Isolamento e Cultura In vitro de Macrófagos Derivados da Medula Óssea para o Estudo da Biologia NO-Redox
31 de maio de 2022
Este protocolo foi estabelecido para cultivar tetrahidrobiopterina (BH4)- e sintetizador de óxido nítrico indutível (iNOS)-deficiente macrófagos murinos para estudar biologia no-redox. O estudo tem como foco a redução da contaminação potencial do BH4 e de outros artefatos encontrados em métodos tradicionais de isolamento e cultura que podem confundir desfechos experimentais e interpretação dos resultados.
Este protocolo ajuda a criar macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes iNOS ou BH4 usando mídia e soro cuidadosamente definidos com baixos níveis de BH4 e nitrato para evitar interferências com mecanismos de redox. Controlando cuidadosamente os níveis de potenciais contaminantes no processo de cultura, podemos limitar a interferência de óxido nítrico, garantindo precisão e reprodutibilidade do sistema modelo. Este método permite medições precisas de biopterinas, óxido nítrico e quaisquer fatores a jusante relacionados a esses compostos essenciais.
Demonstrando o procedimento estará o Dr. Thomas Nichol, um pesquisador de pós-doutorado do nosso laboratório. Para começar, coloque as pernas em 70% de etanol por dois minutos para lavar qualquer pele ou resíduo. Em seguida, transfira as pernas para uma placa de Petri bacteriológica limpa e estéril.
Raspe cuidadosamente ao longo do comprimento dos ossos com a lâmina, cortando os tendões e removendo o músculo do osso. Uma vez que os ossos tenham sido limpos de músculo, corte a epífise no topo da tíbia, logo abaixo do joelho. A tíbia pode ser cortada na extremidade inferior, logo acima do cruzamento com a fíbula.
Finalmente, corte a epífise em cada extremidade do fêmur, logo após as articulações do joelho e quadril. Para lavar a medula óssea, encha uma seringa de 10 mililitros com 10 mililitros de PBS e anexe-a a uma agulha. Em seguida, insira a agulha na cavidade medular do osso.
Levemente alinhado com um a dois mililitros de PBS, executando a agulha para cima e para baixo. Em seguida, desenhe a suspensão cinco a dez vezes dentro e fora de uma seringa mililitro para desagregar. Colete a suspensão em uma seringa de um mililitro e passe-a através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo de centrífuga de 50 mililitros limpo.
Finalmente, coloque as amostras no gelo. Para congelar a medula óssea para uso posterior, centrifugar as células a 1000 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota vermelha em dois mililitros de anticongelante.
Em seguida, incubar-lo a 80 graus Celsius durante a noite. Se congelado, descongele a suspensão rapidamente a 37 graus Celsius. Transfira a suspensão da célula para um tubo limpo estéril contendo três mililitros de mídia DMEM/F-12.
Em seguida, pelota as células por centrifugação. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em três mililitros da mídia DMEM/F-12 preparada. Conte as células e as emplaque em plástico revestido não TC na mídia DMEM/F-12 preparada.
Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No quinto dia, alimente as células adicionando 50% do volume original de mídia DMEM/F-12. No sexto dia, estimule as células adicionando GM-CSF preparado a uma concentração final de 50 nanogramas por microliter diretamente à mídia de cultura celular.
No sétimo dia, remova toda a mídia das células. Em seguida, lave as células brevemente com PBS pré-aquecido e adicione mídia DMEM/F-12 contendo 2% de baixa endotoxina FBS, penicilina 1X ou estreptomicina, L-glutamina, 25 nanogramas por microliter M-CSF, e 50 nanogramas por microliter GM-CSF. Finalmente, incubar as células durante a noite na mídia para ativar os macrófagos ao fenótipo M0.
Para o fenótipo M1, estimule as células com 100 nanogramas por LPS microliter, e 10 nanogramas por microliter IFN-gama. Para o fenótipo M2, estimule as células com 100 nanogramas por microliter IL-4. Incubar as células durante a noite.
No oitavo dia, as células estão prontas para colheita ou processamento a jusante de acordo com as necessidades do pesquisador. A mídia suplementada com 10% de FBS tinha nitrito e tetrahidrobiopterina semelhantes, independentemente de M-CSF e GM-CSF, ou LCM. Mas os níveis totais de biopterina foram mais elevados na mídia suplementada de LCM.
No entanto, observou-se maior variabilidade entre diferentes lotes de LCM. PcR mostrou um produto de par de base 1030 em ratos do tipo selvagem, enquanto os ratos de nocaute GCH produziram um produto de par base 1392, confirmando a excisão dos exons críticos. O tratamento de tamoxifen aboliu a proteína GCH nas células eliminatórias.
As células de nocaute e controle ainda produziam iNOS, seguindo lps e estimulação IFN. BMDMs cultivados a partir de camundongos eliminatórios GCH condicional apresentaram tetrahidrobiopterina significativamente diminuída e diminuição do nitrito. As mesmas células cultivadas nos meios de LCM não tinham expressão GCH1.
No entanto, as células produzem quantidades significativas de tetrahidrobiopterina e nitrito após nocaute. No oitavo dia, não houve diferenças significativas na morfologia entre o controle não ativado e os BMDMs de nocaute de GCH em diferentes concentrações de Tamoxifen. Os BMDMs exibem as características esperadas de macrófagos não estimulados, com células aderentes redondas e extremidades alongadas.
Ao trabalhar com células primárias como esta, é imperativo esterilizar todos os tecidos e equipamentos completamente. Além disso, escolher a mídia e o suplemento certos é importante para manter um baixo óxido nítrico e ambiente BH4. Pelotas celulares e mídia podem ser usadas para várias aplicações a jusante, com foco no papel de óxido nítrico, biopterina ou estado de redox celular.
Pode incluir HPLC, qPCR e mancha ocidental, entre outros.
Visão Geral
Este protocolo descreve o cultivo de macrófagos murinos primários deficientes em tetrahidrobiopterina (BH4) e em óxido nítrico sintase induzível (iNOS). O foco está em minimizar contaminações e artefatos em métodos tradicionais de cultivo para aumentar a precisão experimental.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia Redox
Contexto
- Os macrófagos derivados da medula óssea são cruciais para o estudo da biologia do óxido nítrico.
- Métodos tradicionais de isolamento podem introduzir contaminantes que afetam os resultados.
- A seleção cuidadosa do meio é essencial para manter níveis baixos de BH4 e nitrato.
- Compreender os mecanismos redox é fundamental para resultados experimentais precisos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para o cultivo de macrófagos a partir de camundongos geneticamente modificados.
- Reduzir a interferência do óxido nítrico em modelos experimentais.
- Facilitar medidas precisas de biopterinas e óxido nítrico.
Métodos Utilizados
- Isolamento da medula óssea de camundongos deficientes em iNOS ou BH4.
- Uso de meio definido com baixos níveis de BH4 e nitrato.
- Cultura celular e estimulação para obtenção dos fenótipos M0, M1 e M2.
- Análise dos níveis de biopterina e óxido nítrico por meio de diversos ensaios.
Resultados Principais
- Condições controladas de cultivo resultaram em modelos reprodutíveis de macrófagos.
- Diferenças significativas nos níveis de biopterina e nitrito foram observadas em células knockout em comparação com células controle.
- A morfologia celular manteve-se consistente entre diferentes tratamentos.
- A ativação eficaz de macrófagos foi alcançada por meio da estimulação específica com citocinas.
Conclusões
- O protocolo fornece um método robusto para o estudo da biologia redox do NO.
- Manter níveis baixos de contaminantes é essencial para resultados precisos.
- Aplicações futuras podem incluir várias análises downstream relacionadas ao óxido nítrico e à biopterina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o controle preciso do ambiente redox do óxido nítrico em culturas primárias de macrófagos, abordando um desafio fundamental na pesquisa de imunometabolismo e doenças inflamatórias. Ao minimizar componentes indefinidos que interferem nas medições de BH4 e NO, ele sustenta estudos mecanicistas reprodutíveis, essenciais para a validação de alvos em programas de imuno-oncologia e doenças autoimunes. O uso de modelos geneticamente definidos e meios definidos aumenta a confiança preditiva nos fluxos de trabalho iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de sinalização redox mediadas por NO em macrófagos, utilizando modelos deficientes em BH4 e iNOS, para reduzir os riscos associados a hipóteses terapêuticas.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade experimental decorrente de soro e meios condicionados não definidos, melhorando a reprodutibilidade dos ensaios entre laboratórios.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece um modelo padronizado de macrófago para triagem de compostos que modulam a produção de óxido nítrico ou o metabolismo de biopterina.
- Valor Operacional: Permite leituras quantitativas, como níveis de nitrito e biopterina, por meio de CLAE, possibilitando análise de resposta à dose na triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o estudo de mecanismos imunometabólicos em sistemas relevantes para doenças, conectando a função imune inata à biologia redox.
- Valor Operacional: Permite a validação consistente de fenótipos (M0, M1, M2) mediante estimulação definida por citocinas, apoiando a reprodutibilidade em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho iniciais de descoberta ao fornecer uma fonte confiável de macrófagos primários para análise de interação com alvos e de vias metabólicas antes da identificação do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a redução de riscos mecanicistas de vias dependentes de NO na inflamação mediada por macrófagos e na regulação imunológica.
- Triagem: Oferece um sistema celular reprodutível para avaliar os efeitos de compostos sobre os níveis de óxido nítrico e cofatores redox.
- Análises: Permite a quantificação precisa de biopterina e nitrito, biomarcadores-chave para avaliar a modulação de alvos em vias sensíveis ao estado redox.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro à continuidade pré-clínica por meio da ativação de macrófagos e caracterização de fenótipos consistentes.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo da imunometabolismo e mecanismos redox em diversas áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista na sinalização relacionada ao óxido nítrico e à biopterina.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e escalabilidade por meio de meios definidos e modelos genéticos, minimizando a variabilidade entre lotes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer dados confiáveis sobre a modulação da via-alvo em células fisiologicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos que visam vias imunometabólicas e inflamatórias.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de células primárias, manipulação estéril de tecidos e técnicas de cultivo de macrófagos.
- Depende do acesso a modelos de camundongos geneticamente modificados (por exemplo, deficientes em GCH) e equipamentos para lavagem da medula óssea e filtração celular.
- Necessita de preparação padronizada de meio com baixos níveis de BH4 e nitrato para manter o controle experimental.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o protocolo a outras fontes de macrófagos ou condições de estimulação.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de reagentes livres de endotoxinas e titulação cuidadosa de citocinas para evitar superativação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation of Bone Marrow Cells
2:14
Selection, Differentiation, and Stimulation of BMDMs
4:24
Results: Comparison of Nitrite and Tetrahydrobiopterin Levels in Media Supplemented with LCM or Recombinant GM-CSF and M-CSF
5:54
Conclusion
