Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Este protocolo permite que os pesquisadores usem proficientemente um detector de quimiluminescência para a medição de metabólitos de óxido nítrico sem a orientação ou a despesa de empregar pessoal dedicado no local. O ensaio baseado em chemiluminescência é o método mais sensível para detectar alterações mínimas nos níveis de óxido nítrico e seus metabólitos em qualquer amostra biológica. Óxido nítrico inalado é um gás terapêutico usado para uma grande variedade de doenças.

É crucial que a progressão e a recuperação da doença estejam correlacionadas com precisão com os níveis de metabólito de óxido nítrico. Óxido nítrico inalado, um antimicrobiano, mostra promessa no tratamento de pacientes com doenças infecciosas das vias aéreas. O método de chemiluminescência fornece uma visão sobre a correlação da dose de óxido nítrico e seus metabólitos com alterações microbiológicas e fisiofiológicas.

Para preparar a solução DETA-NONOate, adicione 10 miligramas de DETA-NONOate a 610 microlitres de hidróxido de sódio de 10 milimônios em PBS de pH 7.4 para gerar 100 mililitros de DETA-NONOate e mantê-lo no gelo. Para prosseguir, conecte a linha de oxigênio ao detector de quimiominascência e abra o tanque de oxigênio a uma pressão de acordo com as instruções do fabricante fornecidas no texto. Em seguida, conecte a linha de filtro dielétrico de campo intenso ao detector de quimiluminescência.

Na interface do detector de chemiluminescência, comece a executar o programa de detecção de ensaios de fase líquida, garantindo que o fornecimento de oxigênio seja adequado e que o detector comece a amostragem, indicando a detecção por sinal em milívolos, caso contrário, solicitará um sinal de diagnóstico negativo. Para preparar o vaso de purga, feche o recipiente de purga nas três portas, parafusando totalmente a válvula da agulha à direita e fechando os galos de entrada e saída. Remova a tampa do vaso de purga.

Adicione uma quantidade suficiente do reagente específico ao ensaio planejado à câmara de reação para que a agulha de seringa usada para injetar as amostras possa atingir a coluna de fluidos enquanto verifica a presença de uma linha de base estável e desejada. Para iniciar o fluxo de gás de purga, certifique-se de que o tanque de gás inerte esteja equipado com um regulador de dois estágios, e conecte o tanque de gás inerte com a entrada de gás do navio. Em seguida, abra a saída do navio de expurgo e abra o gás com uma pressão de saída no regulador de um a cinco libras por polegada quadrada.

Em seguida, abra a entrada do recipiente de purga e abra lentamente a válvula de agulha do vaso de purga para permitir a entrada de gás e verificar borbulhar dentro do vaso de purga. Para ajustar o fluxo de gás, registre a pressão celular medida pelo detector de quimiluminescência com a linha de filtro dielétrico de campo intenso amostrando ar ambiente. Reposicione a tampa no recipiente de purga e conecte a linha de filtro dielétrico de campo intenso ao vaso de purga.

Use a válvula da agulha para atingir a mesma pressão celular no nível do detector de quimiominascência que é registrado no ar ambiente. Para iniciar o programa de aquisição de sinal de chemiluminescence, conecte a porta serial do detector de quimiominascência à porta serial do computador na qual o programa de aquisição foi instalado. Então, execute o programa de análise.

Clique em Adquirir e selecione a pasta para salvar o arquivo de dados, digite o nome do arquivo e clique em Salvar. Enquanto se prepara para a injeção de amostra, ajuste a escala de tensão na tela para ter controle sobre a linha de base direcionada clicando nos botões mínimos e/ou máximos e, em seguida, digitando o valor desejado. Para realizar a injeção amostral, enxágue a seringa pelo menos duas vezes ou mais com água desionizada e destilada antes de retirar cada amostra, e garantir uma ejeção de água desobstruída em uma limpeza de tarefa.

Em seguida, insira a seringa no tubo de amostra enquanto segura a seringa e o tubo a uma distância próxima e puxe o êmbolo para o volume desejado, garantindo que nenhuma bolha de ar ou partes sólidas não homogeneizadas fiquem presas. Limpe a ponta da seringa com um limpador de tarefas e insira a seringa na tampa do setter na porta de injeção. Depois de verificar se a ponta da seringa está dentro da fase líquida, injete a amostra na câmara de reação.

Para marcar a injeção no programa de software, digite o nome da amostra clicando na caixa cinza em Nomes de Amostra e clique em Mark Injection enquanto verifica se a injeção causa uma mudança para cima no sinal ou para baixo no consumo de óxido nítrico pelo ensaio de hemoglobina livre de células. A relação de resposta à dose entre hemoglobina livre de células e consumo de óxido nítrico foi medida através da chemiluminescência após bypass cardiopulmonar. Pode-se supor que há uma alta concentração de grupos de heme no estado oxidado limpando óxido nítrico.

Em pacientes que recebem óxido nítrico durante o bypass cardiopulmonar, em vez disso, a maioria dos grupos de heme é reduzida e não consome óxido nítrico. Medições da concentração de hemoglobina livre de células indicaram uma eliminação lenta do plasma dentro de 12 horas após o bypass cardiopulmonar. No entanto, o consumo de óxido nítrico atingiu o pico em 15 minutos e não refletiu a eliminação da hemoglobina livre de células.

As curvas de regressão linear do consumo de óxido nítrico por hemoglobina livre de células apresentaram prevalência de hemoglobina oxidada e nitric que consome óxido em 15 minutos, em oposição à hemoglobina mais reduzida na linha de base 4 horas e 12 horas de bypass pós-cardiopulmonar. Foram monitorados os efeitos da administração de gás óxido nítrico no consumo de óxido nítrico. Quando os pacientes foram tratados com gás óxido nítrico intra e pós-operatório, o aumento observado da hemoglobina livre após o bypass cardiopulmonar não foi associado a qualquer aumento no consumo de óxido nítrico.

Os resultados indicaram que o óxido nítrico exogenou a administração reduziu a maior parte da hemoglobina livre e impediu a limpeza de óxido nítrico. O experimento só é válido se todas as condições permanecerem as mesmas. Se a altura do nível líquido exceder a coluna de reação, devemos parar e conduzir uma nova calibração.