. Alternativamente, centrifugar a 1.000 × g por 2 minutos em vez de usar o coletor de vácuo para esta e todas as etapas de lavagem e eluição de resina. NOTA: Cortar a extremidade de uma ponta de pipeta de 1000 μL para aumentar o tamanho do furo ajuda na transferência da resina. É importante triturar entre a pipetagem para garantir que a resina permaneça suspensa e quantidades homogêneas e iguais de resina sejam transferidas para cada coluna.</li>
		<li>Lave a resina adicionando 500 μL de água ultrapura com uma micropipeta e aplicando vácuo para remoção da água; repita isso 5 vezes. Em seguida, lavar a resina 5 vezes com 500 μL de tampão E (ver Tabela 1). NOTA: Em alternativa, a centrifugação a 1.000 x g durante 2 minutos pode ser utilizada no lugar de um colector de vácuo para todas as etapas de lavagem subsequentes. Todas as etapas de lavagem são realizadas com um volume de 500 μL. Ao adicionar amortecedores de lavagem à coluna, adicione cuidadosamente com força suficiente para ressuspender totalmente a resina, evitando salpicos e perda de resina; isso permite a lavagem completa e eficiente da resina.</li>
	</ol></li>
	<li>Usando uma micropipeta, transferir 150 μg de proteína de cada amostra reduzida para um novo tubo e ajustar para um volume final de 120 μL de tampão C (ver Tabela 1). Transfira a solução proteica usando uma micropipeta para uma coluna de rotação entupida contendo a resina, coloque a tampa na coluna e incube por 2 h à temperatura ambiente com agitação a 850 rpm.</li>
	<li>Lave a resina cinco vezes com HEPES 25 mM, pH 7,0; 8 M de ureia; seguido por cinco vezes com 2 M NaCl; seguido por cinco vezes com acetonitrila (ACN) a 80% com ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%; e, finalmente, cinco vezes com 25 mM HEPES, pH 7,7, conforme descrito na etapa 2.8.2 e substitua o plugue. NOTA: As amostras podem ser aqui eluídas para análise ao nível de proteínas (por exemplo, electroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), western blot), conforme descrito no passo 4.1.</li>
</ol>3. Digestão tríptica em resina e rotulagem TMT
<ol><li>Preparar uma solução de tripsina modificada de grau sequencial suficiente para 6-8 μg por amostra, solubilizando-a a uma concentração de 0,5 μg/μL no tampão C (ver quadro 1), de modo a que o volume final permita pelo menos 120 μL por amostra. Com uma micropipeta, adicionar 120 μL desta solução de tripsina às amostras e incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 850 rpm. NOTA: Para aumentar a eficiência da digestão, uma etapa adicional de digestão pode ser incluída no dia seguinte, removendo a solução de tripsina e substituindo-a por solução fresca, e continue a digestão por 2 h.</li>
	<li>Lave a resina cinco vezes com HEPES 25 mM, pH 7,0; seguido por cinco vezes 2 M NaCl; seguido por cinco vezes com 80% de ACN com 0,1% de TFA; seguido por três vezes com HEPES de 25 mM, pH 7,7. Finalmente, lave a resina duas vezes com tampão de bicarbonato de trietil amónio (TEAB) de 50 mM e substitua a tampão.</li>
	<li>Prepare os reagentes de rotulagem TMT, primeiro permitindo que eles se aqueçam à temperatura ambiente antes de girar brevemente usando uma centrífuga a 16.000 × g. Adicionar 150 μL de ACN anidro a cada frasco para injetáveis de reagente de marcação TMT utilizando uma micropipeta. Incubar os frascos para injetáveis à temperatura ambiente numa terminadora regulada para 850 rpm durante 5 minutos para solubilizar completamente o reagente. Brevemente vórtice e gire para baixo a 16.000 × g para coletar o reagente.</li>
	<li>Usando uma micropipeta, adicionar 40 μL de 100 mM TEAB à resina lavada, em seguida, adicionar 70 μL do reagente TMT dissolvido e incubar por 1 h à temperatura ambiente com agitação a 850 rpm. Conservar qualquer reagente TMT restante a -80 °C. NOTA: Tome nota dos rótulos TMT individuais atribuídos a cada amostra biológica (Figura 1).</li>
	<li>Lave a resina cinco vezes com 80% de ACN com 0,1% de TFA, três vezes com tampão de bicarbonato de amônio (ABC) de 100 mM, pH 8,0 e duas vezes com água conforme descrito anteriormente e substitua o plugue.</li>
</ol>4. Eluição peptídica
<ol><li>Elimine os péptidos marcados adicionando 100 μL de TDT de 20 mM em ABC de 100 mM, pH 8,0, a cada coluna utilizando uma micropipeta e incubar à temperatura ambiente durante 30 min numa terminadora regulada para 850 rpm. NOTA: Após a adição de TDT, a resina irá se aglomerar. A resina pode ser interrompida com uma ponta de pipeta para quebrar aglomerados e garantir a eluição completa dos peptídeos.</li>
	<li>Após essa incubação, coloque a coluna em um coletor de vácuo destinado à extração em fase sólida (SPE), aplique vácuo e elua as amostras em um tubo de microcentrífuga de 5 mL. Repita esta etapa uma vez.</li>
	<li>Finalmente, adicione 100 μL de 80% de ACN com 0,1% de TFA, incube por 10 min à temperatura ambiente e elua no mesmo tubo de centrífuga de 5 mL. Coletar todas as frações no mesmo tubo de microcentrífuga de 5 mL. NOTA: Para evitar a perda de amostra, tubos de baixa ligação devem ser usados para eluição e os volumes devem ser mantidos em ou abaixo de um volume de 4,0 mL para um único tubo de 5 mL.</li>
	<li>Colocar as amostras eluídas num concentrador de vácuo até secar. Conservar os péptidos secos a -80 °C e ressuscitá-los mais tarde. NOTA: As amostras também podem ser eluídas separadamente, e uma alíquota pode ser removida e analisada pelo SDS-PAGE para análise no nível do peptídeo antes de combinar as amostras.</li>
</ol>5. Alquilação peptídica e dessalinização/limpeza
<ol><li>Ressuspeite os peptídeos secos adicionando um pequeno volume de tampão ABC de 100 mM, pH 8,0 (não superior a 500 μL), usando uma micropipeta. Use sonicação repetida por 15-30 s de cada vez usando um sonicator de banho com uma saída de 250 W e vórtice para solubilizar e transferir para um tubo de 2 mL. NOTA: O volume de 100 mM ABC, pH 8,0 a adicionar baseia-se no volume necessário para ressuspender a TDT a uma molaridade de 150 mM. Os utilizadores terão de determinar a quantidade de TDT presente na sua amostra com base no que foi adicionado originalmente no passo 4.1.</li>
	<li>Adicionar uma solução-mãe concentrada suficiente (600 mM) de iodoacetamida (IAA) dissolvida em ABC utilizando uma micropipeta para obter uma relação molar de 1:4 de TDT:IAA e incubar as amostras a RT durante 1 h com agitação a 850 rpm.</li>
	<li>Acidificar as amostras a pH < 3 adicionando TFA concentrado (10%) usando uma micropipeta e realizar a dessalinização da amostra usando a limpeza de fase reversa de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Coloque os péptidos limpos num concentrador de vácuo até secar. Conservar os péptidos secos a -80 °C até nova análise.</li>
</ol>6. Cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem
<ol><li>Ressuscite os peptídeos secos por sonicação repetida por 15-30 s de cada vez usando um sonicator de banho com uma saída de 250 W e vórtice em 20-40 μL de água contendo 3% de ACN. Determine a concentração de peptídeos realizando um ensaio de BCA de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Separe as amostras por LC de fase reversa e MS/MS, conforme descrito anteriormente6, e registre os espectros MS1 na faixa de m/z de 400-2000. Garantir que a dissociação colisional de alta energia (HCD) seja utilizada para obter informações de intensidade de íons repórteres para a análise de peptídeos isobaricamente marcados. Consulte as seções de métodos de relatórios anteriores para obter mais detalhes sobre as condições de execução do instrumento 27,30 e a análise dos dados de MS27,31. NOTA: Diferentes sistemas ou configurações de LC-MS/MS podem ser usados para analisar as amostras de peptídeos. A cobertura e a sensibilidade da identificação de peptídeos dependerão do sistema específico e das configurações usadas.</li>
</ol>

<ol><li>Sies, H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+%28ROS%29+as+pleiotropic+physiological+signalling+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).</li>
<li>Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+nitrogen+species+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive nitrogen species in cellular signaling.</a> Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).</li>
<li>Olson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+legacy+of+sulfur%3A+A+roadmap+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824(2021).</li>
<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+eustress%3A+on+constant+alert+for+redox+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis.</a> Redox Biology. 41, 101867(2021).</li>
<li>Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+thiols+and+cysteines+in+redox+biology+and+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry.</a> Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+light%2Fdark+modulation+of+thiol+oxidation+in+cyanobacteria+revealed+by+quantitative+site-specific+redox+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).</li>
<li>Shi, X., Qiu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+S-nitrosylation+of+proteins+in+regulating+cardiac+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress.</a> Antioxidants. 9 (11), 1051(2020).</li>
<li>Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteines+as+redox+molecular+switches+and+targets+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cysteines as redox molecular switches and targets of disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167(2017).</li>
<li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+redox+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The redox proteome.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).</li>
<li>Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+reactivity+across+the+subcellular+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cysteine reactivity across the subcellular universe.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).</li>
<li>Skryhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cysteine+residues+in+redox+regulation+and+protein+stability+of+Arabidopsis+thaliana+starch+synthase+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1.</a> PLoS One. 10 (9), 0136997(2015).</li>
<li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+redox+proteome+and+phosphoproteome+analysis+reveals+redox+switch+in+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt.</a> Nature Communications. 10 (1), 5486(2019).</li>
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<li>Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-based+transcriptional+regulation+in+prokaryotes%3A+revisiting+model+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse, financeiros ou não.

A captura assistida por resina tem sido utilizada em uma variedade de tipos de amostras e sistemas biológicos para a investigação de modificações oxidativas de resíduos de cisteína25,29,30. Este método permite a avaliação de amostras em múltiplos níveis e leituras, incluindo proteínas e peptídeos usando SDS-PAGE e análise de western blot, bem como locais individuais de cisteína usando espectrometria de massa. Independentemente d...

Em condições homeostáticas, as células geram espécies reativas de oxigênio, nitrogênio ou enxofre que ajudam a facilitar processos, como o metabolismo e a sinalização 1,2,3, estendendo-se tanto a procariotas quanto a eucariotos. Os níveis fisiológicos dessas espécies reativas são necessários para o bom funcionamento celular, também conhecido como 'eustress'1,4. Em contraste, um aumento nos oxidantes que leva a um desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes pode causar estresse oxidativo, ou "angústia"1, o que leva a danos celulares. Os oxidantes transduzem sinais para vias biológicas modificando diferentes biomoléculas, incluindo proteínas, DNA, RNA e lipídios. Em particular, os resíduos de cisteína de proteínas são locais altamente reativos propensos à oxidação devido ao grupo tiol na cisteína, que é reativo a diferentes tipos de oxidantes5. Isso dá origem a uma gama diversificada de modificações pós-traducionais reversíveis baseadas em redox (PTMs) para cisteína, incluindo nitrosilação (SNO), glutationilação (SSG), sulfenilação (SOH), persulfidação (SSH), polissulfidação (SSnH), acilação e dissulfetos. Formas irreversíveis de oxidação de cisteína incluem sulfinilação (SO2H) e sulfonilação (SO3H).
Modificações oxidativas reversíveis de resíduos de cisteína podem servir a papéis protetores que impedem uma oxidação irreversível adicional ou servir como moléculas sinalizadoras para as vias celulares a jusante 6,7. A reversibilidade de alguns PTMs tiol redox permite que os sítios de cisteína funcionem como "interruptores redox"8,9, em que mudanças no estado redox desses locais alteram a função da proteína para regular seu papel em processos transitórios. Os efeitos modulatórios dos PTMs redox 10 têm sido observados em muitos aspectos da função proteica 11, incluindo catálise 12, interações proteína-proteína 13, alteração de conformação14, coordenação de íons metálicos 15 ou ligação de inibidores farmacológicos 16. Além disso, os PTMs redox estão envolvidos em sítios de cisteína de proteínas que regulam vias como transcrição 17, tradução18 ou metabolismo19. Dado o impacto que os PTMs redox têm na função da proteína e nos processos biológicos, é importante quantificar a extensão da oxidação que um sítio de cisteína sofre em resposta a uma perturbação do estado redox.
A identificação de sítios de cisteína com estados redox alterados é focada na comparação do estado de oxidação no nível sítio-específico entre condições normais e perturbadas. As medições de mudança de dobra são frequentemente utilizadas para determinar quais locais são significativamente alterados, pois isso ajuda os usuários a interpretar quais locais de cisteína podem ser fisiologicamente significativos para o estudo. Alternativamente, as medições estequiométricas da oxidação reversível do tiol em um tipo de amostra específico fornecem uma imagem geral do estado fisiológico em relação à oxidação celular, uma medida importante que muitas vezes é negligenciada e subutilizada. A estequiometria de modificação baseia-se na quantificação da porcentagem de tiol modificado em relação ao tiol proteico total (modificado e não modificado)20,21. Como resultado, as medições estequiométricas oferecem uma medição mais precisa do que a mudança de dobra, especialmente quando se usa espectrometria de massa. A significância do aumento da oxidação pode ser mais facilmente determinada usando estequiometria para determinar a ocupação de PTM de um determinado sítio de cisteína. Por exemplo, um aumento de 3 vezes na oxidação do tiol pode resultar de uma transição de apenas 1% a 3% ou de 30% a 90%. Um aumento de 3 vezes na oxidação para um local que está apenas em 1% de ocupação pode ter pouco impacto na função de uma proteína; no entanto, um aumento de 3 vezes para um local com 30% de ocupação no estado de repouso pode ser mais substancialmente afetado. As medições estequiométricas, quando realizadas entre tióis oxidados totais e modificações oxidativas específicas, incluindo glutationilação de proteínas (SSG) e nitrosilação (SNO), podem revelar razões e informações quantitativas em relação a tipos específicos de modificação.
Como a oxidação reversível do tiol é tipicamente uma modificação pós-traducional de baixa abundância, várias abordagens foram desenvolvidas para o enriquecimento de proteínas contendo essas modificações a partir de amostras biológicas. Uma abordagem inicial concebida por Jaffrey e outros, chamada de técnica de troca de biotina (BST)22, envolve várias etapas em que tióis não modificados são bloqueados por alquilação, tióis modificados reversivelmente são reduzidos a tióis livres nascentes, tióis livres nascentes são marcados com biotina e as proteínas marcadas são enriquecidas por pulldown de afinidade com estreptavidina. Essa técnica tem sido utilizada para traçar o perfil SNO e SSG em muitos estudos e pode ser adaptada para sondar outras formas de oxidação reversível do tiol23,24. Embora o BST tenha sido utilizado para investigar diferentes formas de oxidação reversível do tiol, uma preocupação com essa abordagem é que o enriquecimento é afetado pela ligação não específica de proteínas não biotiniladas à estreptavidina. Uma abordagem alternativa desenvolvida em nosso laboratório, denominada captura assistida por resina (RAC)25,26 (Figura 1), contorna a questão do enriquecimento dos grupos tiol por meio do sistema biotina-estreptavidina.
Após a redução dos tióis oxidados reversivelmente, as proteínas com tióis livres nascentes são enriquecidas pela resina tiol-afinidade, que captura covalentemente os grupos tiol livres, permitindo o enriquecimento mais específico das proteínas contendo cisteína do que a BST. O acoplamento do RAC com o poder de multiplexação dos recentes avanços na rotulagem isobárica e espectrometria de massa cria um fluxo de trabalho robusto e sensível para o enriquecimento, identificação e quantificação de resíduos de cisteína oxidados reversivelmente no nível de proteoma. Avanços recentes na espectrometria de massas permitiram um perfil muito mais profundo do proteoma tiol redox, aumentando a compreensão da causa e do efeito da oxidação do tiol proteico27. As informações obtidas a partir de dados quantitativos site-specific permitem novos estudos dos impactos mecanicistas e dos efeitos a jusante das modificações oxidativas reversíveis28. A utilização desse fluxo de trabalho forneceu informações sobre os impactos fisiológicos da oxidação reversível da cisteína em relação a eventos fisiológicos normais, como o envelhecimento, em que os níveis de SSG diferiram em relação à idade. Os efeitos do envelhecimento sobre o SSG foram parcialmente revertidos usando SS-31 (elamipretida), um novo peptídeo que melhora a função mitocondrial e reduz os níveis de SSG em camundongos idosos, fazendo com que eles tenham um perfil SSG mais semelhante ao de camundongos jovens29.
As condições fisiopatológicas atribuídas à exposição a nanopartículas demonstraram envolver SSG em um modelo de macrófago de camundongo. Usando RAC juntamente com espectrometria de massa, os autores mostraram que os níveis de SSG estavam diretamente correlacionados com o grau de estresse oxidativo e comprometimento da função fagocítica dos macrófagos. Os dados também revelaram diferenças específicas da via em resposta a diferentes nanomateriais de engenharia que induzem diferentes graus de estresse oxidativo30. O método também provou sua utilidade em espécies procarióticas, onde foi aplicado para estudar os efeitos dos ciclos diurnos em cianobactérias fotossintéticas em relação à oxidação do tiol. Amplas mudanças na oxidação do tiol em vários processos biológicos importantes foram observadas, incluindo transporte de elétrons, fixação de carbono e glicólise. Além disso, por meio da validação ortogonal, vários sítios funcionais chave foram confirmados para serem modificados, sugerindo papéis regulatórios dessas modificações oxidativas6.
Neste trabalho, descrevemos os detalhes de um fluxo de trabalho padronizado (Figura 1), demonstrando a utilidade da abordagem RAC para o enriquecimento de tióis de cisteína oxidada total de proteínas e sua subsequente marcação e quantificação estequiométrica. Esse fluxo de trabalho tem sido implementado em estudos do estado redox em diferentes tipos de amostras, incluindo culturas celulares27,30 e tecidos inteiros (por exemplo, músculo esquelético, coração, pulmão)29,31,32,33. Embora não incluído aqui, o protocolo RAC também é facilmente adaptado para a investigação de formas específicas de modificações redox reversíveis, incluindo SSG, SNO e S-acilação, como mencionado anteriormente25,29,34.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de 2-(piridilditio)etilamina</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-101794</td><td>Reagente para síntese interna de resina</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga LoBind de 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga LoBind de 5,0 mL Eppendorf</td><td></td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>tubos de fundo redondo de 5,0 mL</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Thiol Ativado&ndash; Sepharose&nbsp; 4B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8512</td><td>Potencial substituto para resina de afinidade com tiol</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL filtro centrífugo</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC5010BK</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bicincônico (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Protein Assay Reagent</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20291</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Amortecedor HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>BioSpec Produtos</td><td>985370</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetimida (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 4 Ativada por NHS Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17-0906-01</td><td>Reagente para síntese interna de resina</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus coletor de vácuo</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>1510R-MT</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de rotação</td><td>Thermo Scientific</td><td>69705</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de fase reversa Strata C18-E</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S001-DAK</td><td>Dessalinização de peptídeos</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td><td></td></tr><tr><td>Tiopropil Sepharose 6B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0420-01</td><td>Resina de afinidade com tióis; *A produção da resina de tiopropilsese 6B foi descontinuada pelo fabricante (consulte o protocolo para obter detalhes).</td></tr><tr><td>Etiquetas isobáricas TMT (16 plex)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A44522</td><td>Reagente de marcação de peptídeos; disponível em vários formatos</td></tr><tr><td>Tampão de bicarbonato de trietilamônio (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega</td><td>V5820</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus speedvac</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>concentrador de vácuo misturador</td></tr><tr><td>de vórtice</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

captura assistida por resina juntamente com marcação de massa em tandem isobárica para quantificação multiplexada da oxidação de proteína tiol

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Modificações oxidativas reversíveis em tióis proteicos emergiram recentemente como importantes mediadores da função celular. Neste documento, descrevemos o procedimento detalhado de um método quantitativo de proteômica redox que utiliza captura assistida por resina (RAC) em combinação com marcação isobárica em tandem mass tag (TMT) e espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida (LC-MS/MS) para permitir a quantificação estequiométrica multiplexada de tióis de proteínas oxidadas no nível do proteoma. As informações quantitativas específicas do local sobre resíduos de cisteína oxidada fornecem informações adicionais sobre os impactos funcionais de tais modificações. 
O fluxo de trabalho é adaptável em muitos tipos de amostras, incluindo células cultivadas (por exemplo, mamíferos, procarióticas) e tecidos inteiros (por exemplo, coração, pulmão, músculo), que são inicialmente lisados/homogeneizados e com tióis livres sendo alquilados para evitar a oxidação artificial. Os tióis de proteína oxidada são então reduzidos e capturados por uma resina de afinidade de tiol, que simplifica e simplifica as etapas do fluxo de trabalho, permitindo que os procedimentos de digestão, rotulagem e lavagem sejam realizados sem transferência adicional de proteínas / peptídeos. Finalmente, os peptídeos marcados são eluídos e analisados pelo LC-MS/MS para revelar mudanças estequiométricas abrangentes relacionadas à oxidação do tiol em todo o proteoma. Este método melhora muito a compreensão do papel da regulação dependente de redox sob estados fisiológicos e fisiopatológicos relacionados à oxidação do tiol proteico.

O término do protocolo resultará em enriquecimento altamente específico de peptídeos contendo cisteína anteriormente oxidados, muitas vezes com especificidade de &gt;95% 27,35,36. No entanto, várias etapas importantes do protocolo requerem atenção especial, por exemplo, o bloqueio inicial de tióis livres antes da lise/homogeneização da amostra, o que proíbe a oxidação artificial e o enriquecimento inespecífico de tióis oxidados ...

A oxidação do tiol proteico tem implicações significativas em condições fisiológicas e fisiopatológicas normais. Descrevemos os detalhes de um método proteômico redox quantitativo, que utiliza captura assistida por resina, marcação isobárica e espectrometria de massa, permitindo a identificação e quantificação específicas do local de resíduos de cisteína oxidada reversivelmente de proteínas.

Captura assistida por resina juntamente com marcação de massa em tandem isobárica para quantificação multiplexada da oxidação de proteína tiol

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Este protocolo descreve um método que permite a identificação sítio-específica de resíduos de cistina oxidada de proteínas. O método permite que dados quantitativos e site-specific de resíduos de cistina oxidada sejam gerados a partir de vários tipos de amostras. Para iniciar o procedimento de captura assistida, lave os pellets de proteína precipitada duas vezes com acetona por centrifugação a 20, 500 G, em quatro graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, decante a acetona e remova a acetona restante com uma micropipeta. Usando uma pipeta sorológica de vidro, adicione três mililitros de acetona gelada fresca ao tubo e misture bem invertendo o tubo várias vezes. Após a segunda lavagem, deixe os pellets secarem ao ar por um a dois minutos sem deixá-los secar demais.Adicione um mililitro de tampão B ao pellet de proteína seca. Para solubilizar a proteína, sonicate o pellet repetidamente em um sonicator de banho com uma saída de 250 watts por 15 a 30 segundos de cada vez, juntamente com um breve vórtice. Realize o ensaio de ácido bicinchonínico ou BCA para medir a concentração de proteína.Para padronizar as concentrações de proteína, transfira 500 microgramas de amostra de proteína para um filtro centrífugo de 0,5 mililitro e 10 quilodaltons e aumente o volume da amostra para 500 microlitros com tampão de ressuspensão. Centrifugar a mistura tampão proteico a 14 000 G à temperatura ambiente, até que o volume no filtro centrífugo seja inferior a 100 microlitros. Recolha a amostra invertendo o filtro num tubo de recolha.Centrifugar a amostra a 1000 G durante dois minutos e adicionar tampão C para obter um volume final de 500 microlitros. Para reduzir os tióis de proteína, adicione 20 microlitros de 500 milimolares de ditiotreitol ou TDT, à amostra para obter uma concentração final de 20 milimolares e incube as amostras por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação a 850 RPM. Após redução, centrifugar para as amostras em filtros centrífugos de 0,5 mililitros e 10 quilodalton a 14.000 G à temperatura ambiente, até que o volume no filtro centrífugo seja inferior a 100 microlitros.Adicione o tampão D para compor o volume a 500 microlitros e repita a centrifugação. Após a quarta centrifugação, recolher as amostras invertendo o filtro num tubo de recolha para centrifugar a 1000 G durante dois minutos. Em seguida, meça a concentração de proteína usando o ensaio de BCA.Em seguida, coloque as colunas de rotação em um coletor de vácuo e, usando uma micropipeta, transfira 500 microlitros da pasta de resina de afinidade de tiol recém-preparada para cada coluna. Aplique vácuo para remoção de água. Repita o procedimento uma vez para obter 30 miligramas de resina por coluna.Lave a resina cinco vezes com 500 microlitros de água ultrapura, aplicando um vácuo para remover a água e, em seguida, cinco vezes com 500 microlitros de tampão E.In um novo tubo, adicione o tampão C a 150 microgramas da amostra de proteína reduzida até que o volume final seja de 120 microlitros. Transfira a solução proteica para uma coluna de rotação conectada contendo a resina. Coloque a tampa na coluna e incube durante duas horas à temperatura ambiente com agitação a 850 rpm.Lave a resina conforme descrito no manuscrito. Substitua o plugue. Para realizar a digestão tríptica em resina, adicione 120 microlitros de solução de tripsina recém-preparada às amostras e incube a coluna durante a noite a 37 graus Celsius, com agitação a 850 RPM.No dia seguinte, lave a resina várias vezes, conforme descrito no manuscrito, e substitua o plugue. Usando uma micropipeta, adicione 40 microlitros de tampão de bicarbonato de trietilamônio 100 milimolares à resina lavada. Em seguida, adicione 70 microlitros da etiqueta de massa em tandem dissolvido ou do reagente de marcação TMT e incube por uma hora à temperatura ambiente com agitação a 850 RPM.Armazene qualquer reagente TMT restante a menos 80 graus Celsius. Lave a resina e substitua o plugue. Eluir os peptídeos marcados com TMT adicionando 100 microlitros de tampão de bicarbonato de amônio 100 milimolares a pH 8,0, contendo 20 milimolares de TDT, à coluna e incubando a coluna em um misturador térmico à temperatura ambiente por 30 minutos a 850 RPM.Após a incubação, realize a eluição colocando a coluna em um coletor de vácuo, aplicando o vácuo e eluíndo as amostras em um tubo de microcentrífuga de cinco mililitros. Repita o passo uma vez e, em seguida, adicione 100 microlitros de acetonitrila a 80% com ácido trifluoroacético a 0,1% à coluna. Depois de incubar a coluna durante 10 minutos à temperatura ambiente, eluir a amostra no mesmo tubo de centrífuga de cinco mililitros.Colocar as amostras eluídas num concentrador de vácuo até secar. Em seguida, armazene os peptídeos secos a menos 80 graus Celsius até o uso posterior. A análise qualitativa de amostras peptídicas de células RAW 264.7 foi realizada com SDS-PAGE, em que as amostras foram comparadas determinando-se diferentes níveis de oxidação devido aos tratamentos.As proteínas separadas foram posteriormente sondadas por western blot para investigar melhor os níveis de oxidação de proteínas individuais. As intensidades de íons relatadas de peptídeos contendo cistina foram analisadas por espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida. A estequiometria de oxidação do tiol do iTRAQ, peptídeos enriquecidos e oxidados marcados em níveis individuais de cistina foram quantificados.Remova cuidadosamente a acetona sem perturbar o pellet de proteína. Certifique-se de que o pellet de proteína seja completamente solubilizado e quantificado com precisão, e que a resina seja alocada com precisão nas colunas de spin. Certifique-se de ressuspender novamente a resina durante as etapas de lavagem.Uma avaliação adicional de proteínas e peptídeos enriquecidos pode ser realizada por SDS-PAGE e coloração, western blotting e espectrometria de massa.

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Research

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Biochemistry

Bioquímica

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Captura assistida por resina juntamente com marcação de massa em tandem isobárica para quantificação multiplexada da oxidação de proteína tiol

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