Name: Tecidos pulmonares projetados preparados a partir de fatias pulmonares descelularizadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a criar tecidos pulmonares projetados a partir de fatias descelularizadas, repovoando-as com células epiteliais alveolares tipo 2, fibroblastos e células endoteliais. Este método oferece flexibilidade para pesquisas em engenharia tecidual.

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Os autores gostariam de agradecer a Lorenzo Sewanan e Jorge Nunez por seu trabalho desenvolvendo o projeto de fita de cultura tecidual usado neste protocolo, o laboratório Kaminski para o uso de seu vibratome, Maurizio Chioccioli e Jessica Nouws por assistência com o corte pulmonar, Allie LaRocco para assistência com experimentos piloto iniciais, e Hong Qian para leitura cuidadosa do protocolo. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH F30HL143880 (K.L.L.), o Programa de Treinamento de Cientistas Médicos Grant T32GM136651 (K.L.L.) e U01HL145567 (L.E.N.); e por um presente de pesquisa irrestrito da Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. é um fundador e acionista da Humacyte, Inc, que é uma empresa de medicina regenerativa. Humacyte produz vasos sanguíneos projetados a partir de células musculares aogenéticas lisas para cirurgia vascular. O cônjuge de L.E.N. tem equidade em Humacyte, e L.E.N. atua no Conselho de Administração da Humacyte. L.E.N. é uma inventora de patentes licenciadas para Humacyte e que produzem royalties para L.E.N. L.E.N. recebeu um presente de pesquisa irrestrito para apoiar a pesquisa em seu laboratório em Yale. Humacyte não influenciou a conduta, descrição ou interpretação dos achados deste relatório.

Este artigo descreve o uso de fatias pulmonares descelularizadas cortadas com precisão como uma plataforma para gerar tecidos pulmonares projetados in vitro, que contêm estruturas alveolares de várias linhagens. Ao combinar estratégias que desenvolvemos anteriormente para repovoar andaimes pulmonares Acellulares ECM de alta fidelidade para toda a engenharia pulmonar22,31, com nosso sistema robusto para cultivar tecidos cardíacos projetados em pequena escala30, este protocolo permite o uso de ECM pulmonar fisiologicamente relevante como um substrato de cultura tecidual, de forma repetível e moderadamente de rendimento.
Os métodos aqui apresentados detalham a preparação do andaime ELT de pulmões de ratos, que são facilmente alcançáveis, podem ser extraídos em bloco com acesso direto às vias aéreas intactas para a inflação de ágarose, e são de tamanho maior do que o pulmão do rato. No entanto, qualquer tecido pulmonar que possa ser inflado com agarose e produzir fatias de pelo menos 9 mm de comprimento pode ser usado dentro deste sistema. Independentemente da fonte de tecido, a inflação uniforme do tecido pulmonar com agarose é o passo mais crítico para garantir o sucesso do corte de tecido a jusante, recorte e manuseio de tecidos. O tecido pulmonar subinflado tende a não cortar limpo, enquanto o tecido superinflado pode rasgar durante o recorte. Após a gelação de agarose, regiões de tecido apropriadamente infladas são firmes, mas fornecem um pouco de dar quando suavemente pressionadas com fórceps. Para pulmões de ratos intactos, descobrimos que pré-inflar os pulmões extraídos com ar várias vezes, seguido pela inflação de agarose o mais rápido possível após a extração, resulta nos melhores resultados de corte e melhor qualidade dos andaimes de tecido resultantes. O volume adequado de agarose precisa ser otimizado empiricamente; para um pulmão de rato o volume necessário para inflar o pulmão para a capacidade pulmonar total é de aproximadamente 30 mL/kg de massa animal (por exemplo, 10,5 mL agarose para pulmões de um rato de 350 g). Para tecidos pulmonares ressecados maiores com acesso menos simples das vias aéreas (como os de doadores humanos), alguns problemas adicionais podem ser necessários para inflar o tecido através de um brônquio32. Durante o corte pulmonar subsequente, a seleção e orientação do tecido no êmbolo é outro passo importante para 1) garantir que as fatias sejam grandes o suficiente para gerar tiras de tecido que podem ser cortadas em de cultura tecidual e 2) maximizar a área de tecido parenchímal (alveolar), excluindo grandes vias aéreas ou vasos.
Cortar o PCLS em fitas de cultura tecidual pode ser um passo desafiador inicialmente, mas as fitas simplificam muito o manuseio de tecidos durante a descelularização e semeadura. Dois problemas potenciais que podem surgir são a ruptura tecidual (seja durante o processo de corte, ou durante a descelularização), ou o posicionamento tecidual nos clipes que resulta em má semeadura a jusante (por exemplo, sem semeadura ou semeadura apenas nas extremidades). Rasgar pode ser o resultado da superinflação agarose, alongamento excessivo do tecido durante a inserção da guia, ou deixar muito pouca saliência para fornecer aderência adequada do tecido ao inserir as abas. Note que fatias que rasgam em uma extremidade de clipe podem ser semeadas com sucesso, no entanto, elas são difíceis de visualizar sob o microscópio durante a cultura, pois o tecido não é plano. A semeadura de tecido ruim (como a da Figura 6C) é provavelmente o resultado da fatia não deitada plana entre os dois clipes, e assim fazendo contato ruim com a base do banho de semeadura bem quando virado de cabeça para baixo. Outra possível causa é o assento inadequado do no fundo do banho de semeadura. Em termos de recorte, aplique um pouco mais de tensão no tecido ao colocar o segundo clipe para ajudá-lo a ficar liso. Algumas fatias têm uma leve concavidade; nestes casos, corte a fatia com o lado convexo para cima. Com a prática, normalmente experimentamos semeaduras com menos de 2% de fatias.
Uma limitação deste protocolo é a exigência de que alguns equipamentos especializados - um cortador a laser e uma impressora 3D - gerem os materiais iniciais para a preparação do ELT. No entanto, uma vez que as fitas de cultura tecidual e banhos de semeadura são criados, nenhum material especial adicional é necessário. As etapas de corte e descelularização pulmonar da preparação do andaime ELT são moderadamente demoradas; no entanto, essas etapas podem ser realizadas com antecedência, ou em números suficientes para se preparar para múltiplos experimentos ao mesmo tempo. Muitos PCLS (>100 se otimizando para regiões parenchymal) podem ser cortados de um único pulmão e congelados por snap para uso posterior. Embora um único ciclo de congelamento possa causar pequenos danos ultraestruturais ao ECM46, mesmo vários ciclos de congelamento foram demonstrados para não causar uma perda significativa no ECM 23,47. O PCLS também pode ser cortado e descelularizado antes de um experimento, a ser usado dentro de um mês. (Notavelmente, o protocolo de descelularização descrito pode ser realizado em aproximadamente 6 horas, o que representa uma vantagem significativa em relação aos métodos descritos anteriormente que requerem um dia ou maisde 27,28.) Uma vez que os andaimes são preparados, o processo de semeadura celular é simples e rápido, e a cultura dos ELTs não requer técnicas especializadas.
Uma ressalva do método ELT descrito é a falta de semeadura específica da região, ou seja, a entrega de AEC2s especificamente ao espaço alveolar, ou células endoteliais especificamente ao espaço vascular. No entanto, embora as células sejam simplesmente semeadas em cima dos andaimes de tecido, o padrão de recelularização não é aleatório, com alguma aparência de organização alveolar, incluindo anéis epiteliais. Suspeitamos que as interações célula-célula, bem como diferenças locais na composição e geometria do ECM20,21, provavelmente contribuem para os padrões de recelularização observados. Em apoio a essa hipótese, um estudo publicado anteriormente, no qual os fibroblastos foram semeados não especificamente em fatias pulmonares descelularizadas, demonstrou que o padrão de repopulação tecidual e fenótipos celulares associados variaram significativamente por região de tecido microscópico e fonte de andaime ECM (por exemplo, saudável versus doente)27. Também foram observados fibroblastos para invadir o interstício - local onde residem no tecido pulmonar nativo 1,27. O método alternativo primário que podemos imaginar para cultivar células em fatias pulmonares de uma maneira verdadeiramente específica da região implicaria semear pulmões intactos descelularizados através das vias aéreas31,48 e compartimentos vasculares 49,50, e, em seguida, cortar o tecido recelularizado. No entanto, essa alternativa 1) é significativamente mais econômica, de tempo e de recursos; 2) é menor rendimento; 3) requer aumento do número de animais; e 4) está associada a um risco aumentado de contaminação devido aos desafios de toda a cultura pulmonar e posterior fatiamento do pulmão semeado. Embora não recapitulando todos os aspectos da organização celular nativa, a plataforma ELT permite a cultura das células pulmonares em um substrato ECM fisiologicamente relevante, de uma maneira acessível a muitos outros laboratórios.
A flexibilidade do sistema ELT é uma grande vantagem desta plataforma, e deve permitir a cultura de tecido pulmonar em pequena escala com qualquer número de andaimes de tecido, células ou meios de cultura de interesse. O uso de andaimes derivados de tecido doente ou de modelos de lesões pode permitir o estudo de interações célula-célula ou matriz celular no cenário de ECM alterado pela doença 27,29,51. No entanto, note que o protocolo de descelularização pode precisar ser adaptado para explicar as diferenças matricial entre as espécies52. A estratégia de semeadura descrita pode ser usada para qualquer tipo de célula, e a linha do tempo da cultura adaptada para atender às necessidades do pesquisador. Como ponto de partida, 1 x 106 células por andaime devem produzir um tecido altamente celular dentro de 7 dias de cultura, enquanto 1 x 105 células totais resultam em má celularidade. Em qualquer adaptação da linha do tempo, as fitas de cultura tecidual devem ser removidas do banho de semeadura 24 h após a última semeadura tecidual. Aqui, com o objetivo de modelar um pouco da complexidade celular do alvéolo pulmonar, descrevemos uma estratégia de recelularização tricultura que apoia a manutenção de AEC2s neonatais bem diferenciados em estruturas alveolares por pelo menos 7 dias. Nossos resultados também demonstram o enxerto bem-sucedido tanto de fibroblastos quanto de células endoteliais dentro dos ELTs, enfatizando a ampla aplicabilidade do substrato cultural e sua adequação para estudos de cocultura. A semeadura de células adultas em ELTs pode facilitar a modelagem de estruturas alveolares mais quiescentes, enquanto a semeadura de AEC2s derivadas de PSC humanos, incluindo aquelas com modificações genéticas, poderia facilitar estudos translacionais da doença humana13,53. Em geral, a abordagem de baixo para cima habilitada pela plataforma ELT apresenta a oportunidade de investigar as contribuições de determinados tipos de células para leituras de interesse - como o estado de proliferação ou diferenciação do AEC2.
Em resumo, este protocolo descreve um sistema robusto para a geração de tecidos pulmonares projetados para estudos de co-cultura de AEC2s, fibroblastos e células endoteliais dentro de andaimes de fatia pulmonar Acellular ECM. Os ELTs representam uma nova estratégia de cultura 3D para AEC2s primários, que até hoje dependem de matrizes menos fisiológicas do tipo gel para manter um fenótipo bem diferenciado 6,11,12. A plataforma atual baseia-se em trabalhos anteriores na repopulação de fatias pulmonares descelularizadas 24,25,26,27,28,29, mas oferece várias vantagens: 1) um sistema de de cultura tecidual para facilitar o manuseio de ELT durante a descelularização, semeadura e cultura; 2) um banho de semeadura personalizado para semear precisamente um número conhecido de células em cada andaime de fatia; e 3) uma estratégia de ressedação de três culturas que permite a repopulação do tecido alveolar com células epiteliais, mesenquimais e endoteliais. Assim, os ELTs representam um importante passo em frente para a criação de modelos in vitro reprodutíveis que capturam a complexidade celular e substrato do alvéolo nativo e do nicho de células-tronco AEC2.

Alvéolos são as unidades funcionais do pulmão distal, compreendendo uma malha de espaços aéreos de troca de gás forrados por células epiteliais alveolares tipo 1 (AEC1s) e células tipo 2 (AEC2s). Por trás do epitélio está uma densa rede de capilares, bem como apoiando mesenchyme, tudo apoiado por um andaime de matriz extracelular (ECM) que fornece força e flexibilidade a esses delicados sacos de ar1. Os alvéolos também são o local de lesão em inúmeras patologias pulmonares, incluindo fibrose pulmonaridiopática 2, síndrome de angústia respiratória aguda3 e doença coronavírus grave-19 (COVID-19)4. Embora o trabalho na última década tenha descoberto uma notável plasticidade dentro do epitélio pulmonar, os mecanismos que permitem a reparação pulmonar distal em alguns cenários - e que impedem a reparação em outros - permanecem uma área de intensa investigação5. O desenvolvimento de plataformas in vitro aprimoradas para modelar o alveolus facilitaria estudos de biologia alveolar, regeneração e terapêutica.
AEC2s auto-renovam e diferenciam-se em AEC1s, sendo, portanto, considerada a célula-tronco primária do pulmão distal 6,7,8. No entanto, essas células representam um desafio particular ao estudo in vitro, dadas as dificuldades associadas à cultura de AEC2s primários sem a perda do fenótipo9. Na cultura 2D convencional bidimensional(2D), os AEC2s achatam e adotam algumas características das células semelhantes a AEC110. Em contraste, as estratégias de cultura 3D, mais comumente organoides, apoiam a manutenção de características diferenciadas em AEC2sprimários 6,11,12 e permitem cultura de longo prazo de células-tronco pluripotentes (PSC) derivadas AEC2s 13,14. Os organoides têm sido usados para modelar o desenvolvimento pulmonar distal15, infecção viral11,15 e doença genética relacionada ao AEC2 13,16,17, permitindo insights importantes sobre a biologia e regeneração AEC2. No entanto, esses modelos de cultura normalmente compreendem apenas uma ou duas linhagens celulares, e incorporam as células em matrizes do tipo gel que não conseguem recapitular a arquitetura ou o substrato ECM do alvéolo pulmonar nativo.
O ECM é um regulador crítico do fenótipo celular e comportamento através de pistas moleculares, topológicas e mecânicas; compreende um componente-chave de nichos específicos do tecido que regulam o destino das células-tronco; e serve como um reservatório que modula a disponibilidade de fatores de crescimento secretos localmente 18,19,20,21. As células de cultivo no ECM nativo podem, assim, aumentar a capacidade preditiva de sistemas in vitro para modelar a biologia dos tecidos in vivo. A descelularização, processo que remove material celular de tecidos através de detergentes, enzimas ou métodos físicos ou outros, pode preservar em grande parte o andaime ECM de um órgão nativo, quando cuidadosamente realizado22,23. Esses andaimes podem ser repovoados com células para cultura biomimética 3D. No entanto, embora os andaimes descelularizados sejam amplamente utilizados para aplicações de engenharia de tecidos, seu uso para a cultura celular rotineira tem sido limitado. Vários estudos anteriores relataram a descelularização e recelularização de fatias pulmonares ou pequenos segmentos de tecido pulmonar. Além de estudos de prova de conceito 24,25,26, fatias pulmonares repovoadas têm sido utilizadas para estudar a adesão da matriz fibroblasto27,28 e investigar o efeito de matriz pulmonar doente no fenótipo27,29 do fibroblasto. Com tecnologias aprimoradas disponíveis para a geração de fatias de tecido cortadas com precisão, as fatias pulmonares descelularizadas poderiam oferecer uma plataforma conveniente e de pequena escala com a qual as células de cultura, preservando as subestruturas alveolares, as vias aéreas e vasculares. A incorporação de vários tipos de células permitiria estudos de interações célula-células dentro de um ambiente 3D fisiologicamente relevante. No entanto, estratégias aprimoradas são necessárias para facilitar o manuseio de tecidos durante todo o processo cultural, e para garantir a semeadura controlada e reprodutível de tecidos com número conhecido de células.
Aqui, apresentamos um protocolo para gerar tecidos pulmonares projetados (ELTs) repovoando fatias pulmonares descelularizadas cortadas com precisão (PCLS) com células endoteliais primárias, AEC2s e fibroblastos. Em uma adaptação do nosso sistema de tecido cardíaco projetado anteriormente30 e estratégias inteiras de descelularizaçãopulmonar-recelularização pulmonar 22,31, descrevemos procedimentos para cortar o PCLS de pulmões de ratos e cortar as fatias em fitas de cultura de tecido reutilizável que simplificam e padronizam manipulações a jusante. As fatias cortadas são descelularizadas para formar andaimes ECM acelulares, que são repovoados em banhos personalizados de semeadura. Os andaimes de fatia pulmonar preservam componentes e arquitetura eCM críticos e suportam o crescimento de AEC2s dentro de estruturas alveolares de várias linhagens por pelo menos 7 dias. Os ELTs representam um novo sistema de cocultura alveolar dentro de uma matriz 3D fisiologicamente relevante, que deve apoiar o desenvolvimento de estratégias de engenharia de tecidos pulmonares, ao mesmo tempo em que facilita estudos biológicos básicos de AEC2s e alvéolos.

<table><tbody><tr><td>Impressora 3D: Form 2</td><td>Formlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>8-Bromo cAMP</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, UltraPure LMP</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Encaixe de redutor farpado, 3/8 polegada x 1/4 polegada</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K271</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease de benzonse</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) Fração V</td><td>Gemini</td><td>700-104P</td><td>Para meio de crescimento AEC2</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA), grau padrão</td><td>Gemini</td><td>700-100P</td><td>Para tampão de benzonase</td></tr><tr><td>Válvula de retenção, polipropileno, barb de mangueira de 1/8 de polegada</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-98553-10</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>PeproTech</td><td>2520691</td><td></td></tr><tr><td>Clear Resin, 1 L</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato, como Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td><td>Qualquer hardware, artesanato ou farmácia</td><td>KG483 ou similar</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td></td><td>Sigma D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (baixa glicose)</td> <td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glicose alta)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de DNA (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Kit EdU (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td><td>Invitrogen</td><td>C10340</td><td>Usado de acordo com as instruções do fabricante</td></tr><tr><td>Cotovelo de encaixe, 3/8 polegada</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K907</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS), caracterizado</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Gemini</td><td>400-100P</td><td>Reconstituído em diH2O para uma solução estoque a 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Máquina de cortar cabelo</td> Solução salina balanceada <td>Wahl</td><td>MiniArco</td><td></td></tr><tr><td>Hank (HBSS), sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Injeção de heparina sódica, USP, 1000 U/mL</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400-30</td><td>Para injeção intraperitoneal e intracardíaca</td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>Para perfusão da artéria pulmonar; prepare a solução estoque a 100 U/mL em PBS</td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Conexão em T em linha, 3/8 polegada x 1/8 polegada</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K851</td><td></td></tr><tr><td>Alça de inoculação, descartável</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-600</td><td></td></tr><tr><td>Insulina do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Injeção de cetamina, 100 mg/mL</td><td>Covetrus (Butler Animal Health)</td><td>010177</td><td></td></tr><tr><td>KGF, humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>100-19</td><td></td></tr><tr><td>Cortador a laser, VLS 3.50 30 watts</td><td>Universal Laser Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock, fêmea, 3/32 polegada</td><td>Cole-Parmer</td><td>45508-02</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock, macho, 1/8 polegada</td><td>Cole-Parmer</td><td>30800-24</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock, macho, 1/4 polegada</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K146</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131 Completo sem soro</td><td>VEC Technologies</td><td>MCDB-131 WOFBS</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2), 1 M</td><td>AmericanBio</td><td>AB09006-00100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>American Bioananalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado salino (PBS), sem Ca2+ e Mg2+, 10X</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>Reconstituir para 1X com diH2O</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS), com Ca2+ e Mg2+</td><td>Gibco</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>PDMS - Kit de Elastômero de Silicone SYLGARD 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (10,000 U/mL penicilina/10,000 &mu; g/mL estreptomicina)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, 150 mm</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Filme plástico (parafilme)</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tubo BPT com braço, LS 16</td><td>Masterflex</td><td>06508-16</td><td></td></tr><tr><td>Tubo BPT com braço, LS 17</td><td>Masterflex</td><td>06508-17</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone curado com platina, LS 14</td><td>Masterflex</td><td>96420-14</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone curado com platina, LS 16</td><td>Masterflex</td><td>96420-16</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone curado com platina, LS 36</td><td>Masterflex</td><td>96410-36</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td><td>Almofadas</td> de preparação de povidona/iodo Sigma <td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>, 10%</td> Folha de PTFE <td>1108</td><td></td> <td>da Dynarex Corporation</td></tr><tr><td>, 0,060 polegadas (1/16 polegada) de espessura</td><td>ePlastics</td><td>PTFENAT0.060X12X12</td><td>Para abas de de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Folha de PTFE, 0,093 polegadas (3/32 polegadas) de espessura</td><td>ePlastics</td><td>PTFENAT0.093X12X12</td><td>Para quadros e clipes de de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Acionamento da bomba peristáltica: Masterflex L/S Acionamento Digital de Velocidade Variável</td><td>Cole-Parmer</td><td>ZM-07528-30</td><td></td></tr><tr><td>Cabeça da bomba peristáltica: Masterflex L/S Easy-Load II Cabeça da bomba</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-77202-60</td><td></td></tr><tr><td>Rat, Sprague Dawley</td><td>Charles River</td><td>Código de cepa: 400</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Qualquer loja de ferragens ou artesanato</td><td>Personna 94-120-71 ou similar</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas rotativas, 28 mm</td><td>Omnigrid</td><td>2046</td><td></td></tr><tr><td>Cortador rotativo, 28 mm</td><td>Olfa</td><td>Modelo 9551</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio (SDC)</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Nitrorusside de sódio (SNP)</td><td>Torneira Sigma</td><td>71778</td><td></td></tr>, sutura <tr><td>Edwards</td><td>594WSC</td><td></td><td>de 4 vias</td></tr><tr><td>, polipropileno monofilamento 4-0</td> Seringa <td>Covidien</td><td>VP-557-X</td><td></td></tr><tr>, seringa <td>de 302995</td><td></td><td>BD</td><td>de 10</td></tr><tr><td>mL, 309653 BD de 50</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>mL<td>Placa de cultura de tecidos, 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos, 6 poços</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr>Placa de cultura de tecidos <td>Falcon</td><td>353043</td><td></td>Transferrin humano de<td>12 poços</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Tris, solução 1 M, pH 8.0</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02025-00500</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td><td>Precisionary Instruments LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina, 100 mg/mL</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-4022-1</td><td></td></tr><tr><td>Conector Y, 1/16 polegada farpado</td><td>Cole-Parmer</td><td>30614-43</td><td></td></tr></tbody></table>

tecidos pulmonares projetados preparados a partir de fatias pulmonares descelularizadas

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Há necessidade de modelos pulmonares tridimensionais (3D) melhorados que recapitulem a complexidade arquitetônica e celular do alvéolo-de-pulmão nativo ex vivo. Modelos organoides recentemente desenvolvidos facilitaram a expansão e o estudo de progenitores epiteliais pulmonares in vitro, mas essas plataformas normalmente dependem de matriz e/ou soro derivados de tumores do rato, e incorporam apenas uma ou duas linhagens celulares. Aqui, descrevemos um protocolo para geração de tecidos pulmonares projetados (ELTs) baseado na recelularização multi-linhagem de fatias pulmonares descelularizadas cortadas com precisão (PCLS). Os ELTs contêm estruturas alveolares que compreendem epitélio alveolar, mesenquime e endotélio, dentro de um substrato de matriz extracelular (ECM) que se assemelha intimamente ao do pulmão nativo. Para gerar os tecidos, os pulmões de ratos são inflados com agarose, fatiados em fatias de 450 μm de espessura, cortados em tiras e descelularizados. Os andaimes Acellular ECM resultantes são então ressegados com células endoteliais primárias, fibroblastos e células epiteliais alveolares tipo 2 (AEC2s). Os AEC2s podem ser mantidos na cultura ELT por pelo menos 7 dias com um meio de crescimento quimicamente definido e livre de soro. Durante todo o processo de preparação e cultura do tecido, as fatias são cortadas em um sistema de fita que facilita o manuseio e a semeadura celular padronizada de múltiplos ELTs em paralelo. Esses ELTs representam uma plataforma de cultura organotípica que deve facilitar investigações de interações célula-célula e matriz celular dentro do alveolus, bem como sinais bioquímicos que regulam os AEC2s e seu nicho.

Uma visão geral do processo para gerar ELTs - compreendendo corte pulmonar, recorte de fatias e descelularização e repopulação de andaimes - é apresentada na Figura 3. Os ELTs aqui apresentados foram cultivados usando células endoteliais microvasculares primárias pulmonares (ver Tabela de Materiais), aC2s de rato neonatal e fibroblastos neonatais de rato enriquecidos com lipofibroblast36. Os AEC2 foram recentemente isolados por meio de classificação baseada em contas magnéticas, como descrito anteriormente37; protocolos alternativos de isolamento foram detalhados e discutidos em outros lugares 38,39,40. A pureza dos AEC2s de ratos isolados pode ser avaliada através de citometria de fluxo para o marcador de superfície AEC2 específico para ratos RTII-7041, ou através da coloração de uma amostra celular citocentrifada para RTII-70 ou proteína pro-surfactante C (pSPC). Os fibroblastos pulmonares de ratos foram isolados do pós-natal 7-9 filhotes de ratos de acordo com uma adaptação de um protocolo publicado42 e usado na passagem 1-2; protocolos alternativos de isolamento foram descritos em outros lugares43,44. A pureza de fibroblastos isolados pode ser avaliada através da coloração de células cultivadas ou citocentrifadas para vimentina de marcador mesenquimal, e o enriquecimento lipofibroblast pode ser avaliado através de coloração para Óleo Vermelho O45.
Quando o tecido pulmonar é uniformemente inflado com agarose, e peças de tecido estrategicamente selecionadas e orientadas para o corte, de modo a maximizar a área total e parenchímal do tecido, um pulmão de rato pode produzir tecido para elts &gt;100 alveolares. As tiras de PCLS exibem integridade mecânica suficiente para serem cortadas em fitas de tecido com poucos (&lt;5%) casos de rasgo (Figura 3B).
O protocolo para descelularizar as fatias pulmonares baseia-se de perto no nosso protocolo de descelularização pulmonar anteriormente publicado, que por proteômica quantitativa foi demonstrado para preservar muitos componentes de ECM em níveis não significativamente diferentes daqueles no pulmão nativo22. Andaimes descelularizados preservam a arquitetura nativa dos alvéolos, como visto pela coloração de hematoxilina e eosina (Figura 4A,B) e por microscopia de contraste de fase (Figura 4C). Normalmente excluímos andaimes contendo grandes vias aéreas ou vasos (Figura 4D) ou lágrimas, embora o primeiro possa ser incluído se forem de interesse do pesquisador. A descelularização leva a uma redução de 96% no conteúdo de DNA tecidual medida por um ensaio para DNA de dupla derivação (ver Tabela de Materiais; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg em tecido nativo vs descelularizado, respectivamente, média ± SEM) (Figura 5A), sem DNA visível pela coloração de hematoxiclina (Figura 4B). A coloração histológica e imunofluorescente de andaimes descelularizados revela a manutenção de proteínas ECM colágeno, elastina, colágeno IV e laminina com arquitetura e quantidade semelhante à das fatias pulmonares nativas (Figura 5B-E). Observe que os núcleos de tecidos nativos mancham manchas azul/preto com trichome (para colágeno) e EVG (para elastina). A coloração imunofluorescente foi realizada como descrito anteriormente, utilizando métodos padrão para coloração de tecidos37. Os anticorpos utilizados e suas respectivas concentrações estão listados na Tabela 4.
A repopulação bem-sucedida leva a ELTs altamente celulares após 7 dias, com um padrão de repopulação alveolar visível pela microscopia de luz (Figura 6A-C). Em alguns casos, com uma celularidade muito alta, estruturas do tipo organoide podem ser visíveis (Figura 6A,B). A semeadura de tecido mal sucedida pode ser visualizada por microscopia de contraste de fase durante a cultura (Figura 6C). Após a cultura de andaimes teciduais com AEC2s, fibroblastos e células endoteliais, os ELTs são densamente repovoados com estruturas alveolares que compreendem todas as três linhagens celulares (Figura 6D,E). No dia 7 ou 8, os AEC2 mantêm a morfologia cuboidal e a proteína surfactante expressa-B (SPB) e a proteína corporal lamelar ABCA3, sem evidência de diferenciação significativa aos AEC1s (Figura 6E,F). Os AEC2s são altamente proliferativos em ELTs, como demonstrado pela incorporação de 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU) após um pulso de 2 h a 10 μM (Figura 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de sistema de perfusão para extração e limpeza pulmonar. (A) O sistema de perfusão compreende um membro movido à gravidade, utilizado para a cannulação inicial da artéria pulmonar sob fluxo; e um membro movido a bomba, usado para limpar os pulmões eficientemente após a cannulação inicial. A linha da bomba inclui um "amortecedor de pulso" que amortece os picos de pressão causados pela bomba. O desenho das cânulas arterials traqueais e pulmonares é detalhado à esquerda. SNP = nitroprusside de sódio. (B) Detalhes do conjunto do amortecedor de pulso. BPT e silicone referem-se a tipos de tubulação. (C) Posições de cânulas arterials traqueais e pulmonares colocadas durante a extração pulmonar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Figura 2: Cronograma cultural para recelularização de tri-linhagem. Cronograma proposto para semeadura e cultura de três linhagens, incluindo o tempo de semeadura em duas fases. São indicados números celulares para semeadura e meio de cultura para cada fase. Veja os detalhes da mídia cultural na Tabela 3. AEC2 = célula epitelial alveolar tipo 2. EC = célula endotelial. FB = fibroblasto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Figura 3: Esquema de preparação de tecido pulmonar projetado. (A) Tecido pulmonar nativo é cortado em fatias usando um vibratome. (B) As fatias pulmonares cortadas com precisão são cortadas em tiras padronizadas de 3 mm de largura, cortadas em fitas de cultura tecidual (PTFE) politetrafluoretileno (PTFE) e detergente-decelularizada para produzir andaimes de matriz extracelular acelular. (C) Os andaimes são ressecados em banhos especializados de semeadura que limitam a área de semeadura à área do tecido e, em seguida, cultivados em uma placa de poço padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Figura 4: Estrutura de andaimes pulmonares descelularizados. Manchas de H&amp;E de fatias pulmonares nativas (A) e descelularizadas (B) mostrando preservação da arquitetura alveolar após a descelularização. (C,D) Exemplos de andaimes ECM descelularizados vistos em 5x de ampliação por microscopia de contraste de fase, compreendendo tecido predominantemente alveolar (C) ou contendo grandes vias aéreas e vasos ramificados (D, cabeças de flecha pretas e ruivas). Barras de escala, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Figura 5: Remoção de DNA e preservação de matriz em andaimes pulmonares descelularizados. (A) Quantificação do DNA em fatias pulmonares nativas e descelularizadas (média ± SEM, n = 5). Teste de welch , **P &lt; 0,01. Decell = descelularizado. (B,C) Mancha histológica de fatias pulmonares nativas e descelularizadas para colágeno (B) e elastina (C). Pontas de flecha, elastina preservada em anéis de entrada alveolar de tecido descelularizado. (D,E) Coloração imunofluorescente de fatias pulmonares nativas e descelularizadas para colágeno IV (D) e laminina (E). Barras de escala, 50 μm. Em todos os painéis, as caixas pontilhadas delineiam a região da imagem que é ampliada à direita em cada painel respectivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Figura 6: Repopulação celular de tecidos pulmonares projetados. (A-C) Exemplos de ELTs recelularizados no 7º dia da cultura, conforme visualizado durante a cultura por microscopia de contraste de fase. O padrão de recelularização espelha a estrutura alveolar do tecido. Em algumas áreas de alta celularidade, estruturas organoides podem se formar (pontas de flecha). (A) e (B) representam repopulação celular bem sucedida, enquanto (C) representa um baixo nível de recelularização após 7 dias de cultura. (D-G) Mancha de ELTs recelularizados no dia 7 ou 8 da cultura. (D) Manchas de H&amp;E mostrando repopulação celular da septa alveolar. (E) Etiquetas de coloração imunofluorescentes engrafadas proCollagenIα1+ fibroblastos, AEC2s ABCA3+ e células endoteliais CD31+ . (F) Os tecidos contêm AEC2s SPB+ abundantes, mas poucos RTI-40 (podoplanin)+ AEC1s nessas condições. (G) Muitos AEC2s estão proliferando em ELTs, medidos pela incorporação da EdU. Barras de escala, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Soluções de descelularização. Detalhes de preparação para soluções de descelularização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 2: Protocolo de descelularização. Detalhes do protocolo para descelularizar fatias pulmonares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 3: Mídia cultural. Detalhes de preparação para mídia de crescimento endotelial e AEC2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 4: Anticorpos usados para imunossuagem. Detalhes de anticorpos e suas concentrações usadas para imunossuagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Arquivo complementar 1: Projeto para estruturas de fita de cultura de corte a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo complementar 2: Projeto para clipes de fita de cultura de tecido de corte a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo complementar 3: Projeto para abas de de cultura de tecido de corte a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo complementar 4: Arquivo CAD para semeadura base de molde de banho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo complementar 5: Arquivo CAD para semeadura de anel de mofo de banho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

Este protocolo descreve um método para gerar tecidos pulmonares projetíveis, de pequena escala, repovoando fatias pulmonares descelularizadas cortadas com células epiteliais tipo 2 alveolares, fibroblastos e células endoteliais.

Tecidos pulmonares projetados preparados a partir de fatias pulmonares descelularizadas

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Este protocolo permite o uso repetível de matriz extracelular pulmonar intacta como um substrato de cultura tecidual tridimensional e rendimento moderado. A principal vantagem do sistema de tecido pulmonar projetado é a flexibilidade da plataforma. Os ELTs podem ser adaptados para usar vários andaimes de tecido, células ou meios de cultura de interesse.Uma vez extraídos os pulmões, encha uma seringa de 10 mililitros com agarose e HBSS sem vermelho fenol. Infle os pulmões com aproximadamente 10 mililitros de ar através da cânula traqueia, e injete imediatamente a agarose preparada através da cânula traqueia até que as pontas mais disstais dos lóbulos pulmonares sejam infladas. Tampe a traqueia anexando a tampa branca de uma torneira de quatro vias à trava luer fêmea da cânula traqueal.Coloque o pulmão em uma placa de Petri de 150 milímetros no gelo para permitir que a agarose se solidifique. Prepare as fatias pulmonares de acordo com o protocolo no manuscrito, e depois encha uma placa de Petri de 100 milímetros com 1/3 de volume de PBS. Transfira e guias para o prato usando fórceps.Se as fatias estiverem congeladas, descongele um prato de cada vez derramando em temperatura ambiente PBS. Em seguida, transfira uma fatia descongelada para uma placa de Petri de 150 milímetros. Desdobre suavemente a fatia usando fórceps finos ou um hemostat e aspira cuidadosamente o excesso de PBS ao redor do tecido.Em seguida, corte uma tira de três milímetros de largura, pelo menos nove milímetros de comprimento da fatia, pressionando todo o comprimento de uma lâmina de barbear firmemente contra o prato e balançando-o ligeiramente de um lado para o outro. Para prender a tira de tecido na fita, flutue-a acima do, centralizando-o cuidadosamente para estender os orifícios nos clipes em cada extremidade. Coloque uma guia parcialmente no orifício em uma extremidade com fórceps finos, endireitar suavemente o tecido e coloque a segunda guia.Por fim, use fórceps para pressionar cada guia completamente para fixar o tecido. Depois de cortar todos os lados, transfira o prato de 100 milímetros contendo as fitas para um capô de fluxo laminar. Transfira para placas de seis poços contendo a primeira solução de descelularização usando um hemostat curvo para agarrar os lados entalhados.Em seguida, coloque a placa de seis poços em um agitador orbital a 30 RPM por 10 minutos. Aspire o fluido de cada poço, em seguida, substitua-o por três mililitros da segunda solução de descelularização por bem. Coloque a placa em um agitador orbital a 30 RPM e incubar por cinco minutos.Repita esse processo com cada solução conforme descrito no protocolo de descelularização no manuscrito. Após a lavagem final com PBS, transfira tecidos para placas estéreis de seis poços contendo PBS fresco com antibióticos e antimípticos e incubar a 37 graus Celsius por 48 horas. Após a esterilização com antibióticos e antimícticos, os andaimes de tecido pulmonar podem ser semeados imediatamente ou armazenados a quatro graus Celsius por até 30 dias.Antes de utilizar para a cultura, incubar andaimes armazenados a quatro graus Celsius com PBS frescos e antibióticos e antimícticos durante a noite a 37 graus Celsius como uma etapa adicional de esterilização. Em seguida, enxágue andaimes com PBS estéril, cinco mililitros por poço, três vezes, por cinco minutos cada. Examine andaimes sob um microscópio de contraste de fase na ampliação de 5X para selecionar tecidos para semeadura.Prepare a suspensão celular endotelial em meio endotelial a 5 milhões de células por mililitro com células suficientes para semear 500.000 células endoteliais por fatia. Coloque banhos de semeadura autoclaved em pratos petri de 100 milímetros e transfira cuidadosamente os andaimes de enxágue de cabeça para baixo para os banhos de semeadura. Gire suavemente a suspensão da célula preparada para misturar.Em seguida, cuidadosamente pipeta 100 microliters de células diretamente em cima de cada tecido na base dos poços, tomando cuidado para não danificar o tecido com a ponta pipeta. Transfira os tecidos semeados para a incubadora de cultura celular. 24 horas após a semeadura da célula endotelial, adicione 900 microliters de meio de cultura pré-aquecido a cada poço usando uma pipeta manual e, em seguida, devolva a placa à incubadora.Após 24 horas de semeadura celular, remova o meio e substitua o mililitro de meio endotelial fresco por poço. 72 horas após a semeadura das células endoteliais, conte AEC2s, ou células epiteliais alveolares tipo II, e fibroblastos usando um hemocitômetro e preparem uma suspensão celular 1:1 em média de crescimento AEC2 a 5 milhões de células por mililitro. Pipeta o meio de cada banho de semeadura bem e gire suavemente a suspensão celular preparada.Pipeta 100 microliters de células diretamente em cima de cada tecido na base do poço. Transfira os tecidos semeados para a incubadora de cultura celular. Após duas horas, adicione 900 microliters de meio de crescimento AEC2 pré-aquecido para cada poço e, em seguida, devolva a placa à incubadora.Após 24 horas de cultura com AEC2s e fibroblastos, prepare uma placa de 12 poços com um mililitro de meio de crescimento AEC2 pré-aquecido por poço, por. Pipeta 800 microliters de meio de cada poço do banho de semeadura, em seguida, remova as fitas do banho de semeadura e transfira-as para o lado direito até a placa preparada de 12 poços, um por poço. Mude o meio de cultura cuidadosamente usando uma pipeta pasteur de vidro a cada dois dias para a duração da cultura desejada.Monitore o grau de repopulação tecidual através de microscopia de contraste de fase na ampliação de 5X durante toda a duração da cultura. A coloração de H e E dos andaimes teciduais mostrou arquitetura alveolar preservada após a descelularização sem núcleos celulares visíveis. O tecido alveolar foi observado quando os andaimes de matriz extracelulares descelularizados foram vistos na ampliação de 5X por microscopia de contraste de fase.Grandes vias aéreas e embarcações também foram visíveis em algumas fatias. No sétimo dia de cultura, a microscopia de contraste de fase mostrou que o padrão de recelularização em tecidos pulmonares projetados emulava a estrutura alveolar dos tecidos em casos de repopulação bem sucedida. A má recelularização também era visível.As manchas de H e E no sétimo ou oitavo dia mostraram repopulação do septo alveolar. A imunofluorescência em pé revelou fibroblastos pró-colágeno tipo I alfa 1 positivo, AEC2s ABCA3 positivos, células endoteliais CD31 positivas, ans abundantes SPB-positivoS AEC2s. Além disso, o ensaio de timmidina mostrou muitos AEC2s proliferando.Essa técnica facilitou o desenvolvimento de estratégias para a engenharia de tecidos pulmonares e possibilitou investigações sobre filas que suportam a proliferação e diferenciação celular tipo II dentro do alvéolo.

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