Name: Avaliação da Atividade Antitumoral In vivo de Nanopartículas de Polianidrido IL-1α (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a avaliar a atividade antitumoral de IL-1α em modelo murino de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. Este protocolo permite estudar eficácia e toxicidade para pesquisa oncológica.

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Este trabalho foi apoiado em parte pelo Prêmio de Revisão de Mérito #I01BX004829 dos Estados Unidos (EUA) Departamento de Assuntos de Veteranos, Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento de Laboratório Biomédico e apoiado pelo Programa de Prêmio Mezhir através do Holden Comprehensive Cancer Center da Universidade de Iowa.

Todos os procedimentos in vivo utilizados neste estudo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and UseCommittee (IACUC) da Universidade de Iowa.
1. Preparação e manutenção da linhagem celular HNSCC
NOTA: Neste estudo, será utilizada a linhagem celular epitelial orofaríngea murina transformada de forma estável com HPV E6 e E7 juntamente com hRas e luciferase (mEERL). Esta linhagem celular foi desenvolvida a partir da estirpe de rato C57BL/6J e foi um presente da Dra. Paola D. Vermeer (Departamento de Cirurgia, Universidade de Dakota do Sul Sanford School of Medicine, Dakota do Sul, EUA).
<ol><li>Descongele um frasco congelado de células mEERL em banho-maria pré-aquecido (37 °C) e, em seguida, transfira para um tubo cônico de 15 mL contendo meios de cultura quentes (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] suplementado com 40,5% 1:1 DMEM/Hams F12, 10% de soro fetal bovino [FBS], 0,1% de gentamicina, 0,005% de hidrocortisona, 0,05% de transferrina, 0,05% de insulina, 0,0014% de tri-iodotironina e 0,005% de fator de crescimento epidérmico).</li>
	<li>Centrifugar o tubo cónico a 277 x g durante 5 minutos a 25 °C para remover o meio. Em seguida, ressuspender o pellet celular em meio fresco de 3-5 mL e transferi-lo para um frasco de cultura de células T-25. Para uma recuperação ideal do armazenamento congelado, células de placa em alta densidade. NOTA: Os frascos T-25 foram usados devido ao seu tamanho menor, resultando em tempos de recuperação mais rápidos do armazenamento congelado quando as células estão próximas em comparação com os frascos T-75.</li>
	<li>Deixe as células crescerem em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2, expandam-se para frascos maiores (ou seja, T-75 ou T-150) e passem a cada 3 dias. Quando houver células suficientes para a implantação desejada em todos os camundongos, remova os frascos, descarte o meio e lave suavemente as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, adicionar 4 mL (se estiver usando frascos T150) de tripsina-EDTA a 0,25% e incubar a 37 °C por 2 min. Dimensione a quantidade de tripsina para cima ou para baixo, dependendo do tamanho do prato/frasco que está sendo usado. NOTA: O tipo de linhagem celular e o grau de confluência podem afetar os tempos de tripsinização. Longos períodos de tripsinização podem danificar as células, resultando em baixa viabilidade. Use a quantidade mínima de tempo necessária para a tripsinização.</li>
	<li>Sob o microscópio, as células destacadas na tripsinização se movem livremente. Se algumas células ainda estiverem ligadas, bata muito suavemente no balão para mobilizar as restantes células aderentes. Adicione meios frescos (incruste a quantidade de meios conforme desejado) para interromper a reação de tripsina e coletar a suspensão celular em tubos cônicos de 50 mL. Centrifugar a 277 x g durante 5 minutos a 25 °C para remover o meio.</li>
	<li>Ressuspenda as células em meios frescos e conte as células. Centrifugar mais uma vez (como descrito acima) e, em seguida, adicionar PBS frio às células para fazer uma concentração final de 10 × 106 células/mL. Mantenha a(s) suspensão(ões) celular(is) no gelo antes da injeção em camundongos.</li>
</ol>2. Implantação do tumor, tratamento medicamentoso e medição
NOTA: Os animais experimentais foram mantidos no Animal Care Facility da Universidade de Iowa e seguiram procedimentos assépticos apropriados para manuseá-los.
<ol><li>Anestesiar camundongos C57Bl/6J com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) mistura. Raspe cuidadosamente a área do flanco ou o local de injeção desejado com uma navalha elétrica. NOTA: Lembre-se de documentar o uso de substâncias controladas conforme exigido por regras e regulamentos institucionais (ou outros).</li>
	<li>Desinfete a área do flanco com uma almofada de etanol e injete lentamente 100 μL (contendo 1 x 106 células) da suspensão celular por via subcutânea usando uma seringa 25-28 G. Anestesiar os ratos antes da injeção para evitar movimentos súbitos e perda celular. Antes de cada injeção, misture suavemente a suspensão celular para evitar que as células se depositem no fundo do frasco para injetáveis ou do tubo cónico.</li>
	<li>Depois de levar a suspensão celular para a seringa, remova todas as bolhas e o espaço morto do topo. Injete a suspensão celular de forma lenta e constante. Não use a mesma agulha em vários camundongos. Sempre faça suspensões de células extras para contabilizar a perda acidental.</li>
	<li>Coloque o animal em suas respectivas gaiolas e monitore-os até que eles se recuperem da anestesia. Durante a anestesia, os animais estão em risco de hipotermia; portanto, forneça calor suplementar ou coloque os ratos próximos uns dos outros para se manterem aquecidos (se alojados na mesma gaiola).</li>
	<li>Quando os tumores atingirem 3 mm em qualquer direção, randomize os camundongos (por tamanho do tumor e / ou peso) nos grupos de tratamento e, em seguida, inicie o tratamento medicamentoso. Injetar os ratos por via intraperitoneal (i.p.) com NPs15 contendo 3,75 μg de rIL-1α/rato nos dias 4 e 9. Meça e registre o volume do tumor ((comprimento x largura 2) /2) e o peso do rato diariamente ou em dias alternados até que o tamanho do tumor ou os camundongos atinjam os critérios de eutanásia. NOTA: Mesmo com um pesquisador experiente, é difícil implantar o tumor do mesmo tamanho em todos os camundongos. Randomizar os animais em grupos experimentais com base no tamanho do tumor e no peso do rato.</li>
</ol>3. Coleta de sangue e separação sérica
NOTA: A coleta de sangue de uma veia submandibular é uma técnica fácil e eficaz que permite a coleta de sangue de animais conscientes ou animais sob anestesia. Para este estudo, o sangue foi coletado dos animais quando estavam sob anestesia.
<ol><li>Anestesiar os ratos com uma injeção de mistura de cetamina / xilazina, conforme mencionado acima.</li>
	<li>Segure a pele solta sobre o ombro usando a mão não dominante e perfure a veia submandibular com uma agulha ou lanceta de 18 G, ligeiramente atrás da mandíbula (uma mancha branca nessa área).</li>
	<li>Perfure a veia para garantir o fluxo sanguíneo imediatamente. Recolher 200-300 μL de sangue (dependendo do peso do rato) num tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml ou num tubo separador de soro. Após a coleta de sangue, aplique uma pressão suave no local da punção até que o sangramento tenha parado. Devolva os ratos às suas respectivas gaiolas e observe até que eles se recuperem da anestesia. NOTA: Não recolha mais de 1% do peso corporal do rato numa recolha ou durante um período de 24 horas.</li>
	<li>Deixe o sangue coletado coagular à temperatura ambiente por 20-30 min. Coloque os tubos no gelo até que estejam prontos para serem centrifugados.</li>
	<li>Centrifugar o sangue coagulado a 1540 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Recolher a camada superior (soro) sem perturbar os glóbulos vermelhos. Conservar a -80 °C até à utilização.</li>
</ol>4. Multiplexação do soro coletado
<ol><li>Descongele as amostras de soro ou plasma, mantendo-as no gelo.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 1540 x g durante 5 min a 4 °C para sedimentar quaisquer detritos celulares e recolher cuidadosamente a camada sérica a partir do topo.</li>
	<li>Traga o kit multiplex à temperatura ambiente. NOTA: Existem vários kits multiplex comercialmente disponíveis que são projetados para citocinas, quimiocinas ou fatores de crescimento específicos. Além disso, é possível personalizar o kit com base na proteína de interesse.</li>
	<li>Execute o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante para detectar citocinas. NOTA: A maioria dos kits multiplex usa contas magnéticas para ligar o anticorpo capturado. Portanto, é essencial usar uma lavadora magnética automatizada ou portátil durante a lavagem. Caso contrário, as contas magnéticas serão lavadas da placa, e não se terá eventos suficientes para fazer a leitura.</li>
</ol>5. Coleta de tumor e linfonodo inguinal e preparação de suspensão unicelular
<ol><li>Anestesiar os camundongos com mistura de cetamina/xilazina. Para garantir a sedação completa, use reflexo do pedal (pinça firme do dedo do pé). Se os ratos não responderem, eutanasie os ratos por luxação cervical.</li>
	<li>Coloque cada rato de costas e pulverize 70% de etanol na pele da área abdominal. Use fórceps e tesouras para cortar o tumor do lado esquerdo dos ratos e o linfonodo do lado direito. Se o tumor for grande, corte em pedaços pequenos e tome 500-600 mg do tecido. Para o linfonodo, colete todo o órgão. NOTA: Existem dois gânglios linfáticos em ambos os lados da região inguinal. Dependendo dos objetivos experimentais, o linfonodo e o tumor podem ser isolados do mesmo lado. No entanto, se o tumor se tornar muito grande, não será fácil coletar o linfonodo do mesmo lado.</li>
	<li>Coloque os tecidos sobre os respectivos tubos dissociadores contendo 3-5 mL de meios RPMI. Homogeneize o tecido usando um dissociador automatizado. NOTA: Outros homogeneizadores automatizados ou portáteis podem ser usados.</li>
	<li>Após homogeneização, transfira a suspensão celular através de um filtro de 70 μm para um tubo cônico de 50 mL. Centrifugar a 277 x g durante 5 minutos a 25 °C para remover o meio. Lave e ressuspenda as células em 1-2 mL de PBS frio.</li>
</ol>6. Coloração FACS da suspensão unicelular
<ol><li>Use 0,4% de coloração azul de tripano para contar as células viáveis em um hemocitômetro. Calcule o volume necessário para obter 2-3 milhões de células e transfira-as para o respectivo tubo FACS.</li>
	<li>Use corante de viabilidade para portar em células vivas; caso contrário, pode ocorrer uma ligação inespecífica do anticorpo com células mortas que pode produzir um resultado falso-positivo. NOTA: O corante zumbi foi usado para coloração de células vivas e mortas neste experimento. Vários corantes fixáveis e não fixáveis (por exemplo, iodeto de propídio) estão comercialmente disponíveis.</li>
	<li>Centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) as células contadas. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 300 μL de PBS. Adicione 0,5-1 μL de corante/tubo zumbi. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min no escuro.</li>
	<li>Centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) e lavar as células com 1-2 ml de tampão FACS e ressussuscitá-las em 200 μL de tampão FACS.</li>
	<li>Adicionar bloqueador do receptor Fc (2 μL por 200 μL ou de acordo com o protocolo do fabricante) e incubar as células por 10 min.</li>
	<li>Centrifugar (277 x g durante 5 min a 25 °C) e lavar as células com 1-2 ml de tampão FACS. Adicionar o cocktail de anticorpos e incubar durante 30 minutos a 4 °C no escuro.</li>
	<li>Após a incubação, centrifugar (277 x g por 5 min a 25 °C) e lavar as células com 1-2 mL de tampão FACS. Adicionar 300-400 μL de solução de paraformaldeído a 2% e ressuspender para fixação. Armazene as células nesta etapa por alguns dias a 4 °C ou analise imediatamente por citômetro de fluxo multicolorido.</li>
</ol>

<ol><li>Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+inflammation+by+blocking+interleukin-1+in+a+broad+spectrum+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).</li>
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<li>Gopferich, A., Tessmar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+degradation+and+erosion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride degradation and erosion.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).</li>
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<li>Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+polyanhydrides+as+localized+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Role of polyanhydrides as localized drug carriers.</a> Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).</li>
<li>Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides: an overview.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).</li>
<li>Goldman, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+human+cell+engraftment+in+mice+deficient+in+RAG2+and+the+common+cytokine+receptor+gamma+chain%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain.</a> British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).</li>
<li>Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspective+on+in+vivo+molecular+imaging+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells.</a> Molecules. 22 (6), (2017).</li>
<li>Espinosa-Cotton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+alpha+increases+antitumor+efficacy+of+cetuximab+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79(2019).</li>
<li>Veltri, S., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+trials+in+cancer+patients%3A+A+review+of+the+toxicity%2C+antitumor+and+hematopoietic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Oncologist%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects.</a> The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo permitirá que qualquer investigador estude a atividade antitumoral e alguns dos mecanismos subjacentes de drogas imunomoduladoras em um sistema modelo de camundongo tumoral in vivo. Aqui, foi utilizado um modelo de tumor subcutâneo singênico, que apresenta diversas vantagens em relação aos modelos ortotópicos, incluindo seu protocolo tecnicamente simples, fácil monitoramento do crescimento tumoral, menor morbidade animal e maior produtibilidade. Os modelos de tumores subcutâneos também podem ser m...

Uma das áreas emergentes da imunoterapia contra o câncer é o uso de citocinas inflamatórias para ativar o sistema imunológico dos pacientes contra suas células tumorais. Várias citocinas pró-inflamatórias (ou seja, interferon-alfa (IFNα), interleucina-2 (IL-2) e interleucina-1 (IL-1)) podem montar imunidade antitumoral significativa, o que gerou interesse em explorar as propriedades antitumorais, bem como a segurança de medicamentos à base de citocinas. A interleucina-1 alfa (IL-1α), em particular, é uma citocina pró-inflamatória conhecida como citocina mestra da inflamação1. Desde a descoberta dessa citocina no final da década de 1970, ela tem sido investigada como agente anticancerígeno, bem como medicamento hematopoiético para tratar os efeitos negativos da quimioterapia2. Durante o final da década de 1980, vários estudos pré-clínicos e clínicos foram realizados para determinar os efeitos anticancerígenos da IL-1α 3,4,5,6. Esses estudos encontraram atividade antitumoral promissora de IL-1α recombinante (rIL-1α) contra melanoma, carcinoma de células renais e carcinoma de ovário. No entanto, toxicidades, incluindo febre, náuseas, vômitos, sintomas semelhantes aos da gripe e hipotensão limitante da dose mais grave foram comumente observadas. Infelizmente, essas toxicidades relacionadas à dose diminuíram o entusiasmo pelo uso clínico adicional da rIL-1α.
Para tentar abordar a questão crítica das toxicidades mediadas pela IL-1α, serão investigadas formulações de nanopartículas de polianidrido (NP) que permitam a liberação controlada de IL-1α pela cinética de erosão superficial. Essas formulações de NP destinam-se a colher os benefícios das propriedades antitumorais da IL-1α, reduzindo os efeitos colaterais limitantes da dose7. Os polianidridos são polímeros aprovados pela FDA que se degradam através da erosão superficial, resultando na liberação de quase ordem zero de agentes encapsulados 8,9,10,11,12. Copolímeros anfifílicos de polianidrido contendo 1,8-bis-(p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano (CPTEG) e 1,6-bis-(p-carboxifenoxi) hexano (CPH), têm sido relatados como excelentes sistemas de entrega para várias cargas úteis em oncologia e pesquisa baseada em imunologia 8,12. No protocolo a seguir, 20:80 NPs CPTEG:CPH carregados com 1,5% em peso rIL-1α (IL-1α-NPs) serão usados para estudar a atividade antitumoral e a toxicidade dessa citocina em um modelo de camundongo de HNSCC.
O objetivo geral dos procedimentos a seguir é avaliar a atividade antitumoral de IL-1α-NPs em HNSCCs. Os procedimentos descritos, incluindo a avaliação do crescimento e sobrevida tumoral, podem ser aplicados a qualquer agente imunomodulador de interesse. Esses procedimentos devem ser realizados em um modelo singênico de camundongo com sistema imunológico intacto13 para maximizar a relevância clínica. A toxicidade da IL-1α-NP também será avaliada medindo mudanças nos níveis circulantes de citocinas pró-inflamatórias e no peso animal. Existem muitos métodos para determinar a toxicidade in vivo da droga; no entanto, os métodos mais utilizados envolvem a medição de enzimas séricas para toxicidade de órgãos e alterações histológicas nesses órgãos. No entanto, para realizar análises histológicas, o animal precisa ser sacrificado, o que afetará as curvas de sobrevivência do experimento. Portanto, este protocolo incluirá um protocolo para a coleta de sangue de camundongos vivos para a medição de citocinas em amostras de soro. O soro coletado pode ser usado para a medição de quaisquer analitos séricos desejados quanto à toxicidade de órgãos. A citometria de fluxo multicolorida será usada para entender as mudanças na população de células imunes no microambiente tumoral e a migração de células imunes para o linfonodo. Outros métodos podem ser utilizados para identificar células imunes, incluindo imuno-histoquímica e/ou imunofluorescência de seções preservadas14. No entanto, essas técnicas podem ser demoradas e tediosas para executar em um grande número de animais. No geral, os seguintes métodos permitirão que os investigadores estudem a resposta imune antitumoral e os mecanismos potenciais de agentes imunoestimulatórios para o tratamento do câncer.

<table><tbody><tr><td>Sistemas Bio-Plex 200</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>O sistema foi fornecido pela Instalação de Citometria de Fluxo University of IOWA Health</td></tr><tr><td>Care Bio-Plex Pro Ensaio de Citocina de Camundongo 23-plex</td><td>Bio-Rad</td><td>M60009RDPD</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6J Jakson</td><td>Labs</td><td>664</td> DMEM de <td>4 a 6 semanas de idade</td></tr><tr><td>(Meio de Águia Modificado de Dulbecco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hams F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>SRP3196-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Millipore Sigma</td><td>12103C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução de sulfato de gentamicina</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Lavadora</td> de placas magnéticas portátil biotec <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EPX-55555-000</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6909-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Millipore Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina / xilazina</td><td></td><td></td><td>Anestesia injetável</td></tr><tr><td>Linha</td><td></td><td></td> <td>celular MEERLCélulas epiteliais orofaríngeas murinas expressando de forma estável HPV16 E6/E7 juntamente com células hRAS e luciferase (mEERL)</td></tr><tr><td>Balanças Portáteis</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scienceware&nbsp; Digi-Max&nbsp; paquímetro deslizante</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z503576-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de preparação de álcool estéril (álcool isopropílico 70%)</td> <td>Cardinal</td><td>COV5110. PMP</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Milipore Humano Sigma</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Tri-iodotironina</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5516-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da atividade antitumoral in vivo de nanopartículas de polianidrido il-1α

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A terapia com citocinas é uma estratégia imunoterapêutica promissora que pode produzir respostas imunes antitumorais robustas em pacientes com câncer. A citocina pró-inflamatória interleucina-1 alfa (IL-1α) tem sido avaliada como agente anticancerígeno em vários estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, toxicidades limitantes da dose, incluindo sintomas semelhantes aos da gripe e hipotensão, diminuíram o entusiasmo por essa estratégia terapêutica. A entrega de IL-1α baseada em nanopartículas de polianidrido (NP) representaria uma abordagem eficaz neste contexto, uma vez que isso pode permitir uma liberação lenta e controlada de IL-1α sistemicamente, reduzindo os efeitos colaterais tóxicos. Aqui é descrita uma análise da atividade antitumoral de NPs de polianidrido carregados de IL-1α em um modelo singênico de camundongo com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSCC). Células epiteliais orofaríngeas murinas expressando de forma estável HPV16 E6/E7 juntamente com células hRAS e luciferase (mEERL) foram injetadas por via subcutânea no flanco direito de camundongos C57BL/6J. Uma vez que os tumores atingiram 3-4 mm em qualquer direção, uma formulação de nanopartículas de 1,5% IL-1a - carregado 20:80 1,8-bis(p-carboxifenoxi)-3,6-dioxaoctano:1,6-bis(p-carboxifenoxi)hexano (CPTEG: CPH) (CPH) foi administrado a camundongos por via intraperitoneal. O tamanho do tumor e o peso corporal foram medidos continuamente até que o tamanho do tumor ou a perda de peso atingissem os critérios de eutanásia. Amostras de sangue foram coletadas para avaliar as respostas imunes antitumorais por punção venosa submandibular, e citocinas inflamatórias foram medidas por meio de ensaios multiplex de citocinas. Os linfonodos tumorais e inguinais foram ressecados e homogeneizados em uma suspensão unicelular para analisar várias células imunes através da citometria de fluxo multicolorida. Esses métodos padrão permitirão que os pesquisadores estudem a resposta imune antitumoral e o mecanismo potencial de NPs imunoestimulatórios e outros agentes de imunoterapia para o tratamento do câncer.

Neste estudo, a atividade antitumoral do polianidrido IL-1α em um modelo singênico de camundongo de CCSN foi investigada. A IL-1α recombinante (rIL-1α) retardou significativamente o crescimento do tumor mEERL (Figura 1A), embora tenha sido observada perda de peso nos camundongos tratados, que foi restaurada após a retirada do tratamento (Figura 1B). A IL-1α-NPs não induziu um efeito antitumoral significativo em comparação com a solução salina ou NPs em branco (F...

Um protocolo padrão é descrito para estudar a atividade antitumoral e a toxicidade associada da IL-1α em um modelo singênico de camundongo de HNSCC.

Avaliação da Atividade Antitumoral In vivo de Nanopartículas de Polianidrido IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Esses protocolos fornecem uma maneira eficaz de estudar a atividade antitumoral dos ataques imunomoduladores. Além disso, a análise das chances associadas nas citocinas circulantes e populações de células imunes pode ser feita usando esses métodos propostos. A principal vantagem deste protocolo é que é fácil e uma maneira direta de implantar um tumor e monitorar seu crescimento. A implicação direta desta técnica é avaliar a eficácia de certas terapias ou desafios na pesquisa anti-câncer. Além disso, alguns aspectos dessas técnicas são adequados para estudos de toxicidade. Para começar, descongele um frasco congelado de células EERL murinas em um banho-maria pré-aquecido a 37 graus Celsius e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros contendo meios de cultura quentes. Centrifugar o tubo cônico a 277 vezes G por cinco minutos a 25 graus Celsius para remover o meio. Em seguida, ressuspender o palato celular em meio fresco de três a cinco mililitros e transferi-lo para um frasco de cultura de células T25. Deixe as células crescerem em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, expanda para frascos maiores e passe a cada três dias. Quando houver células suficientes para a implantação desejada em todos os camundongos, remova os frascos, descarte o meio e enxágue suavemente as células PBS. Em seguida, adicione quatro mililitros de EDTA de tripsina a 0,25% e incube a 37 graus Celsius por dois minutos. Adicione meios frescos para parar a reação de tripsina e colete a suspensão celular em tubos cônicos de 50 mililitros. Ressuspenda as células em meios frescos e conte as células. Centrifugar mais uma vez, em seguida, adicionar PBS frio às células para fazer uma concentração final de 10 milhões de células por mililitro. Mantenha a suspensão celular no gelo antes da injeção. Desinfete a área do flanco com uma almofada de etanol. Para injetar suspensão de células em camundongos, aspirar 100 microlitros de suspensão de células na seringa e remover todas as bolhas e espaço morto do topo. Em seguida, injete a suspensão celular por via subcutânea de forma lenta e constante em camundongos anestesiados. Colocar os animais em suas respectivas gaiolas e monitorá-los até que se recuperem da anestesia. Para coletar sangue, segure a pele solta sobre o ombro com a mão não dominante e puncione a veia submandibular com uma agulha ou lanceta de calibre 18. Coletar de 200 a 300 microlitros de sangue em um tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitro ou tubo separador de soro. Após a coleta de sangue, aplique pressão suave no local da punção até que o sangramento tenha cessado. Devolva os camundongos para suas respectivas gaiolas e observe até que eles se recuperem da anestesia. Deixe o sangue coletado coagular em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Em seguida, coloque os tubos no gelo até que estejam prontos para serem centrifugados. Centrifugar o sangue coagulado a 1, 540 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius, e coletar cuidadosamente a camada de soro do topo. Descongelar as amostras de soro ou plasma, mantendo-as no gelo. Em seguida, centrifugar as amostras a 1.540 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, para sedimentar quaisquer detritos celulares e coletar cuidadosamente a camada de soro do topo. Coloque o kit multiplex em temperatura ambiente e realize o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante. Coloque cada rato de costas e borrife etanol a 70% na pele da área abdominal. Use pinça e tesoura para cortar o linfonodo do lado direito dos camundongos e o tumor do lado esquerdo. Se o tumor for grande, corte-o em pedaços pequenos e tire cerca de 500 a 600 miligramas do tecido. Colocar os tecidos nos respectivos tubos dissociadores contendo três a cinco mililitros de meio RPMI. Homogeneizar o tecido utilizando um dissociador automático. Após a homogeneização, filtrar a suspensão celular através de um filtro de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a 277 vezes G por cinco minutos a 25 graus Celsius para remover a mídia. Lave e ressuspenda as células em um a dois mililitros de PBS frio. Use a coloração azul de tripsina a 0,4% para contar as células viáveis em um hemocitômetro.Calcule o volume necessário para obter de dois a três milhões de células e transfira-as para o respectivo tubo de fax. A centrífuga contou células a 277 vezes G por cinco minutos a 25 graus Celsius.Decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 300 microlitros de PBS. Adicione 0,5 a um microlitro de corante zumbi por tubo e incube em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro. Centrifugar as células Lave-as com um a dois mililitros de tampão de fax e volte a suspendê-las em 200 microlitros de tampão de fax. Adicionar bloqueador do receptor FC de acordo com o protocolo do fabricante e incubar as células por 10 minutos. Centrifugar novamente nas configurações descritas anteriormente e lavar as células com um a dois mililitros de tampão de fax. Adicione o coquetel de anticorpos e incube por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Após a incubação, centrifugar e lavar as células com um a dois mililitros de tampão de fax. Adicionar 300 a 400 microlitros de solução de paraformaldeído a 2% e voltar a suspender para fixação. Armazenar as células por alguns dias a quatro graus Celsius ou analisar imediatamente por citômetro de fluxo multicolorido. Neste estudo, a atividade antitumoral do polianidrido IL-1

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Research

JoVE Journal

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Análise de eficácia antitumoral in vivo da PDT: uma técnica para determinar o potencial fototóxico de um fotossensibilizador em camundongos portadores de tumor

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A terapia fotodinâmica (PDT) é uma escolha alternativa para o tratamento do câncer de pulmão. Para aumentar o efeito terapêutico da PDT, foram desenvolvidas nanopartículas direcionadas ao câncer de pulmão combinadas com quimioterapia. Foram avaliadas as eficácias anticancerígenas in vitro e in vivo da TFD com nanopartículas preparadas.

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Avaliação da Atividade Antitumoral In vivo de Nanopartículas de Polianidrido IL-1α

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