Name: Modelo animal de grande porte para avaliação da eficácia da terapia gênica em coração isquêmico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprenda a avaliar a eficácia da terapia gênica em coração isquêmico utilizando um modelo animal de grande porte com ecocardiografia e angiografia coronária. Este método de baixa invasividade permite direcionamento preciso antes de ensaios clínicos.

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Os autores gostariam de agradecer a Maria Hedman, Tiina Laitinen, Tomi Laitinen, Pekka Poutiainen, Annika Viren e Severi Sormunen pela assistência e permissão de 15imagens de O-PET no Hospital Universitário de Kuopio; e Heikki Karhunen, Minna Törrönen e Riikka Venäläinen do National Laboratory Animal Center por sua assistência no trabalho com animais.
Este estudo é apoiado por bolsas da Academia Finlandesa, ERC e CardioReGenix EU Horizon 2020.

Os experimentos aqui apresentados são realizados com porcos domésticos fêmeas com cerca de 10 semanas de idade e são aprovados pelo Animal Experiment Board na Finlândia. Os animais pesam de 30 a 40 kg no início do protocolo, permitindo o mesmo equipamento de procedimento e modalidades de imagem possíveis para humanos. A isquemia crônica é induzida 14 dias antes da transferência gênica, e o tempo de seguimento após a transferência gênica depende do vetor viral utilizado. O protocolo do estudo é mostrado na Figura 1. Esse protocolo pode ser usado para realizar injeções de terapia gênica mediada por adenovírus ou AAV. O tempo de coleta da amostra deve ser ajustado ao pico de expressão transgênica, que depende do vetor viral utilizado. Por exemplo, ao realizar transferências de genes adenovirais, o tempo da coleta de amostra é definido como 6 dias após a transferência de genes.
1. Medicação
<ol><li>Administrar uma dose diária de 200 mg de amiodarona e 2,5 mg de bisoprolol para prevenir arritmias ventriculares fatais. A medicação começa 1 semana antes da operação de isquemia e é continuada diariamente até o seguimento.</li>
	<li>Além disso, administrar doses perorais de clopidogrel (300 mg) e ácido acetilsalicílico (300 mg) aos animais 1 dia antes da operação de isquemia para prevenir trombose aguda intra-stent após a colocação do stent.</li>
	<li>Administrar 100 mg de lidocaína e 2,5 mL de (246 mg/mL) de MgSO4 por via intravenosa aos animais no início da operação de isquemia para prevenir arritmias ventriculares.</li>
	<li>Administrar injeção intramuscular de cefuroxima (500 mg) no início de cada operação para profilaxia de infecção.</li>
	<li>Administrar 30 mg de enoxaparina por via intravenosa no início das operações de isquemia e por via subcutânea após o procedimento cirúrgico para prevenção de trombose.</li>
	<li>Para anestesia e analgesia, administrar 1,5 mL de atropina, 6 mL de azaperona (40 mg/mL), propofol 20 mg/mL, na velocidade de 15 mg/kg/h, e fentanil 50 μg/mL, na velocidade de 10 μg/kg/h. As dosagens dos medicamentos foram as mesmas para cada suíno. Consulte as diretrizes locais de uso de animais para administração de doses.</li>
	<li>Anestesiar os animais durante todas as operações. Todas as operações devem ser realizadas em ambiente estéril utilizando técnica estéril.</li>
</ol>2. Ecocardiografia transtorácica
<ol><li>Realizar ecocardiograma transtorácico antes da operação de isquemia, transferência gênica e eutanásia para avaliar qualquer líquido pericárdico detectável e determinar o estiramento miocárdico.</li>
	<li>Colocar o transdutor no terceiro ou quarto espaço intercostal sob a axila do porco para acessar as incidências paraesternais de eixo curto ao nível da valva mitral, músculo papilar e níveis apicais (Vídeo 1). O marcador do transdutor deve apontar para o esterno do porco. Para salvar um clipe, pressione Adquirir.</li>
</ol>3. Operações endovasculares sob orientação fluoroscópica
<ol><li>Realizar cine de imagem do ventrículo esquerdo após angiografias coronarianas antes da operação de isquemia, transferência gênica e coleta de tecido.</li>
	<li>Preparação da operação
	<ol><li>Prepare-se para as operações sedando os porcos com uma injeção intramuscular de 1,5 mL de atropina e 6 mL de azaperona.</li>
		<li>Após a sedação, induzir propofol geral e fentanil para os procedimentos angiográficos nos suínos com doses de 15 mg/kg/h e 10 μg/kg/h, respectivamente. OBS: Os porcos são anestesiados durante todo o procedimento.</li>
		<li>Apoiar a ventilação por intubação e ventilador e monitorar os parâmetros fisiológicos vitais, como ECG e parâmetros respiratórios.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocação da bainha introdutora
	<ol><li>Colocar uma bainha introdutora na artéria femoral direita para todas as operações como prática padrão em cardiologia. Utilizar ultrassonografia para rastrear a artéria femoral e perfurá-la com agulha de entrada (18 G). NOTA: Use uma bainha introdutora 8F para transferências gênicas intramiocárdicas e uma bainha 6F para todas as outras operações. Introduza o fio-guia da bainha através da agulha para rosquear a artéria e segure o fio-guia ainda enquanto retira a agulha.</li>
		<li>Inserir a bainha introdutora ao longo do fio-guia e, quando colocado, retirá-lo e administrar 1,25 mg de dinitrato sublingual ao porco para induzir vasodilatação coronariana.</li>
	</ol></li>
	<li>Angiografia coronária
	<ol><li>Realizar angiografia coronariana diretamente antes da operação de isquemia, transferência de genes e coleta de tecido. A maquinaria necessária para as angiografias é mostrada na Figura 2.</li>
		<li>Utilizar cateter 6F sob orientação fluoroscópica com contraste iodado para obtenção de imagens da artéria coronária direita e da artéria coronária ascendente esquerda (Vídeo 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Cine cintilar do ventrículo esquerdo em repouso e estresse com dobutamina
	<ol><li>Administrar um bolus de 21 mL de contraste iodado no ventrículo esquerdo através de um cateter pigtail 5F usando um auto-injetor. Primeiro, defina a duração do bolus em 3 s e o volume total para 21 mL. Em seguida, pressione Single e Yes.</li>
		<li>Calcular a fração de ejeção pelo software de medição da estação de trabalho angiográfica. Para realizar o cálculo, selecione Análise Ventricular da imagem em questão. Role a imagem para selecionar um período de tempo, um em diástole e outro em sístole. Selecione uma ferramenta para desenhar contornos ventriculares de cada período de tempo. NOTA: O software agora calcula a fração de ejeção e o volume sistólico pelo método de Simpson. A medida da fração de ejeção é realizada em repouso e sob estresse induzido pela dobutamina.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem de estresse
	<ol><li>Dose de dobutamina por via intravenosa em doses crescentes de 10 μg/kg/min para 20 μg/kg/min para a imagem de estresse induzida por dobutamina até que a frequência cardíaca alvo de 160 bpm seja atingida. Em seguida, realize o cine de imagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Operação de isquemia
	<ol><li>Colocar um stent de gargalo na artéria coronária esquerda (DA) 14 dias antes da transferência gênica para induzir isquemia miocárdica crônica. Após a colocação do stent de gargalo, verifique se o stent de gargalo está colocado corretamente, restringindo o fluxo sanguíneo coronariano. NOTA: O stent de gargalo é colocado em um cateter de dilatação e consiste em um stent não-farmacológico coberto por um tubo de politetrafluoretileno formado em forma de gargalo para reduzir o fluxo sanguíneo coronariano9.</li>
	</ol></li>
	<li>Definindo o tamanho do stent
	<ol><li>Escolher o tamanho do stent, 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, de acordo com o tamanho da artéria coronária ascendente esquerda na angiografia, utilizando o software de mensuração automática na estação de trabalho angiográfica (Vídeo 3)12.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocação de stent
	<ol><li>Coloque uma bobina na artéria coronária esquerda e deslize o stent de gargalo para a DA, colocando-a distalmente à primeira diagonal.</li>
		<li>Inflar o stent à pressão nominal na artéria usando um in-deflator com uma relação stent/lúmen de 1,3, ancorando o gargalo no local. Após mais 15 s, esvaziar o stent e retrair o equipamento da artéria. NOTA: Confirme o posicionamento correto do stent de gargalo por angiografia.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imagem por PET
OBS: Um dia antes da transferência gênica, realizar repouso e estresse 15exames de PET/CT marcados com radioágua marcada com O (requer ambiente hospitalar e técnicos radiológicos).
<ol><li>Imagem de referência
	<ol><li>Realizar tomografia computadorizada (TC) antes do repouso e imagens de estresse. Use as informações da TC para correção da atenuação.</li>
	</ol></li>
	<li>15Imagem radioaquática marcada com O-labeled
	<ol><li>Realize imagens de repouso e estresse usando um bolus de 800 MBq 15H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem de estresse
	<ol><li>Realizar imagens de estresse com um bolus adicional de 800 MBq 15 O-água após um decaimento radioativo adequado de 12min. NOTA: A hiperemia é induzida por adenosina (200 μg/kg/min intravenosa), como descrito anteriormente12.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Transferência gênica
<ol><li>Mapeamento eletroanatômico
	<ol><li>Proceder ao mapeamento eletroanatômico após angiografia coronariana e medidas funcionais (ecocardiografia, cine imaging do VE).</li>
		<li>Introduzir um cateter de mapeamento no ventrículo esquerdo através da bainha femoral em orientação fluoroscópica. NOTA: Registre cerca de 100-150 pontos ao redor do ventrículo esquerdo com o cateter de mapeamento para criar o mapa eletroanatômico.</li>
	</ol></li>
	<li>Finalizando o mapa eletroanatômico
	<ol><li>Exclua os pontos atípicos para garantir um mapa eletroanatômico mais confiável do ventrículo esquerdo.</li>
		<li>Faça isso selecionando Planos de clipe do mapa e exclua os pontos que diferem dos pontos que formam a forma ventricular. Em seguida, selecione Trajetórias para a visualização de mapa e exclua os pontos que viajaram horizontalmente durante o registro de pontos. NOTA: Certifique-se de que os pontos restantes cobrem o ventrículo esquerdo e registre mais pontos, se necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Injeções de transferência gênica
	<ol><li>Introduzir um cateter de injeção intramiocárdica no ventrículo esquerdo através da bainha femoral sob orientação fluoroscópica. Ajuste o comprimento da agulha de injeção para 3 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Critérios para injeções intramiocárdicas
	<ol><li>Guiar as transferências gênicas pelo sistema de mapeamento eletroanatômico e direcionar as injeções para áreas viáveis, porém hipocinéticas, do ventrículo esquerdo. NOTA: Para viabilidade, use uma tensão unipolar acima de 5 mV como critério. Para hipocinesia, selecionar um encurtamento linear local (DLE) tão baixo quanto disponível, pelo menos abaixo de 12%, mas preferencialmente abaixo de 6%13.</li>
	</ol></li>
	<li>Injeções intramiocárdicas
	<ol><li>Durante 30 s, injetar o material vetorial no ponto de seleção (passo 5.4) e manter a agulha de injeção dentro do miocárdio por mais 5 s antes de retrair para evitar o refluxo para o ventrículo esquerdo.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Eutanásia e coleta de amostras
OBS: Após as medidas de angiografia coronariana e fração de ejeção descritas nos passos 3.4.1 e 3.5.2, respectivamente, administrar 50 mL de cloreto de potássio saturado por via intravenosa no porco anestesiado.
<ol><li>Fixação perfusional do coração
	<ol><li>Colher o coração da cavidade torácica. Enxágue com água. Coloque uma agulha de 18 G acima da válvula aórtica e conecte a agulha a uma bomba de perfusão. Perfundir o coração com 750 mL de paraformaldeído (PFA) a 1%.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de amostras
	<ol><li>Corte o coração em fatias de 1 cm de espessura usando uma faca de cozinha afiada. Coletar as amostras da área de transferência gênica em PFA a 4% e nitrogênio líquido. NOTA: Para colher controles negativos, coletar uma amostra controle da parede posterior do ventrículo esquerdo.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de tecidos de segurança
	<ol><li>Colher amostras de tecidos remotos, como pulmão, fígado, rim, baço e ovários. Levar amostras em PFA a 4% e nitrogênio líquido.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Armazenamento de amostras
<ol><li>Conservar as amostras para coloração em PFA a 4% durante 48 h a 4 °C. NOTA: Substitua o PFA diariamente por um líquido fresco.<ol><li>Após 48 h, substituir o PFA por sacarose a 15% em água deionizada. Conservar durante pelo menos 24 h antes de incorporar as amostras em blocos de parafina. As amostras congeladas instantâneas são armazenadas a -70 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Os tempos deste protocolo podem ser modificados de acordo com o vetor viral utilizado. Além disso, as análises imuno-histológicas podem ser selecionadas de acordo com o gene terapêutico. Também é possível adicionar mais pontos de tempo e pontos de extremidade ao protocolo, se necessário.
Esse protocolo é composto por etapas, que são essenciais para o sucesso e impossíveis de corrigir posteriormente. Primeiro, se não se induzir isquemia adequada, o animal deve ser excluído de outros procediment...

A doença arterial coronariana é responsável pela grande proporção da mortalidade e carga de doença em todo omundo1. As estratégias atuais de tratamento são intervenções percutâneas, tratamento farmacológico e cirurgia de revascularização do miocárdio2. No entanto, apesar da progressão dessas terapêuticas atuais, muitos pacientes sofrem da chamada angina refratária, reforçando a necessidade não atendida de novas abordagens de tratamento3. A angiogênese terapêutica mediada pela terapia gênica poderia ter como alvo esse grupo de pacientes.
A terapia gênica miocárdica é mais frequentemente realizada com o uso de diferentes vetores virais, mais comumente adenovírus deficientes em replicação4. Como genes terapêuticos, vários fatores de crescimento angiogênicos são usados. Os fatores de crescimento angiogênicos mais substancialmente estudados são os fatores de crescimento endotelial vascular (VEGFs) que medeiam sua sinalização angiogênica através dos receptores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFRs) e seus co-receptores5. Vários ensaios clínicos comprovaram o benefício e a segurança da terapia gênica cardíaca e tornaram esse novo método de tratamento uma opção realista para o tratamento das cardiopatias isquêmicas 6,7. No entanto, esse conceito ainda necessita de aprimoramento dos genes terapêuticos e vetores virais testados em modelos animais de grande porte antes de entrar nas clínicas. O porco tem sido frequentemente usado como animal de laboratório, uma vez que seu coração é muito semelhante ao coração humano. O tamanho do sistema cardiovascular de um porco permite o uso de invenções de cateteres semelhantes às usadas em humanos. Todas as modalidades de imagem disponíveis para humanos podem ser utilizadas em suínos8.
Existem vários modelos animais de grande porte para isquemia crônica. Omodelo mais comumente utilizado é o constritor ameróide9,10,11. A desvantagem deste método é a invasividade, uma vez que a toracotomia é necessária para acessar a vasculatura coronariana. Anteriormente, em nosso grupo, foi desenvolvido um modelo mini-invasivo de stent de gargalo para isquemia miocárdicacrônica12. Este método também é utilizado neste manuscrito para induzir isquemia miocárdica.
A usabilidade da imagem ultrassonográfica evoluiu substancialmente apesar da idade da modalidade de imagem. Por exemplo, a tensão miocárdica ainda está principalmente em uso de pesquisa devido à sua novidade. O estiramento miocárdico reflete melhor as alterações da função contrátil do coração do que a medida tradicional da fração de ejeção modo-M13. Assim, aqui no modelo animal de grande porte, a medida do strain miocárdico é utilizada. Para avaliar a função do coração, o débito cardíaco também é medido por cine imaging do ventrículo esquerdo durante a angiografia. O débito cardíaco é medido tanto em repouso quanto sob estresse induzido por dobutamina para avaliar a função miocárdica sob estresse.
Além das medidas da função cardíaca, informações sobre a perfusão miocárdica são essenciais em estudos de terapia gênica visando à angiogênese terapêutica. Neste modelo animal, os animais são fotografados com 15 radiotomografias por emissão de pósitrons marcados com O (15H2O-PET), pois este é o padrão-ouro para medir a perfusão miocárdica. 15O H2O-PETfoi previamente validado para medir a perfusão de coração isquêmico suíno14.
Assim, os métodos e modalidades citados acima constituem uma excelente perspectiva para avaliar a eficácia da terapia gênica no coração isquêmico.

<table><tbody><tr><td>1% PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Preparado a partir de paraformaldeído em pó</td></tr><tr><td>15% de sacarose</td><td>VWR</td><td>VWRC27480.294</td><td>Preparado a partir de sacarose sólida</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Preparado a partir de paraformaldeído em pó</td></tr><tr><td>Cateter pigtail 5 F</td><td>Cordis</td><td>534-550S</td><td></td></tr><tr><td>Cateter 6 F AR2</td><td>Cordis</td><td>670-112-00</td><td></td></tr><tr><td>Bainha introdutora 6 F</td><td>Cordis</td><td>504-606X</td><td></td></tr><tr><td>Bainha introdutora 8 F</td><td>Cordis</td><td>504-608X</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td><td></td> acetilsalicílico <td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Amiodarona</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Estação angiográfica</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de angiolaboratório</td><td>M&ouml; lnlycke</td><td></td><td>projetado para as necessidades de nosso angiolaboratório, contém campos estéreis, copos e cotonetes</td></tr><tr><td>Bisoprolol</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Cefuroxima</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Clopidogrel</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Stent Coroflex Blue</td><td>B.Braun Medical</td><td>5029012</td><td>O número de catálogo depende do tamanho do stent</td></tr><tr><td>Crile fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciclotron</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dobutamina</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Sistema de mapeamento eletroanatômico</td><td>Biologics Delivery Systems, Johnson & Empresa</td><td></td><td></td>Johnson</tr><tr><td>Enoxaparina</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Fentanil</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Cateter de injeção intramiocárdica</td><td>Johnson & Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente de contraste de iodo</td><td>Iomeron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faca</td><td></td><td></td><td>de cozinha Produtor variável</td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td></td><td></td> líquido <td>Produtor variável</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Agulha 18 G</td><td>Cordis</td><td>12-004943</td><td></td></tr><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td><td></td>de perfusão</tr><tr><td>PET-CT scanner</td><td>Siemens Healthcare Tubo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>politetrafluoretileno</td></tr><tr><td>Propofol</td><td></td><td></td><td>Produtor variável</td></tr><tr><td>Bisturi nº 11</td><td>VWR</td><td>SWAN0503</td><td></td></tr><tr><td>Dinitrato sublingual</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de ultrassom</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelo animal de grande porte para avaliação da eficácia da terapia gênica em coração isquêmico

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

A doença arterial coronariana é uma das principais causas de mortalidade e morbidade no mundo. Apesar da progressão da terapêutica atual, uma proporção considerável de pacientes com doença arterial coronariana permanece sintomática. A angiogênese terapêutica mediada por terapia gênica oferece um novo método terapêutico para melhorar a perfusão miocárdica e aliviar os sintomas. A terapia gênica com diferentes fatores angiogênicos tem sido estudada em poucos ensaios clínicos. Devido à novidade do método, o progresso da terapia gênica miocárdica é um caminho contínuo da bancada até a beira do leito. Portanto, modelos animais de grande porte são necessários para avaliar a segurança e eficácia. Quanto mais o modelo animal de grande porte identifica a doença original e os desfechos usados em clínicas, mais previsíveis são os resultados dos ensaios clínicos. Aqui, apresentamos um modelo animal de grande porte para avaliar a eficácia da terapia gênica no coração isquêmico suíno. Utilizamos métodos de imagem clinicamente relevantes, como ultrassonografia e 15H2O-PET. Para direcionar as transferências gênicas para a área desejada, o mapeamento eletroanatômico é usado. O objetivo desse método é: (1) mimetizar a doença arterial coronariana crônica, (2) induzir angiogênese terapêutica em áreas hipóxicas do coração e (3) avaliar a segurança e eficácia da terapia gênica usando desfechos relevantes.

O sucesso da operação de isquemia pode ser confirmado com esse protocolo por angiografia coronariana e pela determinação da área hipocinética por ultrassonografia transtorácica (Figura 1) antes de proceder à liberação do gene. O estado de oclusão coronariana pode ser avaliado por angiografia coronariana, e o mapeamento eletroanatômico assegura as áreas isquêmicas e hibernantes.
A eficácia da terapia gênica pode ser analisada medindo-se o strain circunferencial, a ...

A terapia gênica miocárdica para cardiopatia isquêmica é uma grande promessa para futuras terapêuticas. Aqui, apresentamos um modelo animal de grande porte para avaliar a eficácia da terapia gênica no coração isquêmico.

Modelo animal de grande porte para avaliação da eficácia da terapia gênica em coração isquêmico

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a ...

Os métodos e modalidades de imagem utilizados neste protocolo constituem uma excelente imagem da segurança e eficácia da terapia gênica no coração isquêmico antes de se proceder aos ensaios clínicos. As principais vantagens dessa técnica são a baixa invasividade do modelo de isquemia, mas também o direcionamento preciso da terapia gênica para áreas hipocinéticas, mas ainda viáveis do coração. Comece realizando o ecocardiograma transtorácico antes da operação de isquemia, transferência de genes e eutanásia para avaliar qualquer líquido pericárdico detectável e determinar o estiramento miocárdico.Colocar o transdutor no terceiro ou quarto espaço intercostal sob a axila do porco com um marcador apontando para o esterno do porco para acessar as incidências paraesternais do eixo curto ao nível da valva mitral, músculo papilar e níveis apicais. Em seguida, pressione adquirir para salvar um clipe. Para a realização da cineangiocoronariografia diretamente antes da operação de isquemia, utilizar cateter 6-F sob orientação fluoroscópica com contraste iodado para obtenção de imagens da artéria coronária direita, da artéria coronária ascendente esquerda e da artéria descendente anterior.Para cine imaging no autoinjetor, defina a duração do bolus em três segundos e o volume total para 21 mililitros e, em seguida, pressione single, e sim para administrar o agente de contraste iodado no ventrículo esquerdo através de um cateter pigtail 5-F. Realizar cine imaging do animal em repouso e, em seguida, administrar dobutamina por via intravenosa e doses crescentes para a indução de estresse. Uma vez atingida a frequência cardíaca alvo de 160 batimentos por minuto, realiza cine imaging e remove o cateter pigtail.Para calcular a fração de ejeção abra o software de medição, selecione a análise ventricular da imagem em questão. Role a imagem para selecionar um período de tempo, um em diástole e outro em sístole e, em seguida, selecione uma ferramenta para desenhar contornos ventriculares de cada período de tempo. Para induzir a isquemia miocárdica crônica, 14 dias antes da transferência gênica, colocar uma bobina na artéria coronária esquerda, deslizar o stent de gargalo para a artéria coronária esquerda e colocar o stent distalmente à primeira diagonal.Inflar o stent à pressão nominal na artéria, utilizando um indeflator com relação stent/lúmen de 1,3 para ancoragem do gargalo. Após mais 15 segundos, esvaziar o stent, retrair o equipamento da artéria e garantir a colocação correta de um stent de gargalo por angiografia. Após angiografia e medidas funcionais sob orientação fluoroscópica, introduzir um cateter de mapeamento para o ventrículo esquerdo através da bainha femoral para mapeamento eletroanatômico, coletar pelo menos 100 pontos do ventrículo esquerdo e clicar em aceitar para aprovar um ponto.No mapa final, para viabilidade, use uma tensão unipolar acima de cinco milivolts como critério. E para hipocinesia, selecione um encurtamento linear local o mais baixo possível, pelo menos tão baixo quanto 12%, mas de preferência abaixo de 6% Após a eutanásia do animal, retire o coração da cavidade torácica. Uma vez que o coração colhido é enxaguado, coloque uma agulha de calibre 18 acima da válvula aórtica e conecte a agulha a uma bomba de perfusão.Perfundir o coração com 750 mililitros de paraformaldeído a 1%. Use uma faca afiada para cortar o coração em fatias de um centímetro de espessura e colete as amostras da área de transferência de genes em paraformaldeído a 4% e nitrogênio líquido. Armazenar as amostras para coloração em paraformaldeído a 4% durante 48 horas a quatro graus Celsius.A eficácia da terapia gênica foi analisada medindo-se o estiramento circunferencial, a fração de ejeção e a perfusão miocárdica por PET scan de 15O-água. As amostras de tecido podem ser coletadas diretamente da área de transferência gênica, comparando-se o coração com o mapa eletroanatômico. A expressão transgênica e a angiogênese terapêutica foram avaliadas por meio de análise imuno-histológica, analisando o número de células positivas após a coloração com Beta-galactosidase, e pela análise da área capilar miocárdica, após a coloração da molécula 1 de adesão plaquetária/célula endotelial.É importante confirmar a colocação do stent de gargalo por meio de angiografia e coleta de amostra da área de transferência gênica, o que pode ser confirmado comparando-se o coração com o mapa eletroanatômico. No geral, é crucial fazer todas as medições da maneira mais reprodutível.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Um método de transferência de genes para o tratamento da insuficiência cardíaca isquêmica é descrito usando um modelo de suínos de infarto do miocárdio. Nosso método simples e reprodutível nos permite facilmente avaliar a eficácia da transferência de genes diferentes com uma maneira muito simples e reprodutível.

Transferência de genes para insuficiência cardíaca isquêmica em um modelo pré-clínica

Este protocolo descreve o modelo suíno infarto do miocárdio (IM) usando um 90 min-peito fechado oclusão coronária balão da artéria descendente anterior esquerda (LAD), seguida de reperfusão. Além disso, o protocolo para vários parâmetros de resultados, tais como a função cardíaca, hemodinâmica, resistência microvascular e tamanho do infarto, também são apresentados.

Infarto do Miocárdio e Avaliação de Resultados Funcional em porcos

O propósito do presente protocolo é demonstrar a colocação de um dispositivo constringentes retardada (um ameroid constrictor) em torno de uma artéria coronária em um modelo de suíno. Este dispositivo cria uma área isquêmica do coração que é útil para estudar novas técnicas de diagnósticos de imagens e de novos métodos de tratamento.

Um modelo de isquemia cardíaca crônica em suínos, usando um Ameroid Constrictor

Aqui nós apresentamos um protocolo para a indução de cryoinjury ventricular esquerdo, seguido da implantação de um patch do músculo cardíaco, derivado de células iPS humana cardiomyocytes em um modelo de cobaia.

Implantação de Patches hiPSC-derivado do músculo cardíaco após lesão miocárdica em um modelo de cobaia

Aqui, nós descrevemos um modelo pré-clínico do grande-animal (porcine) da transplantação transplantação orthotopic do do coração que foi estabelecida firmemente e utilizada para investigar estratégias cardioprotetores novas.

Um modelo pré-clínico porcino de transplante cardíaco ortotópico

Buscamos estabelecer um modelo suíno de insuficiência cardíaca induzido pelo bloqueio da artéria circunflexo esquerda e ritmo rápido para testar o efeito e a segurança da administração intramiocárdia de células-tronco para terapias baseadas em células.

Estabelecendo um modelo suíno de insuficiência cardíaca pós-miocárdio para tratamento de células-tronco

Este protocolo visa transplantar um patch bioimpresso 3D no epicárdio de camundongos infartados modelando insuficiência cardíaca. Inclui detalhes sobre anestesia, abertura do tórax cirúrgico, ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) e aplicação de um patch bioimpresso na área infarto do coração.

Transplante de um Patch Bioimpresso 3D em um modelo murino de infarto do miocárdio

O presente protocolo descreve métodos de expressão transgênica em corações de ratos e camundongos por injeção intramiocárdica direta do vírus sob orientação ecocardiográfica. Métodos para a avaliação da suscetibilidade de corações a arritmias ventriculares pela estimulação elétrica programada de corações isolados, perfundidos por Langendorff, também são explicados aqui.

Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca

O presente protocolo descreve três métodos de administração de agentes terapêuticos cardioativos em modelo suíno. Suínas crioulas receberam tratamento através de: (1) toracotomia e injeção transepicárdica, (2) injeção transendocárdica por cateter ou (3) infusão intravenosa via minibomba osmótica da veia jugular.

Aplicação da Terapêutica Cardioativa em Modelo de Infarto do Miocárdio Porcino

O presente estudo demonstra um modelo animal altamente reprodutível de lesão aguda de isquemia e reperfusão miocárdica regional em coelhos, utilizando uma minitoracotomia esquerda para casos de sobrevida ou uma esternotomia mediana para casos de não sobrevida.

Modelo de Lesão de Isquemia e Reperfusão em Coelhos

Aprenda a avaliar a eficácia da terapia gênica em coração isquêmico utilizando um modelo animal de grande porte com ecocardiografia e angiografia coronária. Este método de baixa invasividade permite direcionamento preciso antes de ensaios clínicos.

Modelo animal de grande porte para avaliação da eficácia da terapia gênica em coração isquêmico

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