Name: O cultivo, crescimento e viabilidade de bactérias do ácido lático: uma perspectiva de controle de qualidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: Aprenda a cultivar bactérias do ácido lático com protocolo de controle de qualidade para fermentação. Este método garante pureza celular, viabilidade e funcionalidade usando equipamentos básicos.

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Esta publicação foi possível graças ao número de concessão NC. X-267-5-12-170-1 do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (NIFA) e em parte pela NIZO Food Research BV, Holanda, Jarrow Formulas, EUA, e do Departamento de Ciências da Família e do Consumidor e da Estação de Pesquisa Agrícola da Carolina do Norte Agriculture and Technical State University (Greensboro, NC, EUA 27411). Este trabalho também foi apoiado, em parte, pela subvenção do Programa de Capacitação nº 1890 (2020-38821-31113/adesão ao projeto nº 021765). Este trabalho também foi parcialmente apoiado pelo Ministério da Educação e Ciência da Bulgária no âmbito do Programa Nacional de Pesquisa 'Alimentos Saudáveis para uma Bioeconomia Forte e Qualidade de Vida' aprovado pelo DCM # 577 / 17.08.2018.

1. Materiais e métodos gerais
<ol><li>Fonte de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
	<ol><li>Obtenha cepas de L. bulgaricus de fontes confiáveis. NOTA: Neste estudo, um total de cinco (5) cepas de L. bulgaricus foram utilizadas no estudo de controle de qualidade (Tabela 1). Duas cepas de L. bulgaricus liofilizados para a produção industrial de produtos lácteos fermentados foram fornecidas pelo Dr. Albert Krastanov, Departamento de Biotecnologia da Universidade de Tecnologias Alimentares, Plovdiv, Bulgária. Duas cepas isoladas de produtos comerciais de iogurte disponíveis no mercado dos EUA foram obtidas do estoque de -80 °C do laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos da North Carolina A &amp; T State University e uma cepa liofilizada foi fornecida por um fornecedor C. Todas as cepas de LAB foram mantidas a -80 °C até o uso posterior. Outra cepa bacteriana (Limosilactobacillus reuteri) foi obtida do estoque de -80 °C do laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos da North Carolina A &amp; T State University também foi avaliada.</li>
	</ol></li>
	<li>Meio de caldo de fermentação padrão L. MRS<ol><li>Preparar deMan, meio Rogosa Sharpe (MRS) dissolvendo completamente 55 g de MRS e 0,5 g de L-cisteína em 1 L de água deionizada (DW).</li>
		<li>Dispensar 7 mL e 2 mL da solução de MRS preparada em tubos de ensaio, respectivamente, em autoclave a 121 °C por 15 min e, em seguida, esfriar à temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol></li>
	<li>Meio ágar MRS<ol><li>Preparar o meio de ágar MRS dissolvendo completamente 55 g de MRS e 0,5 g de L-cisteína em 1 L de DW. Adicionar o pó de ágar (15 g), esterilizar o meio de ágar a 121 °C durante 15 minutos e, em seguida, arrefecê-lo em banho-maria.</li>
		<li>Deite todos os meios acabados de preparar em placas de Petri estéreis e guarde-os a 4 °C até que seja necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Médio-piruvato clostridial reforçado modificado (mRCM-PYR)<ol><li>Otimizar um meio clostridial reforçado de acordo com Oyeniran et al.13 e Nwamaioha e Ibrahim18, para seletividade e enumeração precisa de L. bulgaricus pela dissolução de 10 g de peptona #3, 10 g de extrato de carne bovina, 5 g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio, 3 g de acetato de sódio, 2 g de fosfato de potássio dibásico, 0,1 g de uracila, 0,25 g de cloreto de cálcio, 5 g de dextrose, 5 g de frutose, 10 g de maltose, 2 g de piruvato de sódio, 0,2% Tween 80 e 0,5 g de L-cisteína em 1 L de DW.</li>
		<li>Ajustar o pH final (6,0 ± 0,2) da solução utilizando 6 N HCl antes da adição de azul de anilina a 0,008% e 15 g de ágar. Autoclave o meio a 121 °C por 15 min, esfrie em banho-maria e despeje em placas de Petri estéreis. Conservar todos os meios preparados na hora em placas de Petri estéreis a 4 °C até que seja necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Estoque de glicerol de culturas LAB<ol><li>Preparar os estoques de glicerol (50% de glicerol) diluindo 100% de glicerol no mesmo volume de DW e esterilizar a 100 °C por 30 min usando um ciclo de esterilização seco. Arrefecer as existências de glicerol para RT e armazená-los assepticamente para uso posterior.</li>
		<li>Use o crescimento bacteriano (uma única colônia de L. bulgaricus obtida usando o protocolo QC desenvolvido) a partir de culturas noturnas.</li>
		<li>Pipetar 500 μL das culturas noturnas em 50% de glicerol em um tubo de centrífuga de 2 mL e misturá-las suavemente. Congelar e armazenar o stock de glicerol que contém as culturas LAB a uma temperatura ultra-baixa de -80 °C até ser necessário. NOTA: Um esquema gráfico do protocolo para o controle de qualidade e ativação de culturas LAB é mostrado na Figura 1.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Não</td>
			<td>Código do produto</td>
			<td>Amostra</td>
			<td>Fonte</td>
			<td>Composição bacteriana como rotulado1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>S9</td>
			<td>Cepa Industrial Pura</td>
			<td>Bulgária</td>
			<td>Lb. bulgaricus</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>LB6</td>
			<td>Cepa Industrial Pura</td>
			<td>Bulgária</td>
			<td>Lb. bulgaricus,</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>ATCC 11842</td>
			<td>Cepa Industrial Pura</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>Lb. bulgaricus</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>DAW</td>
			<td>Iogurte</td>
			<td>EUA</td>
			<td>Lb. bulgaricus, outra cultura viva</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>E22</td>
			<td>Iogurte</td>
			<td>EUA</td>
			<td>Lb. bulgaricus, outra cultura viva</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>Reuteri •</td>
			<td>Iogurte</td>
			<td>EUA</td>
			<td>Limosilactobacillus reuteri</td>
		</tr><tr><td colspan="5">1lb. = lactobacilos</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Cepas probióticas. A tabela lista as cepas probióticas utilizadas neste estudo.
2. Protocolo para a ativação e controle de qualidade de culturas LAB
<ol><li>Pegue o estoque de glicerol preparado de cepas LAB (em tubos de centrífuga de 2 mL) do congelador ultrabaixo de -80 °C e não permita que elas descongelem antes do uso.</li>
	<li>Limpe e desinfete a abertura dos tubos de centrífuga com álcool a 70% e desinfete suavemente antes do uso.</li>
	<li>Pipetar cerca de 250 μL (0,25 mL) da cultura LAB de estoque dos tubos de centrífuga para tubos de ensaio MRS frescos de 2 mL.</li>
	<li>Vórtice suave, parafilme os tubos de ensaio e incubá-los anaerobicamente durante a noite a 42 °C durante 12-16 h.</li>
	<li>Tome cerca de 500 μL (0,5 mL) das culturas cultivadas durante a noite dos tubos de ensaio MRS de 2 mL em tubos de ensaio MRS frescos de 7 mL, vórtice, e incube-os anaerobicamente durante a noite a 42 °C por 12-16 h.</li>
	<li>Avaliar o crescimento microbiano medindo a densidade óptica (OD) ou o crescimento das culturas a 610 nm com um espectrofotômetro UV-visível e registrar resultados aceitáveis entre 0,7 e 0,9.</li>
	<li>Estenda as culturas noturnas dos tubos MRS de 7 mL para as placas de ágar MRS e MRCM-PYR e incube-as anaerobicamente por 72 h a 42 °C.</li>
	<li>Colher colónias isoladas das placas de ágar, transferi-las para tubos de ensaio MRS frescos de 7 ml, vórtice suave e incubá-las anaerobicamente durante a noite a 42 °C durante 12-16 h.</li>
	<li>Conservar as placas de ágar que contenham as estirpes isoladas a 4 °C no frigorífico durante uma semana.</li>
	<li>Medir e confirmar a DO (entre 0,7 e 0,9) dos tubos de ensaio MRS de 7 mL das culturas LAB isoladas das placas estriadas a 610 nm e usá-las como culturas de trabalho para todos os experimentos relacionados.</li>
	<li>Realizar diluições de dez vezes (diluídas em série) das culturas LAB cultivadas a partir dos tubos de ensaio MRS finais de 7 mL usando 9 mL de água peptona (um tampão fisiológico) para obter uma proporção de 1:10.</li>
	<li>Finalmente, tomar cerca de 250 μL (0,25 mL) de diluições seriadas apropriadas para todos os experimentos de fermentação.</li>
	<li>Activar o caldo contendo estirpes (250 μL) a partir do passo 2.12, transferindo-as para caldo MRS fresco de 7 ml e incubando-as anaerobicamente a 42 °C durante 16 h.</li>
	<li>Continue repetindo as etapas 2.6-2.12 para garantir o crescimento celular viável e superior a partir de culturas LAB. NOTA: Todas as cepas de L. bulgaricus foram ativadas no caldo MRS recém-preparado e incubadas anaerobicamente a 42 °C por 16 h, a fim de atingir uma densidade óptica (OD610 nm) de crescimento bacteriano entre 0,7 e 0,9. O crescimento bacteriano foi medido com espectrofotômetro UV-visível a 610 nm. Os valores de pH das culturas noturnas estavam na faixa de 3,5 a 5,3 como resultado da produção de ácido lático, um produto final orgânico da fermentação LAB. Procedimentos de segurança, como a circulação adequada do fluxo de ar no exaustor de biossegurança e evitar queimaduras durante o uso do queimador de bunsen, foram aderidos e observados.</li>
</ol><img alt="Diagrama do processo de cultura LAB; Preparação do caldo MRS, incubação, medição de densidade óptica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63314/63314fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Esquema gráfico do protocolo para ativação de culturas de bactérias do ácido lático (LAB). O esquema fornece detalhes e os instrumentos básicos necessários para o manuseio e ativação de cepas de cultura LAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63314/63314fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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<li>Kandil, S., El Soda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+freezing+and+freeze-drying+on+intracellular+enzymatic+activity+and+autolytic+properties+of+some+lactic+acid+bacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains.</a> Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).</li>
<li>Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cell+density+cultivation+of+Saccharomyces+cerevisiae+with+intensive+multiple+sequential+batches+together+with+a+novel+technique+of+fed-batch+at+cell+level+%28FBC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC).</a> Processes. 8 (10), 1321(2020).</li>
<li>Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonies+in+solid+media+and+foods%3A+A+review+on+their+growth+and+interactions+with+the+micro-environment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1284(2015).</li>
<li>Oyeniran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+reinforced+clostridial+medium+for+the+isolation+and+enumeration+of+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus+in+a+mixed+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture.</a> Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).</li>
<li>Iguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+repeated+subculturing+and+prolonged+storage+at+room+temperature+of+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3A+H7+on+pulsed-field+gel+electrophoresis+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).</li>
<li>Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+limitations+and+challenges+with+lactic+acid+bacteria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Nutrition+Sciences%22%5BJournal%5D)">Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review.</a> Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).</li>
<li>Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+bile+salt+tolerant+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+2007+National+Conference+on+Environmental+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri.</a> Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).</li>
<li>Gyawali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+extraction+techniques+for+maximum+recovery+of+%CE%B2-galactosidase+from+the+yogurt+bacterium+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.</a> Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).</li>
<li>Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+medium+for+the+enumeration+and+differentiation+of+Lactobacillus+delbrueckii+ssp.+bulgaricus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.</a> Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os resultados de todas as cepas avaliadas com o protocolo de controle de qualidade e sem a utilização do protocolo foram os mesmos e, como tal, foram apresentados resultados vinculados apenas às cepas (S9 e LB6). As cepas LAB ativadas apresentaram crescimento celular superior que se caracterizou por uma alta intensidade de biomassa celular, ocasionando, portanto, uma aparência turva do caldo fermentativo MRS no tubo de ensaio11. O crescimento celular observado após a ativação da cultura foi eviden...

As bactérias do ácido láctico (LAB) são um grupo de bactérias excepcionalmente diversas que têm potencial industrial. Cepas pertencentes a Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus e Streptococcus thermophilus são usadas principalmente como culturas iniciais de laticínios para produtos alimentícios lácteos fermentados, como iogurte1. Cepas LAB selecionadas também são classificadas como probióticos, pois conferem benefícios à saúde dos seres humanos quando as dosagens são adequadamente administradas2. As bactérias do ácido láctico também são microrganismos gram-positivos, não formadores de esporos, não respiratórios, mas aerotolerantes, que geralmente são caracterizados pela produção de ácido láctico como um produto chave de fermentação. O LAB também sintetiza metabólitos essenciais, por exemplo, ácidos orgânicos, bacteriocinas e outros compostos antimicrobianos3 que podem inibir um amplo espectro de patógenos de origem alimentar4. O ácido lático, um dos principais produtos finais do catabolismo de carboidratos e um subproduto da fermentação LAB, é um metabólito orgânico que possui propriedades antimicrobianas e é potencialmente útil para aplicações de biopreservação de alimentos 3,5,6. Além disso, os ácidos orgânicos produzidos pelo LAB conferem o sabor, a textura e o aroma dos alimentos, aumentando assim suas propriedades organolépticas gerais 5,6. Os requisitos nutricionais distintos do LAB, juntamente com sua natureza onipresente, permitem que as bactérias prosperem facilmente em diferentes ambientes, como alimentos à base de laticínios, alimentos fermentados, vegetais, bem como no intestino humano7.
Há uma demanda crescente por culturas iniciais do LAB para a produção de iogurte e muitas aplicações lácteas diversas8,9, portanto, a atenção crítica e as técnicas científicas estabelecidas devem ser seguidas, no cultivo de cepas LAB, bem como na ativação de cepas liofilizadas e isoladas, pois essa atividade é vital para o melhor desempenho da fermentação. O laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos, portanto, se envolve ativamente no desenvolvimento de tecnologia adequada voltada para a ativação, crescimento superior e fermentação característicos de cepas LAB isoladas de produtos lácteos fermentados, bem como de culturas iniciais industriais empregadas para a produção de iogurte. Além disso, destaca-se que as cepas de cultura LAB produzidas industrialmente passam por atividades conservantes como liofilização e armazenamento congelado, causando estresse e lesão celular, como resultado do processo de choque a frio a que são submetidas10. Ao limitar, os desafios de viabilidade e melhorar a funcionalidade de cepas LAB obtidas de produtos alimentícios isolados ou produtos liofilizados, é importante ativar adequadamente essas culturas como forma de controle de qualidade para aprimorar sua característica fermentativa8. Neste estudo, o objetivo foi desenvolver um protocolo interno de controle de qualidade para a ativação e crescimento de cepas de cultura de L. delbrueckii subsp. bulgaricus que, em última análise, promovessem o crescimento viável do LAB, bem como melhorassem o desempenho de fermentação e a funcionalidade metabólica das cepas LAB. Este protocolo poderia, em última análise, ser adaptado (usando meios de crescimento ideais e condições de cultivo apropriadas) para o cultivo de outras cepas LAB para pesquisa de fermentação, bem como para fins industriais ou operações de bioprocessamento. Este protocolo de ativação e controle de qualidade LAB garantirá, portanto, que culturas iniciais de laticínios viáveis superiores sejam obtidas e potencialmente funcionais para diversas aplicações na indústria global de laticínios e alimentos.

<table><tbody><tr><td>Anilina Azul</td><td>Thermo Scientific</td><td>R21526</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Extrato de carne bovina</td><td>Research Products International</td><td>50-197-7509</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Dextrose anidra</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350500</td><td>500 gramas</td></tr><tr><td>D-Frutose</td><td>ACROS Organics</td><td>AC161355000</td><td>500 g</td></tr><tr><td>de ágar Difco em pó</td><td>Difco</td><td>DF0812-07-1</td><td>2 kg</td></tr><tr><td>de ágar TPY</td><td>Difco</td><td>211921</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Eppendorf tubo de microcentrífuga (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-12</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>de glicerol</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI17904</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 infravermelho</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>ATCC 11842</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Bulgária</td><td>S9</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Bulgária</td><td>LB6</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos (NCATSU)</td><td>DAW</td><td></td></tr><tr><td>Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus</td><td>Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos (NCATSU)</td><td>E22</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>Biogai, Raleigh / Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos (NCATSU)</td><td>RD2</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de L-cisteína monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6852-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de monohidrato de maltose</td><td>Fisher Scientific</td><td>M75-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>de caldo MRS</td><td>Neogen</td><td>50-201-5691</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>de peptona nº 3</td><td>Hach</td><td>50-199-6719</td><td>500 g</td></tr><tr><td>de fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)</td><td>Research Products International</td><td>50-712-761</td><td>500 g</td></tr><tr><td>de acetato de sódio trihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>S220-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>de piruvato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Tubos de ensaio com tampas de rosca revestidas de borracha</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB70125150</td><td>25 x 150 mm</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ultra baixo congelador</td><td>So-Low</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>ACROS Organics</td><td>AC157301000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>espectrofotômetro UV-visível</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Evolution 201</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td> Extrato de levedura <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>T08204K7</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (6N (certificado), Fisher Chemical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; SA56-500</td><td>500 mL</td></tr></tbody></table>

o cultivo, crescimento e viabilidade de bactérias do ácido lático: uma perspectiva de controle de qualidade

The Cultivation, Growth, and Viability of Lactic Acid Bacteria: A Quality Control Perspective

As bactérias do ácido láctico (LAB) são culturas iniciais de laticínios essenciais que são significativamente empregadas para a fabricação de produtos lácteos fermentados, como iogurte e queijo. Os LAB produzem predominantemente ácido láctico como um dos principais produtos finais da fermentação e sintetizam metabolitos importantes que transmitem as características organolépticas dos produtos alimentares fermentados. LAB são bactérias fastidiosas que prosperam em muitos ambientes quando os requisitos nutricionais adequados são atendidos. A demanda por culturas iniciais de laticínios LAB superiores para aplicações de fermentação na indústria de alimentos e laticínios resultou na necessidade de fornecer culturas viáveis e ativas para todas as operações de bioprocessamento. O desenvolvimento de um protocolo padrão para garantir a viabilidade e a funcionalidade aprimorada das culturas LAB no laboratório, bem como nos ambientes de processamento de laticínios, é, portanto, muito crítico. Ao abordar as preocupações ligadas à ressuscitação de células de cultura LAB fracas, estressadas e lesadas, um protocolo que descreve vividamente os passos salientes para se recuperar, melhorar a regeneração celular e melhorar a funcionalidade metabólica das cepas LAB é de extrema importância. A manutenção da pureza, funcionalidade e viabilidade da cultura para culturas iniciais do LAB também é fundamental. Portanto, a adesão a uma diretriz de protocolo única resultará na promoção do desempenho de fermentação para muitas cepas LAB dedicadas a processos de fermentação e biotecnologia. Como resultado, o Laboratório de Microbiologia e Biotecnologia de Alimentos da Universidade Estadual Técnica e Agrícola da Carolina do Norte desenvolveu um protocolo padrão para a ativação e controle de qualidade de cepas LAB selecionadas que resultou em cepas de cultura LAB altamente funcionais e viáveis empregadas para pesquisa de fermentação. A adaptação e recomendação de um protocolo como este para uso na indústria de laticínios e alimentos ajudará a garantir a viabilidade e a funcionalidade do LAB para muitas aplicações.

O crescimento celular das cepas LAB avaliadas cultivadas com o protocolo de controle de qualidade foi significativamente diferente (P &lt; 0,05) do que as cepas cultivadas sem esse protocolo padrão. O protocolo de CQ para L. bulgaricus e L. reuteri empregou uma abordagem multi-subcultura (subculturação três vezes antes de estrias em placas de ágar), enquanto o procedimento de controle teve a subcultura feita apenas uma vez com todas as outras condições mantidas constantes. O crescimento da colônia també...

A avaliação do controle de qualidade de culturas de bactérias do ácido lático (LAB) foi confirmada como uma maneira eficaz de melhorar a viabilidade e a funcionalidade das cepas LAB para procedimentos de fermentação. Para reforçar essa afirmação, desenvolvemos um protocolo que elucida como as culturas LAB são ativadas e cultivadas para procedimentos de fermentação e bioprocessamento.

O cultivo, crescimento e viabilidade de bactérias do ácido lático: uma perspectiva de controle de qualidade

Lactic acid bacteria (LAB) are essential dairy starter cultures that are significantly employed for the manufacture of fermented dairy products such as ...

Nosso protocolo é significativo porque garante a pureza como uma verificação de controle de qualidade. Também promove o desempenho de fermentação severa e a consistência do rendimento na fermentação de bactérias do ácido láctico. A principal vantagem desta técnica é que ela pode melhorar o desempenho de fermentação de bactérias do ácido láctico através da pureza, viabilidade e funcionalidade celular.Esta técnica é fácil de usar e pode ser facilmente realizada por qualquer pessoa devido ao uso de apenas equipamentos básicos, sem muitos requisitos técnicos. Philip Yeboah é nosso assistente de pesquisa de pós-graduação e demonstrará o procedimento. Para começar, pegue o estoque de glicerol preparado de bactérias do ácido láctico, ou cepas LAB, em tubos de centrífuga de dois mililitros do congelador ultrabaixo de 80 graus Celsius negativos.Não permita que descongelem antes de usar. Limpe e desinfete a abertura dos tubos de centrífuga com álcool a 70% e suavemente vórtice antes do uso. Pipetar cerca de 250 microlitros da cultura LAB de estoque dos tubos de centrífuga para tubos de ensaio MRS frescos de dois mililitros.Vórtice suavemente os tubos de ensaio, parafilmeize-os e incube-os anaerobicamente durante a noite a 42 graus Celsius por 12 a 16 horas. Em seguida, pegue cerca de 500 microlitros das culturas cultivadas durante a noite dos tubos de ensaio MRS de dois mililitros para tubos de ensaio MRS frescos de sete mililitros, vortex-os e incube-os anaerobicamente durante a noite a 42 graus Celsius por 12 a 16 horas. Avaliar o crescimento microbiano medindo a densidade óptica ou o crescimento das culturas a 610 nanômetros com um espectrofotômetro visível UV e registrar resultados aceitáveis entre 0,7 e 0,9.Fixe as culturas noturnas dos tubos MRS de sete mililitros em placas de ágar MRS e MRCMPYR e incube-as anaerobicamente por 72 horas a 42 graus Celsius. Escolha as colônias isoladas das placas de ágar, transfira-as para tubos de ensaio MRS frescos de sete mililitros, suavemente vórtice e incube-as anaerobicamente durante a noite a 42 graus Celsius por 12 a 16 horas. Armazene as placas de ágar contendo as cepas isoladas a quatro graus Celsius na geladeira por uma semana.Em seguida, meça e confirme a densidade óptica dos tubos de ensaio MRS de sete mililitros das culturas LAB isoladas das placas estriadas a 610 nanômetros e use-as como culturas de trabalho para todos os experimentos relacionados. Use nove mililitros de água peptona para realizar contaminações dez vezes maiores das culturas LAB cultivadas dos tubos de ensaio MRS finais de sete mililitros para obter uma proporção de 1 a 10. Pegue cerca de 250 microlitros dos delírios seriais apropriados para todos os experimentos de fermentação e ative o caldo contendo as cepas, transferindo-as para caldo MRS fresco de sete mililitros e incubando-as anaerobicamente a 42 graus Celsius por 16 horas.Repita as etapas para garantir um crescimento celular viável e superior a partir de culturas LAB. O crescimento morfológico celular das cepas S9 e LB6 lactobacillus bulgaricus cultivadas com o protocolo de controle de qualidade e as cepas S9 lactobacillus bulgaricus cultivadas sem o protocolo de controle de qualidade são mostradas aqui. As cepas foram listradas em triplicados e incubadas anaerobicamente a 42 graus Celsius por 72 horas.Ao tentar este procedimento, certifique-se de desinfetar os tubos de cultura de estoque do freezer com álcool a 70% para evitar a contaminação cruzada. A medição da densidade óptica das culturas de crescimento deve estar sempre entre 0,7 e 0,9. Seguindo este protocolo, fermentações LAB eficientes ou operações de bioprocessamento com uso superior de cultura podem ser alcançadas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Ayivi, R. et al., O cultivo, crescimento e viabilidade de bactérias do ácido lático: uma perspectiva de controle de qualidade. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o método para recuperar bactérias do ácido lático estressadas pelo frio de um estoque de glicerol congelado, restaurando a viabilidade bacteriana por meio de incubação anaeróbica e isolando colônias ativas para expansão da cultura.

Renascimento e crescimento de bactérias lácticas

Um protocolo de produção é descrito para a produção em pequena escala de bebida láctea fermentada probiótica com o auxílio de uma nova cultura bacteriana inicial.

Protocolo de Produção da novela para em pequena escala Fabricação de alimentos fermentados probióticos

Avaliação quantitativa do crescimento bacteriano é essencial para a fisiologia microbiana como um fenômeno de sistemas-nível de compreensão. Um protocolo para uma abordagem analítica e manipulação experimental são introduzidos, permitindo a análise precisa, elevado-throughput de crescimento bacteriano, que é um tema chave de interesse em biologia de sistemas.

Preciso, elevado-throughput análise do crescimento bacteriano

Como os organismos anaeróbios obrigam são incapazes de crescer em cima da exposição de oxigênio, o uso de técnicas de cultivo anaeróbicos é indispensável. Aqui, demonstramos um método simples e efetivo para cultivar uma cultura mista derivada de uma usina de biogás a partir da preparação de mídia para o gás e quantificação de ácidos graxos voláteis.

Preparação média para o cultivo de microrganismos condições estritamente anaeróbicas/anóxicas

Este protocolo detalha as etapas envolvidas na produção e caracterização físico-química de um produto probiótico seco por pulverização.

Desenvolvimento de processos para spray-drying de bactérias probióticas e avaliação da qualidade do produto

O protocolo apresenta duas metodologias para melhorar o isolamento de bactérias anaeróbias intestinais. O primeiro se concentra no isolamento de uma gama diversificada de bactérias usando diferentes meios de cultura. O segundo enfoca as etapas de cultivo de um grupo microbiano específico, possivelmente assimilando o mio-inositol, para compreender completamente seu significado ecológico.

Estratégias para melhorar o cultivo de bactérias anaeróbicas do trato gastrointestinal de frango

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Determinar o número de células em cultura é importante na normalização das condições de cultivo e na realização de experimentos de quantificação precisa. Neste vídeo, demonstramos como as células são contadas usando um hemocitômetro.

Contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Nós demonstramos o uso de microarrays de DNA para perfis de expressão do sistema nervoso. Descrevemos RNA controle de qualidade, rotulagem da amostra, e hibridização da matriz e de digitalização.

Microarrays de DNA: Controle de Qualidade da amostra, Hibridação Array e Digitalização

Este protocolo descreve como executar a viabilidade celular e ensaios de fluorescência usando a expressão Tali Citómetro Image-Based.

Avaliação da GFP Expressão e Viabilidade Usando o Tali Citómetro Baseado na Imagem

Aprenda a cultivar bactérias do ácido lático com protocolo de controle de qualidade para fermentação. Este método garante pureza celular, viabilidade e funcionalidade usando equipamentos básicos.

O cultivo, crescimento e viabilidade de bactérias do ácido lático: uma perspectiva de controle de qualidade

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