Name: Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda a usar ensaios de quimiluminescência para detectar óxido nítrico e seus metabólitos em amostras biológicas. Este método altamente sensível permite correlacionar níveis de óxido nítrico com progressão de doenças.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os protocolos relatados neste manuscrito foram possíveis pelas contribuições acumuladas de bolsistas anteriores do laboratório de Pesquisa de Anestesia em Cuidados Críticos do Dr. Warren Zapol. Reconhecemos a contribuição dos Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli e Emanuele Rezoagli.

L.B. recebe apoio salarial da K23 HL128882/NHLBI NIH como principal investigador por seu trabalho em hemólise e óxido nítrico. A LB recebe bolsas de "Bolsas Rápidas para pesquisa COVID-19" no Mercatus Center da Universidade George Mason e na iNO Therapeutics LLC. A B.Y. é apoiada por subsídios de uma NHLBI/#R21HL130956 e do DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. recebeu patentes na MGH sobre a geração elétrica de óxido nítrico.
L.B. e B.Y. registraram pedido de patente para não entrega no número de solicitação pct da doença COVID-19: PCT/US2021/036269 arquivado em 7 de junho de 2021. A RWC recebe apoio salarial da Unitaid como principal pesquisadora para o desenvolvimento tecnológico voltada para o diagnóstico descentralizado da tuberculose em crianças localizadas em ambientes de baixo recurso.

Devido à alta sensibilidade, ensaios baseados em chemiluminescência para a determinação de NO e compostos relacionados têm alto risco de contaminação nº2. Cada reagente (especialmente a solução de bloqueio NO 2) e dilutante (incluindo ddH2O) usado no experimento devem ser testados para seu conteúdo NO 2 para corrigir o sinal de fundo. O nitrito é extremamente reativo com meia-vida em sangue inteiro em torno de 10 minutos e rapidamente gera NO<su...

Desde que Os ganhadores do Salvador Moncada e do Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro e Ferid Murad identificaram o óxido nítrico (NO) como o anteriormente conhecido fator de relaxamento derivado da endotelia (EDRF), o papel central do NO foi estabelecido em vários mecanismos-chave que abrangem toda a biologia vascular, neurociências, metabolismo e resposta ao hospedeiro 1,2,3,4,5,6,7 . A administração exógena do GÁS NO tornou-se um tratamento estabelecido para insuficiência respiratória devido à hipertensão pulmonar no recém-nascido8. O gás óxido nítrico também tem sido investigado para o tratamento da infecção pelo vírus sincicial respiratório (RSV), malária e outras doenças infecciosas, lesão de isquemia-reperfusão e para prevenção de lesão renal aguda em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca 9,10,11,12. A necessidade de técnicas precisas de medição para avaliar os níveis de NO, seus metabólitos e os de suas proteínas e compostos-alvo surge tanto de estudos mecanicistas quanto intervencionistas.
Devido à sua alta reatividade, a NO pode sofrer reações diferentes dependendo da matriz biológica em que é produzida e/ou liberada. Na ausência de hemoglobina (Hb) ou outras hemoproteínas de oxi, a NO é oxidada quase completamente ao nitrito (NO2-).
2NO + O2 → 2NO2
NO2 + NO → N2O3
N2O3 + H2O → NO2- + H+
O NO primeiro sofre autoxidação com oxigênio molecular (O2) para produzir dióxido de nitrogênio (NO2) e reage com o próprio NO2 para gerar trióxido de dinitrogen (N2O3). Uma molécula de N2O3 reage com água (H2O) para formar duas moléculas de NO2- e um próton (H+)13. Dentro de sangue inteiro14,15, NO e NO2- são rapidamente convertidos em nitrato (NO3-) como essas moléculas reagem avidamente com os grupos de heme oxidado de Hb [Hb-Fe2+-O2 ou oximosoglobina (oxicodona)] para produzir NO3-. Esta reação é associada à transição do grupo heme para o estado férrico [Hb-Fe3+ ou methemoglobina (metHb)]:
HB-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-
A barreira das células vermelhas do sangue (RBC) e o espaço imediatamente adjacente ao endotélio são os principais fatores que limitam essa reação e permitem que uma pequena porção do NO liberada pelo endotélio atue como EDRF16,17. Na verdade, o Hb livre de células na circulação é conhecido por interromper a vasodilatação em ambientes experimentais e clínicos17,18. Dentro da RBC, dependendo da oxigenação e da concentração NO2, uma porção de NO reage com desoxihemoglobina (Hb-Fe2+) para formar ferro-nitrosol Hb (Hb-Fe2+-NO ou HbNO):
HB-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO
Na RBC15,17, o NO2- pode formar o Hb-Fe3+ reduzindo o Hb-Fe2+ levando ao lançamento do NO, que por sua vez liga o Hb-Fe2+-O2 (preferencialmente) ou o Hb-Fe2+.
A geração de no-derivados não deve ser considerada estritamente unidirecional, pois o NO pode ser regenerado a partir de NO2- e NO3- em vários tecidos e por diferentes enzimas (por exemplo, por bactérias intestinais ou dentro das mitocôndrias, particularmente sob condições hipoxicas)19,20.
Uma quantidade variável de NO produzido (ou administrado) leva à geração a jusante de S-nitrosothiols, principalmente por transinrose de thiol a partir de N2O3 na presença de um nucleófilo criando um intermediário doador NO+ (Nuc-NO+-NO2-):
N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-
Outra possibilidade para a geração de S-nitrosothiols é a nitrosiagem de tiais oxidados (NÃO reage com um tiol oxidado):
RS• + NO → RS-NO
Este mecanismo e oxidação direta de thiol pelo NO2 só podem ser possíveis em condições muito específicas que são descritas em outros lugares21. Os s-nitrosothiols variam de moléculas leves como S-nitrosoglutathione a grandes proteínas que contêm tiol. A s-nitrosohemoglobina (S-NO-Hb) é formada por nitrosão de um grupo de tiol de um resíduo de cisteína conservado na cadeia de β (β93C)22.
A geração e o metabolismo dos S-nitrosothiols fazem parte de importantes mecanismos regulatórios. Exemplos incluem regulação de glutathione, caspases, N-metil-D-Aspartato (NMDA) e receptores de ryanodo 23,24,25,26,27,28. Anteriormente considerado como um grande mediador da NO biology in vivo, a albumina nitrosa (S-nitroso-albumina) parece ser um transportador NO/NO+ sem qualquer atividade biológica adicional específica29.
Ao medir a concentração de NO e seus derivados de uma amostra biológica específica dentro de uma matriz biológica, é importante considerar características como acidez, oxigenação, temperatura e presença de reagentes. Exemplos incluem doadores exógenos administrados NO e, no cenário de inflamação aguda, peróxido de hidrogênio (H2O2) reagindo com o NO2 levando à geração de concentração supernormal de radicais livres como a peroxitorita (ONOO-)21. Além do método analítico que é empregado, a fase pré-analítica da preparação e armazenamento da amostra é fundamental. Reações a jusante que não representam a atividade in vivo NO devem ser previstas, consideradas e bloqueadas. Um exemplo válido é a instabilidade do S-NO-Hb, que exige um tratamento dedicado de amostras de sangue quando é direcionado para a medição22.
Ensaios baseados em chemiluminescência são o padrão-ouro para detectar os níveis de NO e seus principais metabólitos [NO2-, NO3-, S-NO e complexos ferro-nitrosol (Fe-NO)] em qualquer fluido biológico, incluindo homogeneiza tecidos30,31. Esses métodos dependem do detector de chemiluminescência (CLD), um dispositivo que abriga a reação de NO com ozônio (O3), gerando o Nº2 em estado animado (NO2•). Relaxamento do NO2• causa emissão de um fóton de luz detectado por um tubo fotomultiplier, gerando um sinal elétrico diretamente proporcional ao teor NO da mistura de gás amostrado32. Um esquema simplificado do CLD está representado.
<img alt="Configuração de quimioluminescência: reação de NO + O₃ a NO₂*; tubo fotomultiplicador; O diagrama exibe a emissão óptica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Esquema simplificado de um detector de quimiluminescência para gás óxido nítrico. A detecção baseada em óxido nítrico (NO) é a geração estequiométrica de uma molécula de gás NO que é introduzida no detector de quimiominascência (CID). A reação de chemiluminescência é obtida em uma câmara designada fornecida com ozônio (O3) de um gerador interno, que é mantida em pressão negativa por conexão com uma bomba externa, permitindo entrada contínua e constante de gás amostral. A geração de O3 requer oxigênio diatômico (O2) que é fornecido por um tanque O2 dedicado conectado com o CLD (outros fabricantes fornecem CLDs operando com ar ambiente). Dentro da câmara de reação, cada molécula de gás NO contido no gás amostrado reage com oxigênio para produzir uma molécula de dióxido de nitrogênio no estado ativado (NO2*). Ao retornar ao seu estado terrestre, cada molécula NO2* emite um fóton que é detectado por um tubo fotomultiplier (PMT) localizado ao lado da câmara de reação. O TPM com o amplificador associado e unidade de processamento central produz um sinal proporcional à contagem de fótons e ao número de nenhuma molécula na câmara de reação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A entrada amostral do CLD pode ser conectada a um sistema de vidro contendo uma câmara de reação para amostras líquidas. O sistema é continuamente purgado com um gás inerte como nitrogênio, hélio ou argônio, transferindo NÃO da câmara de reação para o CLD. Amostras de fase líquida são injetadas através de uma membrana dedicada no vaso de purga.
<img alt="Diagrama de aparelhos químicos, ilustrando o fluxo de gás em um recipiente de purga com luva de PTFE, armadilha de NaOH." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Estrutura de um vaso de purga para detecção baseada em óxido nítrico à base de quimiotrica O vaso de purga (à direita) permite a detecção de gás óxido nítrico (NO) ou qualquer outro composto que possa ser facilmente convertido em nenhum gás quando liberado de um reagente de fase líquida. A entrada de gás inerte está conectada a uma fonte (tanque) de um gás inerte como Argon, Xeon ou nitrogênio diatômico (N2). A válvula da agulha (abre à esquerda) é usada para controle de pressão dentro do vaso de purga e pode ser completamente removida para limpar o vaso. A porta de injeção é coberta por uma tampa com um septo de membrana para injeção de amostra. A membrana deve ser substituída com frequência. Uma jaqueta aquecida envolve a câmara de reação e é conectada a um banho de água quente para realizar o teste VCl3 em HCl. A saída do vaso de purgação está conectada ao detector de quimiominascência (CLD) ou à armadilha NaOH (necessária para vcl3 em ensaios HCl). Para drenar o conteúdo da câmara de reação, primeiro feche as torneiras na entrada de gás inerte e a saída do vaso de purga, feche a válvula da agulha, remova a tampa no porta de injeção e, finalmente, abra a torneira no ralo. A armadilha NaOH (esquerda) é necessária para ser colocada em linha entre o vaso de purga e o CLD se o ensaio VCl3 em HCl for realizado devido à corrosão do HCL. A conexão com o CLD sempre requer um filtro de campo intenso (IFD) a ser colocado entre o CLD e a saída do vaso de purga (ou a armadilha NaOH, se usado). O filtro IFD remove partículas aéreas e impede que o líquido passe pelo vaso de purga. PTFE = politetrafluoroetileno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como consequência, qualquer composto que possa ser convertido em NÃO através de uma reação química específica e controlada pode ser detectado com alta sensibilidade em qualquer fluido biológico e homogeneizar tecido24. A medição direta da fase de gás NO através da chemiluminescência é realizada tanto em ambientes experimentais quanto clínicos. Essas técnicas são amplamente descritas em outros lugares 33,34,35. A medição de NO2-, S-nitrosothiols, proteínas S-nitrosated e Fe-NOs pode ser realizada adicionando amostras em uma mistura de reação com triiodeto (I3-), que não libera gás estelioetricamente de todos esses compostos:
I3- → I2 + I-
2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O
I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+
2NO+ + 2I− → 2NO + I2
enquanto eu3- não reage com o NO 3-15. Medições precisas de cada composto são possíveis pelo pré-tratamento de alíquotas amostrais com sulfanilamida acidificada (AS) com ou sem cloreto mercúrico (HgCl2). Especificamente, o pré-tratamento com AS remove todo o conteúdo NO 2. Como consequência, o conteúdo NO medido pelo CLD reflete apenas a soma da concentração de S-NOs e Fe-NOs. A injeção de HgCl2 em uma alíquota de amostra antes da injeção de AS faz com que o NO2- seja liberado pelo S-NO. O tratamento com AS (levando à remoção nº2) garante que o teor de NÃO medido só reflete a concentração de Fe-NOs. Uma série de subtrações entre as avaliações permitem calcular a concentração precisa dos três derivados NO22.
<img alt="Diagrama de análise bioquímica sequencial com etapas de mistura de reagentes, incubação e medição de compostos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Etapas na preparação da amostra para o ensaio i3- em ácido acético quemiluminescence. Os passos sequenciais para a preparação do ensaio i3- em ácido acético chemiluminescence são ilustrados. É necessário o uso de tubos de centrífuga protegidos pela luz. Os tubos 1, 2 e 3 são os usados para se preparar para o ensaio. Outra alíquota de amostra (tubo 4) é necessária para o ensaio VCl3 em HCl se for necessária a medição do nitrato (NO3-). As etapas são indicadas por números em vermelho. Pré-preenchimento (Passo 1) conforme indicado com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) ou HgCl2 antes de adicionar o volume amostral. Adicione o volume amostral (2) conforme indicado, vórtice e incubar por 2 minutos à temperatura ambiente (RT). Adicionar (3) PBS ou sulfanilamida acidificada (AS) conforme indicado,vórtice e incubar por 3 min no RT. Execute o ensaio (4). A concentração medida pelo ensaio é a soma da concentração dos compostos relatados sob cada tubo. O tubo número 1 permitirá medições de nitrito (NO2-), S-nitrosothiols (S-NO) e complexos ferro-nitrosilo (Fe-NOs) como um único sinal. Para a medição do nitrato (NO3-), as amostras devem ser executadas com i3- em ácido acético e VCl3 em ensaios de HCl, e o valor obtido a partir do tubo 1 deve ser subtraído do obtido do tubo 4. *Quantidades sugeridas a serem utilizadas para análise de Hb para determinação de resíduos NO2-, S-nitrosohemoglobina e ferro-nitrosibina-hemoglobina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para a medição Nº3, o cloreto de vanádio (III) (VCl3) em ácido clorídrico (HCl) é usado para conversão de NO3- a NO no vaso de purga, a fim de medir o nº3- estequiometricalmente com o CLD:
2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+
Para conseguir uma conversão suficientemente rápida, a reação precisa ser realizada a 90-95 °C. A redução de NO3- para NO2- é associada à redução de NO2- para NO por HCl. O metal vanadium também reduz os S-NOs liberando seu NO moiety22,36. A concentração final obtida pelo CLD com VCl3 em HCl reflete a concentração agregada de NO3-, NO2 e outros compostos nitrosados. A subtração do último valor da concentração rendeda com CLD com I3- permite o cálculo de Nº3- concentração36,37 (Figura 3).
No ensaio de consumo NO, a liberação contínua de NÃO no recipiente de purga por NENHUM doador como (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolato (DETA-NONOato) gera um sinal estável permitindo quantificar oxiHb sem células nas amostras injetadas. A quantidade de NÃO consumida no vaso de purga está em uma relação estequiométrica com a quantidade de oxicodona na amostra38.
Protocolos para medição de NO2-, NO3-, S-nitrosothiols, complexos ferro-nitrosilo e NO consumo por Hb livre de células em amostras de plasma são ilustrados. Estudos sobre NÃO no ambiente RBC requerem tratamento amostral específico seguido de cromatografia de exclusão para medir s-no-hb e hb-no extremamente frágeis, juntamente com a determinação da concentração total de Hb15,22. A preparação da amostra é fundamental na correção da medição. A pré-existência do NO2- em H2O e liberação do Nº2- durante o ensaio pode levar à medição de concentrações artificialmente maiores de nenhum derivado, como o S-NO-Hb14,39. Aspectos importantes da preparação da amostra também são apresentados.

<table><tbody><tr><td>Ácido Acético</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 mL - líquido</td></tr><tr><td>Antiespumante B Emulsão</td><td>Sigma</td><td>A5757</td><td>250 mL - líquido</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x) sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ácido Clorídrico 37% (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 mL - líquido</td></tr><tr><td>Iodo</td><td>SAFC</td><td>207772</td><td>100 g - sólido</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Mercúrio (II) Cloreto ACS reagente> 99,5%</td><td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - sólido (dissolver em água)</td></tr><tr><td>Sistema de Purificação de Água Mili-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelo 705 RN 50 &mu; L seringa</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>Microlitro</td></tr><tr><td>modelo 802 N 25 &mu; Seringa L</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>Seringa de microlitro</td></tr><tr><td>N-etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td>25 g -</td></tr> analisador <tr><td>de óxido nítrico cristalino + pacote de software - Recipiente de purga</td><td>Detector de quimioluminescência</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 mL</td></tr><tr><td>de hexacianoferrato de potássio (III) ACS reagente&ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g - pó</td></tr><tr><td>de iodeto de potássio ACS reagente> 99%</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g - cristal sólido</td></tr><tr><td>de nitrito de potássio. Para análise EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td>105067</td><td>250 g - cristalino</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Homogeneizador Mecânico</td></tr><tr><td>RV3 Bomba de palhetas rotativas de dois estágios</td> Bomba de vácuo <td>Edwards</td><td>A65201906</td><td>- Empacotada com analisador</td></tr><tr><td>Heparina sódica - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 unidades USP</td></tr><tr><td>Reagente ACS anidro de hidróxido de sódio &ge; 97%</td><td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - pellets</td></tr><tr><td>Nitrato de sódio ACS reagente &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - pó</td></tr><tr><td>Nitrito de sódio &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g -</td></tr><tr><td>sulfanilamida cristalina &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - sólido</td></tr><tr><td>Cloreto de vanádio (III) Sigma</td><td></td><td>112393</td><td>25 g - sólido - Cuidado (exotérmico)</td></tr><tr><td>Papel de Filtro Whatman 1</td><td>Sigma</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de autoxidação e compostos nitrosated

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

A atividade de óxido nítrico (NO) in vivo é o resultado combinado de seus efeitos diretos, a ação de seus derivados gerados a partir da autoxidação no no, e os efeitos dos compostos nitrosos. Medir metabólitos NO é essencial para estudar nenhuma atividade tanto em níveis vasculares quanto em outros tecidos, especialmente nos ambientes experimentais onde o NO exógeno é administrado. Os ensaios de chemiluminescência à base de ozônio permitem medições precisas de metabólitos NO e NO em ambos os fluidos (incluindo plasma, homogeneizadores de tecido, culturas celulares) e misturas de gás (por exemplo, respiração exalada). NÃO reage com ozônio para gerar dióxido de nitrogênio em um estado animado. A consequente emissão de luz permite a fotodetecção e a geração de um sinal elétrico refletindo o teor NO da amostra. Alíquotas da mesma amostra podem ser usadas para medir metabólitos não específicos, como nitrato, nitrito, S-nitrosothiols e complexos ferro-nitrosilo. Além disso, o NO consumido pela hemoglobina livre de células também é quantificado com a análise de quimiluminescência. Uma ilustração de todas essas técnicas é fornecida.

O ensaio de Não-consumo por Hb livre de células foi utilizado em amostras contendo concentrações conhecidas de oxicodona livre de células (Figura 4). Como um heme de oxyHb stoichiometricamente libera uma molécula NO no ensaio, o oxyHb purificado sem células é usado para construir a curva de calibração para o ensaio (Figura Suplementar 3).
A relação dose-resposta entre hb livre de células (medida com um assiiz colorimétrico) e NO consumo em pacient...

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Este protocolo permite que os pesquisadores usem proficientemente um detector de quimiluminescência para a medição de metabólitos de óxido nítrico sem a orientação ou a despesa de empregar pessoal dedicado no local. O ensaio baseado em chemiluminescência é o método mais sensível para detectar alterações mínimas nos níveis de óxido nítrico e seus metabólitos em qualquer amostra biológica. Óxido nítrico inalado é um gás terapêutico usado para uma grande variedade de doenças.É crucial que a progressão e a recuperação da doença estejam correlacionadas com precisão com os níveis de metabólito de óxido nítrico. Óxido nítrico inalado, um antimicrobiano, mostra promessa no tratamento de pacientes com doenças infecciosas das vias aéreas. O método de chemiluminescência fornece uma visão sobre a correlação da dose de óxido nítrico e seus metabólitos com alterações microbiológicas e fisiofiológicas.Para preparar a solução DETA-NONOate, adicione 10 miligramas de DETA-NONOate a 610 microlitres de hidróxido de sódio de 10 milimônios em PBS de pH 7.4 para gerar 100 mililitros de DETA-NONOate e mantê-lo no gelo. Para prosseguir, conecte a linha de oxigênio ao detector de quimiominascência e abra o

chemiluminescence-based-assays-for-detection-nitric-oxide-its

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aqui nós propor métodos simples para testar e avaliar a presença de espécies reativas de oxigênio nas células.

Produção e Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) em Câncer

A produção endógena de óxido nítrico (NO) regula uma grande variedade de funções biológicas. Está se tornando cada vez mais claro que a ruptura ou desregulagem de sinalização NO base está envolvida em muitas doenças humanas. Os métodos para quantificar relevante metabólitos podem fornecer novos biomarcadores de diagnóstico ou de prognóstico para a doença humana.

Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico

NADPH oxidase é a principal fonte de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em fagócitos. Por causa da natureza efêmera de ROS, é difícil de medir e monitorar os níveis de ROS em animais vivos. Um método minimamente invasivo para quantificação de série de ROS em ratos vivos é descrito.

Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais

Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil adaptados usando o corante de fluorescência diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) para en face detecção simultânea e visualização de óxido nítrico intracelular (NO) e ânion superóxido (O 2 .- ), respectivamente, em aortas isoladas de fresco intactas de um modelo de rato de obesidade.

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Este protocolo descreve uma nova técnica de imagem intraoperatória que usa um complexo de rutênio como fonte de emissão de luz quimioluminescente, produzindo assim altas relações sinal-ruído durante a imagem in vivo. A imagem intraoperatória é um campo em expansão que pode revolucionar a forma como os procedimentos cirúrgicos são realizados.

Uma nova técnica para gerar e Observing Quimioluminescência em um ambiente Biológica

O óxido nítrico (NO) é uma importante molécula de sinalização na homeostase vascular. A produção de NO in vivo é muito baixa para medição direta. A quimioluminescência fornece informações úteis sobre o ciclo de NO por meio da medição de seus precursores e produtos de oxidação, nitrito e nitrato. A determinação de nitrito / nitrato nos tecidos e fluidos do corpo é explicada.

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Este manuscrito apresenta protocolos para a aplicação de novas sondas de óxido nítrico (NO•) geneticamente codificadas (geNOps) para monitorar flutuações de NO• de célula única em tempo real usando microscopia de fluorescência. A formação de NO• desencadeada por Ca2+ no nível de células endoteliais individuais foi visualizada combinando geNOps com um sensor químico de Ca2+.

Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais

Apresentamos protocolos para três métodos diferentes para a homogeneização de quatro diferentes grupos musculares de tecido muscular esquelético de ratos para medir e comparar os níveis de nitrato e nitrito. Além disso, comparamos diferentes pesos amostrais para investigar se o tamanho da amostra tecidual afeta os resultados da homogeneização.

Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito

A captação de mudanças dinâmicas na ativação proteica de hemácias enucleadas apresenta desafios metodológicos, como a preservação de alterações dinâmicas em estímulos agudos para posterior avaliação. O protocolo apresentado descreve técnicas de preparo e coloração de amostras que permitem a preservação e análise de alterações proteicas relevantes e posterior detecção.

Detecção de Alterações Dinâmicas em Proteínas Eritrocitárias Baseadas em Imunomarcação

Este protocolo descreve um método para quantificar a produção de óxido nítrico (NO) em culturas epiteliais das vias aéreas diferenciadas na interface ar-líquido (ALI), medindo nitrito em secreções apicais usando um ensaio de quimioluminescência baseado em triiodeto.

Medição da produção de óxido nítrico em culturas celulares epiteliais traqueais de camundongos diferenciadas na interface ar-líquido

Aprenda a usar ensaios de quimiluminescência para detectar óxido nítrico e seus metabólitos em amostras biológicas. Este método altamente sensível permite correlacionar níveis de óxido nítrico com progressão de doenças.

Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Explorar mais vídeos