Modelo animal de grande porte para avaliação da eficácia da terapia gênica em coração isquêmico
2 de setembro de 2021
A terapia gênica miocárdica para cardiopatia isquêmica é uma grande promessa para futuras terapêuticas. Aqui, apresentamos um modelo animal de grande porte para avaliar a eficácia da terapia gênica no coração isquêmico.
Os métodos e modalidades de imagem utilizados neste protocolo constituem uma excelente imagem da segurança e eficácia da terapia gênica no coração isquêmico antes de se proceder aos ensaios clínicos. As principais vantagens dessa técnica são a baixa invasividade do modelo de isquemia, mas também o direcionamento preciso da terapia gênica para áreas hipocinéticas, mas ainda viáveis do coração. Comece realizando o ecocardiograma transtorácico antes da operação de isquemia, transferência de genes e eutanásia para avaliar qualquer líquido pericárdico detectável e determinar o estiramento miocárdico.
Colocar o transdutor no terceiro ou quarto espaço intercostal sob a axila do porco com um marcador apontando para o esterno do porco para acessar as incidências paraesternais do eixo curto ao nível da valva mitral, músculo papilar e níveis apicais. Em seguida, pressione adquirir para salvar um clipe. Para a realização da cineangiocoronariografia diretamente antes da operação de isquemia, utilizar cateter 6-F sob orientação fluoroscópica com contraste iodado para obtenção de imagens da artéria coronária direita, da artéria coronária ascendente esquerda e da artéria descendente anterior.
Para cine imaging no autoinjetor, defina a duração do bolus em três segundos e o volume total para 21 mililitros e, em seguida, pressione single, e sim para administrar o agente de contraste iodado no ventrículo esquerdo através de um cateter pigtail 5-F. Realizar cine imaging do animal em repouso e, em seguida, administrar dobutamina por via intravenosa e doses crescentes para a indução de estresse. Uma vez atingida a frequência cardíaca alvo de 160 batimentos por minuto, realiza cine imaging e remove o cateter pigtail.
Para calcular a fração de ejeção abra o software de medição, selecione a análise ventricular da imagem em questão. Role a imagem para selecionar um período de tempo, um em diástole e outro em sístole e, em seguida, selecione uma ferramenta para desenhar contornos ventriculares de cada período de tempo. Para induzir a isquemia miocárdica crônica, 14 dias antes da transferência gênica, colocar uma bobina na artéria coronária esquerda, deslizar o stent de gargalo para a artéria coronária esquerda e colocar o stent distalmente à primeira diagonal.
Inflar o stent à pressão nominal na artéria, utilizando um indeflator com relação stent/lúmen de 1,3 para ancoragem do gargalo. Após mais 15 segundos, esvaziar o stent, retrair o equipamento da artéria e garantir a colocação correta de um stent de gargalo por angiografia. Após angiografia e medidas funcionais sob orientação fluoroscópica, introduzir um cateter de mapeamento para o ventrículo esquerdo através da bainha femoral para mapeamento eletroanatômico, coletar pelo menos 100 pontos do ventrículo esquerdo e clicar em aceitar para aprovar um ponto.
No mapa final, para viabilidade, use uma tensão unipolar acima de cinco milivolts como critério. E para hipocinesia, selecione um encurtamento linear local o mais baixo possível, pelo menos tão baixo quanto 12%, mas de preferência abaixo de 6% Após a eutanásia do animal, retire o coração da cavidade torácica. Uma vez que o coração colhido é enxaguado, coloque uma agulha de calibre 18 acima da válvula aórtica e conecte a agulha a uma bomba de perfusão.
Perfundir o coração com 750 mililitros de paraformaldeído a 1%. Use uma faca afiada para cortar o coração em fatias de um centímetro de espessura e colete as amostras da área de transferência de genes em paraformaldeído a 4% e nitrogênio líquido. Armazenar as amostras para coloração em paraformaldeído a 4% durante 48 horas a quatro graus Celsius.
A eficácia da terapia gênica foi analisada medindo-se o estiramento circunferencial, a fração de ejeção e a perfusão miocárdica por PET scan de 15O-água. As amostras de tecido podem ser coletadas diretamente da área de transferência gênica, comparando-se o coração com o mapa eletroanatômico. A expressão transgênica e a angiogênese terapêutica foram avaliadas por meio de análise imuno-histológica, analisando o número de células positivas após a coloração com Beta-galactosidase, e pela análise da área capilar miocárdica, após a coloração da molécula 1 de adesão plaquetária/célula endotelial.
É importante confirmar a colocação do stent de gargalo por meio de angiografia e coleta de amostra da área de transferência gênica, o que pode ser confirmado comparando-se o coração com o mapa eletroanatômico. No geral, é crucial fazer todas as medições da maneira mais reprodutível.
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Visão Geral
Este artigo discute um modelo de animal grande para avaliar a eficácia da terapia gênica miocárdica na doença cardíaca isquêmica. Os métodos descritos fornecem informações sobre a segurança e eficácia da terapia gênica antes dos ensaios clínicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa cardiovascular
- Terapia gênica
- Doença cardíaca isquêmica
Antecedentes
- A terapia gênica miocárdica mostra potencial para o tratamento da doença cardíaca isquêmica.
- Modelos em animais grandes são essenciais para a avaliação pré-clínica.
- Compreender a eficácia da terapia gênica é fundamental antes dos ensaios em humanos.
- Baixa invasividade e direcionamento preciso são vantagens-chave dos métodos propostos.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a segurança e eficácia da terapia gênica em condições cardíacas isquêmicas.
- Estabelecer um modelo confiável em grandes animais para pesquisas futuras.
- Avaliar a deformação miocárdica e a detecção de líquido pericárdico.
Métodos Utilizados
- Ecocardiografia transtorácica para avaliar a deformação miocárdica.
- Angiografia coronariana utilizando um cateter de 6 F com orientação fluoroscópica.
- Uso de agente de contraste com iodo para imagem das artérias coronárias.
- Avaliação de áreas hipocinéticas, mas viáveis, do coração para direcionamento da terapia gênica.
Resultados Principais
- Demonstrou baixa invasividade do modelo de isquemia.
- Forneceram uma imagem clara da segurança e eficácia da terapia gênica.
- Identificaram estratégias eficazes de direcionamento para terapia gênica.
- Estabeleceram uma estrutura para futuros ensaios clínicos.
Conclusões
- A terapia gênica miocárdica possui potencial significativo para o tratamento da doença cardíaca isquêmica.
- O modelo desenvolvido é adequado para avaliação pré-clínica.
- Estudos adicionais são necessários para confirmar os achados em ambientes clínicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de animal de grande porte permite a avaliação pré-clínica da terapia gênica para doenças cardíacas isquêmicas ao replicar desfechos clinicamente relevantes e possibilitar o direcionamento preciso da angiogênese terapêutica. A abordagem reduz o risco translacional ao alinhar os resultados dos estudos em animais às expectativas dos ensaios em humanos por meio de avaliações padronizadas por imagem e funcionais. Oferece um arcabouço reprodutível para reduzir os riscos associados a candidatos à terapia gênica antes dos estudos habilitadores de IND.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses de angiogênese terapêutica em um modelo suíno de coração isquêmico relevante para a doença.
- Valor Operacional: Utiliza mapeamento eletroanatômico para direcionar com precisão a transferência gênica a regiões miocárdicas hipocinéticas, porém viáveis, melhorando a confirmação do alvo.
- Valor Preditivo: Avalia a eficácia por meio da deformação circunferencial, fração de ejeção e perfusão por PET com água marcada com 15O—desfechos quantitativos preditivos da resposta clínica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Estabelece protocolos padronizados para imagem por ultrassom, angiografia coronariana e tomografia por emissão de pósitrons (PET) para garantir leituras funcionais reprodutíveis entre diferentes coortes do estudo.
- Saídas Quantitativas: Gera dados mensuráveis de deformação miocárdica (strain), fração de ejeção e perfusão que apoiam a padronização do ensaio e a comparabilidade entre laboratórios.
- Escalabilidade: Permite sessões repetidas de imagem (basal, pós-isquemia, pós-transferência gênica), possibilitando avaliações longitudinais dentro de um único modelo animal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Simula a doença arterial coronariana crônica por meio de isquemia induzida por stent na artéria coronária esquerda, alinhando-se à fisiopatologia humana.
- Continuidade Translacional: Utiliza modalidades de imagem clinicamente aceitas (ecocardiografia, angiografia, PET) para conectar achados pré-clínicos ao desenho de ensaios clínicos.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite decisões de prosseguir ou interromper com base em limiares predeterminados de eficácia e segurança derivados de validação histológica e imagem multimodal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao fornecer validação funcional após a identificação do alvo e antes da otimização do composto líder, especialmente para candidatos à terapia gênica que exigem comprovação in vivo do mecanismo de ação.
- Biologia Descritiva: Apoia a verificação de hipóteses sobre fatores angiogênicos ao permitir a entrega direcionada e o monitoramento longitudinal da recuperação miocárdica.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de imagem (deformação, FE, perfusão) que permitem a avaliação comparativa de diferentes construtos de terapia gênica.
- Análises: Oferece fluxos de dados multimodais — imagem funcional, densidade capilar histológica e expressão de transgene — para avaliação integrada da eficácia.
- Pesquisa Translacional: Alinha desfechos pré-clínicos com medidas de ensaios clínicos, aumentando a confiança preditiva em abordagens de angiogênese terapêutica.
- Reutilização Institucional: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar múltiplos alvos de terapia gênica na doença cardíaca isquêmica, reduzindo a redundância no desenvolvimento de modelos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao associar a localização da transferência gênica (por meio do mapa eletroanatômico) à melhora funcional e ao crescimento de capilares no miocárdio viável, mas hipocinético.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de imagem, verificação do posicionamento do stent e coleta cega de amostras de tecido das zonas mapeadas de transferência gênica.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisão sobre continuidade ou interrupção do desenvolvimento ao exigir concordância entre recuperação funcional, ganhos de perfusão e angiogênese histológica antes de avançar para a próxima fase.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas de terapia gênica com base na eficácia pré-clínica em um modelo animal grande clinicamente preditivo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cirurgia de grandes animais, cardiologia intervencionista e mapeamento eletroanatômico para posicionamento preciso de stent e cateter.
- Depende do acesso a infraestrutura de imagem, incluindo ultrassom, fluoroscopia e escâneres de PET/TC capazes de realizar imagens de perfusão com água marcada com 15O.
- Necessita de procedimentos operacionais padronizados para indução de isquemia, transferência gênica e coleta multimodal de pontos finais, a fim de garantir a reprodutibilidade dos dados.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o modelo para outros modelos isquêmicos ou vetores de entrega gênica (por exemplo, virais versus não virais).
- É limitado pela necessidade de pessoal e equipamentos especializados, o que pode aumentar a complexidade e o custo do estudo em comparação com modelos em roedores.
Perguntas Frequentes sobre Biofarmácia
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Transthoracic Echocardiography
1:22
Coronary Angiography and Left Ventricle Cine Imaging Under Rest and Dobutamine Stress
2:39
Ischemia Operation
3:22
Gene Transfer
4:00
Sample Collection
4:41
Results: Assessment of Gene Therapy Efficacy
5:26
Conclusion
