Protocolo Baseado em Microdissecção a Laser para a Análise LC-MS/MS do Perfil Proteômico de Grânulos de Neuromelanina
16 de dezembro de 2021
Um protocolo robusto é apresentado aqui para isolar grânulos de neuromelanina de tecido humano post-mortem substantia nigra pars compacta via microdissecção a laser. Este protocolo revisado e otimizado minimiza massivamente o tempo necessário para a coleta de amostras, reduz a quantidade de amostra necessária e melhora a identificação e quantificação de proteínas pela análise LC-MS/MS.
Nossa combinação de microdissecção a laser e espectrometria de massa permite a investigação de alterações espacialmente resolvidas no nível proteômico em qualquer tipo de tecido. No nosso caso, grânulos de neuromelanina. Nosso protocolo permite a análise proteômica com base em material de amostra limitado.
O que geralmente é um grande desafio ao trabalhar com tecido cerebral post-mortem. Uma vez que as células individuais podem ser isoladas para comparar condições saudáveis e de doença no nível proteômico. Isso pode melhorar nossa compreensão dos mecanismos da doença.
Para começar, coloque a lâmina da membrana do tecido no suporte da lâmina no palco robo com o tecido voltado para cima. Para adquirir uma varredura de visão geral da seção de tecido. Use a função de digitalização, selecione a área de interesse no canto superior esquerdo e inferior direito.
Em seguida, selecione verificar todos os ROIs para executar a verificação. Para a seleção automática de grânulos de neuromelanina no campo de visão atual. Selecione a análise do campo de visão.
Em seguida, selecione inverter o resultado e defina o limite para os canais RGB. Para que apenas os grânulos de neuromelanina sejam destacados em vermelho na janela de visualização. Agora clique em OK, para usar as configurações ajustadas para o campo de visão.
Ajuste as configurações do laser usando uma área da lâmina coberta apenas pela membrana. Encha a tampa do tubo de coleta de amostras com 50 microlitros de água ultrapura. E insira a tampa no coletor do robô motor.
Usando a interface do software, posicione o robô mover acima do estágio dois do robô para iniciar a coleta de amostras. Inicie o laser. Controle as configurações de energia e foco durante o processo a laser e ajuste as configurações, se necessário.
Garantir o isolamento adequado e a catapulta dos objetos isolados para a tampa do tubo de coleta de amostras para pelo menos os primeiros 10 objetos. Quando a amostragem estiver concluída, navegue pelo robô até sua posição inicial e remova o tubo de coleta de amostras. Após fiação das amostras por centrificação.
Secar as amostras durante 1,5 horas num concentrador de vácuo. Depois de realizar a digestão tríptica como descrito no texto. Preparar a amostra para análise por HPLC-MS dissolvendo 200 a 400 nanogramas de péptidos de amostra num volume definido de 0,1%TFA.
Em entradas de frascos de vidro espectrométrico de massa inerte. Se a determinação da concentração não for aplicável devido a uma baixa quantidade de amostra. Verifique o carregamento idêntico da amostra comparando a corrente total de íons.
Para iniciar a análise proteômica de dados brutos. Clique em carregar para carregar os arquivos brutos no software. Clique em definir experimento para atribuir os nomes de amostra.
Para definir parâmetros específicos do grupo. Adicione as modificações escolhendo NQ de desamidação, oxidação M e carbamidometilação N-termo como modificações variáveis. e, em seguida, adicione a carbamidometilação C como modificação fixa.
Escolha tripsina como uma enzima de digestão na guia de digestão. Na guia de quantificação livre de rótulos, adicione a opção LFQ e, se mais de 10 arquivos forem processados, escolha a opção LFQ rápida para reduzir o tempo de processamento. Garantir que todos os outros parâmetros específicos do grupo permaneçam nas configurações de fábrica.
Prossiga para a guia parâmetros globais e adicione o arquivo FASTA derivado do uniprot. org na guia sequências. Modifique a regra de identificador de acordo.
E adicione a taxonomia ID 9606 para o Homo sapiens. Para quantificação de proteínas, escolha peptídeos únicos e navalhadores. Em seguida, adicione a opção iBAQ como medida para quantificação de proteínas na guia de quantificação livre de rótulos.
Certifique-se de que todos os outros parâmetros globais permaneçam nas configurações de fábrica e clique em Iniciar. Após a análise ter sido realizada com sucesso, recupere os grupos de proteínas. txt de saída.
Carregue os grupos de proteínas. txt no software de análise. Adicione os valores do iBAQ como colunas principais e classifique todas as outras colunas de acordo com seu tipo.
Filtre iscas e contaminantes filtrando linhas com base na coluna categórica e filtre os resultados com base em valores válidos. Exporte a saída no formato txt para processamento adicional. E avaliar os resultados em relação à questão de pesquisa.
No presente estudo, 1.898 grupos proteicos foram identificados em NMGs e 1.565 foram identificados em tecido SN circundante, dos quais 1.384 foram identificados em ambas as áreas teciduais. Assim, 514 e 181 grupos proteicos foram identificados exclusivamente em NMGs e tecido SN, respectivamente. Nas medições representativas do DDA.
Valores ligeiramente mais elevados de iBAQ em NMGs em comparação com SN indicaram uma maior abundância da proteína citoplasmática dynien-1, cadeia pesada 1 em NMGs. Esta observação pôde ser verificada em experimentos de PRM para o peptídeo ESPEVLLTLDILK. Em que foi detectada uma maior abundância em NMGs.
Com base na área de pico nos níveis MS1 e MS2. O passo mais importante é, de longe, o isolamento dos NMGs, pois o restante do protocolo é baseado nessa etapa para ser executada corretamente. Após o procedimento de LMD, as amostras podem ser utilizadas e processadas para qualquer tipo de técnica ômica, como genômica, transcriptômica, proteômica ou lipidômica.
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Visão geral
Este estudo apresenta um protocolo robusto para isolar grânulos de neuromelanina do tecido substantia nigra pars compacta humano pós-morte usando microdissecção a laser. A abordagem otimizada reduz significativamente o tempo de coleta de amostra e a quantidade necessária, ao mesmo tempo que melhora a identificação e quantificação de proteínas através da análise LC-MS/MS.
Principais componentes do estudo
Área da ciência
- Neurociência
- Proteômica
- Análise pós-morte do cérebro
Fundamentos
- Os grânulos de neuromelanina têm sido historicamente desafiadores de isolar para análise.
- Métodos tradicionais requerem amostras maiores e tempos de coleta prolongados.
- A microdissecção a laser permite o isolamento preciso ao nível de célula única.
- Este protocolo visa melhorar a compreensão dos mecanismos das doenças em condições neurológicas.
Objetivo do estudo
- Otimizar o isolamento de grânulos de neuromelanina para análise proteômica.
- Minimizar os requisitos de amostra e reduzir o tempo de coleta em tecido pós-morte.
- Melhorar a detecção de proteínas ligadas a condições de saúde e doença.
Métodos utilizados
- A microdissecção a laser foi utilizada para isolar grânulos de neuromelanina do tecido cerebral humano.
- O modelo envolveu tecido substantia nigra pós-morte.
- Um fluxo de trabalho LC-MS/MS detalhado foi integrado para identificação de proteínas.
- Foram enfatizadas as etapas críticas como seleção automatizada e ajuste das configurações do laser.
- A análise proteômica incluiu validação contra métodos estabelecidos de quantificação de proteínas.
Principais resultados
- 1.898 grupos de proteínas foram identificados nos grânulos de neuromelanina, com padrões de expressão distintos em comparação com o tecido circundante.
- Descobertas notáveis incluem valores iBAQ mais altos nos grânulos de neuromelanina para proteínas específicas.
- O método facilita a comparação entre condições saudáveis e de doença ao nível proteômico.
- Este estudo destaca descobertas críticas sobre a composição de proteínas na saúde e patologia cerebral.
Conclusões
- O estudo demonstra uma abordagem simplificada para isolar grânulos de neuromelanina, melhorando as análises proteômicas.
- O método otimizado tem implicações significativas para a compreensão dos mecanismos das doenças em distúrbios neurológicos.
- Aplicações adicionais podem levar a avanços em ambientes clínicos e de pesquisa focados em patologias relacionadas à neuromelanina.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved proteomic analysis of neuromelanin granules from limited post-mortem human brain tissue, addressing a key bottleneck in neurodegenerative disease research. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by providing disease-relevant proteomic data from dopaminergic neurons affected in Parkinson's disease. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing direct comparison of healthy and diseased states at the protein level.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating neuromelanin granules for proteomic profiling in Parkinson's disease-relevant tissue.
- Operational Value: Reduces tissue requirements through unbiased, automated collection of granules, facilitating analysis of precious post-mortem samples.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by identifying proteins exclusively enriched in neuromelanin granules versus surrounding substantia nigra tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by yielding high-purity granule isolates compatible with LC-MS/MS.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated selection thresholds and consistent laser settings for granule isolation.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative proteomic outputs (iBAQ, LFQ) from disease-relevant neuronal compartments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking neuromelanin granule proteomics to neurodegenerative conditions like Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling proteomic comparison of healthy versus disease conditions.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying differentially abundant proteins (e.g., cytoplasmic dynein-1 heavy chain 1) as potential translational biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation to preclinical research by providing spatially resolved proteomic data from disease-affected neuronal populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling proteomic comparison of neuromelanin granules and surrounding substantia nigra tissue.
- Screening: Describes assay readiness through automated granule selection and reproducible sample collection for downstream LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Highlights label-free quantification (LFQ) and iBAQ measurements that allow teams to compare protein abundance between conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling proteomic profiling of human tissue relevant to Parkinson's disease pathology.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for omics applications (genomics, transcriptomics, lipidomics) beyond proteomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in neurodegeneration research.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through automated laser microdissection workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in CNS target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on disease-relevant proteomic signatures.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in laser microdissection operation and mass spectrometry-based proteomics.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include UV laser microdissection systems and LC-MS/MS platforms.
- Cross-team standardization requirements for granule selection thresholds and sample preparation protocols.
- Adaptation considerations across model systems, including optimization of laser settings for different tissue types.
- Practical limitations include dependency on post-mortem tissue availability and potential protein degradation effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Laser Microdissection and Pressure Catapulting
2:46
Sample Preparation for HPLC-MS and Proteomic Raw Data Analysis
5:10
Statistical Analysis
5:50
Results: Protein Identification in Neuromelanin Granules (NMGs) and Substantia nigra (SN)
7:00
Conclusion
