Name: Célula única reutilizável para análises epigenômicas iterativas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda análises epigenômicas iterativas usando células únicas reutilizáveis para estudar múltiplas marcas epigenéticas na mesma célula. Este método avança a pesquisa em epigenômica e regulação da expressão gênica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos aos Drs. David Sanchez-Martin e Christopher B. Buck pelos comentários durante a fase de conceituação do projeto. Também agradecemos ao Núcleo de Genômica, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde pela ajuda em experimentos preliminares e ao Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH pelo aconselhamento em análise computacional. Agradecemos à Sra. Anna Word por ajudar na otimização das DNA polimerases utilizadas no método. Este trabalho utilizou os recursos computacionais do cluster NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Este projeto é apoiado pelo Programa Intramuros do Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, o Prêmio de Inovação do Diretor do NCI (#397172) e fundos federais do Instituto Nacional do Câncer sob o Contrato Nº HHSN261200800001E. Agradecemos aos Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy e a todos os membros do Laboratório de Oncologia Celular pelos comentários produtivos.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Os Drs. Ohnuki e Tosato são co-inventores de uma patente intitulada "Métodos para preparar uma única célula reutilizável e métodos para analisar o epigenoma, transcriptoma e genoma de uma única célula" (EP3619307 e US20200102604). O pedido de patente foi depositado em parte com base em resultados preliminares relacionados à tecnologia descrita no presente manuscrito. A invenção ou invenções descritas e reivindicadas neste pedido de patente foram feitas enquanto os inventores eram funcionários em tempo integral do governo dos EUA. Portanto, de acordo com o 45 Code of Federal Regulations Part 7, todos os direitos, títulos e interesses sobre este pedido de patente foram ou deveriam ser atribuídos por lei ao Governo dos EUA. O governo dos EUA transmite uma parte dos royalties que recebe aos seus inventores empregados sob 15 U.S. Code § 3710c.

Este artigo descreve o protocolo passo-a-passo para a análise multiepigenômica de célula única recentemente relatada usando células únicas reutilizáveis7. Nos parágrafos subsequentes, discutimos pontos críticos, enfatizando possíveis limitações no protocolo. 
Um dos pontos críticos ao longo do protocolo (das etapas 7.2-13) é evitar a contaminação por DNase. Uma única célula tem apenas duas cópias de DNA genômico. Portanto, danificar o DNA genômico reduz criticamente o n...

A tecnologia de célula única está entrando na era da multiômica de célula única, que integra tecnologias ômicas individuais de célula única1. Recentemente, a transcriptômica de célula única tem sido combinada com métodos para detectar acessibilidade da cromatina (scNMT-seq2 e SHARE-seq3) ou modificações de histonas (Paired-seq4 e Paired-Tag5). Mais recentemente, transcriptômica e proteômica de célula única foram integradas com acessibilidade à cromatina (DOGMA-seq6). Esses métodos usam marcação baseada em transposase para detectar acessibilidade da cromatina ou modificações de histonas.
Abordagens baseadas em transposase clivam o DNA genômico e adicionam um código de barras de DNA no final do fragmento de DNA genômico. Cada fragmento genômico clivado só pode aceitar até dois códigos de barras de DNA (= uma marca epigenética por sítio de clivagem), e o DNA genômico no local de clivagem é perdido. Portanto, abordagens baseadas em clivagem têm um trade-off entre o número de marcas epigenéticas testadas e a densidade do sinal. Isso dificulta a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula. Um método epigenômico unicelular que não cliva o DNA genômico foi desenvolvido para superar essa questão 7,8.
Além da questão derivada da clivagem mencionada acima, as abordagens baseadas em transposase têm outras limitações. Na análise do epigenoma de célula única, é fundamental conhecer a localização de histonas e proteínas associadas ao DNA no genoma. Nas abordagens atuais, isso é realizado usando células únicas não fixas e retenção de interações proteína-DNA e proteína-proteína. No entanto, isso gera forte viés para regiões acessíveis da cromatina, mesmo na análise de modificações de histonas 9. A localização de histonas e proteínas associadas ao genoma no genoma pode ser preservada sem reticulação proteína-DNA e proteína-proteína, utilizando-se um arcabouço de poliacrilamida 7,8. Essa abordagem reduz o viés estrutural observado nas abordagens atuais que dependem das interações proteína-DNA e proteína-proteína.
Abordagens baseadas em transposase podem adquirir sinais apenas uma vez de uma única célula. Portanto, é difícil delinear o epigenoma completo de uma única célula devido à queda dos sinais. Células individuais reutilizáveis foram desenvolvidas para superar as limitações atuais, permitindo a análise epigenômica iterativa na mesma célula única.

<table><tbody><tr><td>10x CutSmart buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x Digestion buffer</td></tr><tr><td>200 proof etanol</td><td>Warner-Graham Company</td><td>200 proof</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>Anti-5hmC</td></tr><tr><td>Acridine Laranja/Propídio Iodide Stain</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>Contador de células</td></tr><tr><td>Solução de acrilamida, 40% em H2O, para biologia molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>Solução de acrilamida a 40%</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência tudo-em-um BZ-X710</td><td>Microscópio de varredura</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td></tr><tr><td>Unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024</td><td>de ultrafiltração</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio para biologia molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>Persulfato de amônio em pó</td></tr><tr><td>Laboratórios de vetor</td><td>DMF anidro</td><td>S-4001-005</td><td>Anidro N,N-dimetilformamida (DMF)</td></tr><tr><td>Anti-RNA polimerase II CTD repetir YSPTSPS (fosfo, S5) anticorpo [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Anti-Pol II</td></tr><tr><td>Anti-TRAP220/MED1 (fosfo, T1457) anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>Solução de albumina de soro bovino New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>, 20 mg/mL em H2O, baixa carga biológica, livre de protease, para biologia molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA (Tabela 7)</td></tr><tr><td>Bst DNA Polimerase, Fragmento Grande</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst DNA polimerase</td></tr><tr><td>BT10 Série 10 &micro; l Ponta de barreira</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 ponta de baixa retenção</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>N/A</td><td>Robô automatizado de coleta de célula única</td></tr><tr><td>CellCelector 4 placas de nanopoços nl para clonagem de célula única, Placa S200-100 100K, 24 poços, ULA</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>CC0079</td><td>4 nL placa de nanopoços</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>Clorofórmio</td></tr><tr><td>Microplaca de fundo plano Corning Costar de 96 poços, tratada com cultura de células</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Placas de fundo plano de 96 poços</td></tr><tr><td>Deep Vent (exo-) DNA polimerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- DNA polimerase</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0,5 mL Tubo de DNA de baixa ligação</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 1º primer aleatório</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/ A, consulte a Tabela 3</td><td>1º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 01</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N / A, consulte a Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 02</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N / A, consulte a Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 03</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N / A, consulte a Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 04</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N / A, consulte a Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 05</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N / A, consulte a Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 06</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N / A, consulte a Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 07</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N / A, consulte a Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 08</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N / A, consulte a Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 09</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N / A, consulte Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula # 10</td><td>Tecnologias</td> <td>de DNA IntegradasN/A, ver Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula#11</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>N/A, ver Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer aleatório Célula#12</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>N/A, ver Tabela 3</td><td>2º primer aleatório</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2º primer de síntese</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>N/A, ver Tabela 3</td><td>2º primer</td></tr> <tr><td>de sínteseDNA Oligo, Adaptador de Ligação</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N/A, consulte a Tabela 3</td><td>Adaptador de Ligação</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Primer de Transcrição Reversa</td><td>Tecnologias de DNA Integradas</td><td>N/A, consulte a Tabela 3</td><td>Primer de Transcrição Reversa</td></tr><tr><td>DNase I (sem RNase)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNase I (sem RNase, 4 U).</td></tr><tr><td>Tampão de Reação DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x DNase I tampão (NEB)</td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM cada)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTPs</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, origem EUA, Inativado por Calor</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Soro Fetal Bovino</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit de Síntese de RNA de Alto Rendimento</td><td>New England BioLabs</td><td>E2040S</td><td>Mix mestre de transcrição in vitro</td></tr><tr><td>Motivo ativo</td><td>39133</td><td>Anti-H3K27ac Anticorpo H3K27me3</td><td></td></tr> <tr><td>da histona H3K27ac</td>, <td>motivo ativo</td><td>39155</td><td>Anti-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG do soro do coelho</td><td>IgG do controle</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td></tr><tr><td>Nanopowder magnético do óxido de ferro (II, III), tamanho médio da peça de 30 nanômetro (TEM), éster de NHS funcionalizado</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>Pó de óxido de ferro de 30 nm funcionalizado com éster NHS</td></tr><tr><td>K-562</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td> <td>CCL-243</td><td>células</td></tr><tr><td>Acrilamida Linear (5 mg / mL)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>AM9520</td><td>Acrilamida Linear</td></tr><tr><td>LUNA-FL Contador de Células de Fluorescência Dupla</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Contador de Células</td></tr><tr><td>LUNA Lâminas de Contagem de Células, 50 Slides</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>Contador de células</td></tr><tr><td>Óleo mineral, BioReagent, para biologia molecular, óleo leve</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>Óleo mineral</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilenodiamina para biologia molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilenodiamina</td></tr><tr><td>NaCl (5 M), sem RNase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Fisher</td><td>2516</td><td>&nbsp; Espectrofotômetro de microvolume</td></tr><tr><td>NEST 2 mL Placa de poço profundo de 96 poços, Opentrons de fundo em V</td><td>N/A</td><td>Placa de 96 poços de 2 mL de profundidade</td><td></td></tr><tr><td>Placa de PCR de 96 poços sem rodapé</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-405</td><td>Placa de PCR de 96 poços</td></tr><tr><td>NuSive GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>Agarose</td></tr><tr><td>OmniPur Acrilamida: Bis-acrilamida 19:1, solução a 40%</td><td>MilliporeSigma</td><td>1300-500ML</td><td>40% de acrilamida/bis-acrilamida</td></tr><tr><td>OT-2 robô de laboratório</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>Robô automatizado de manuseio de líquidos</td></tr><tr><td>Paraformaldeído, grau EM, purificado, 20% de solução aquosa</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>15713</td><td>20% Pararmaldeído</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>uma pipeta P1000</td></tr><tr><td>Tubos de Proteína LoBind, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1.5 mL Tubo de proteína de baixa ligação</td></tr><tr><td>Kit de extração em gel QIAgen Pipeta</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>A P1000</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo</td><td>Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp; Kit de ligação rápida de corante intercalador específico dsDNA</td></tr><tr><td></td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 DNA ligase (NEB)</td></tr><tr><td>RNaseOUT Inibidor de ribonuclease recombinante</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>inibidor de RNAse</td></tr><tr><td>S-4FB Crosslinker (DMF-solúvel)</td><td>Laboratórios de vetores</td><td>S-1004-105</td><td>Succinimidil 4-formilbenzoato (S-4FB)</td></tr><tr>Laboratórios de <td>vetores</td><td></td> <td>S-HyNicS-1002-105</td><td>Succinimidil 6-hidrazinonicotinato acetona hidrazona (S-HyNic)</td></tr><tr><td>Acetato de sódio, 3 M, pH 5,2, Grau de Biologia Molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M Acetato de sódio (pH 5,2)</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio, tampão 1M soln., pH 8,5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>Tampão de bicarbonato de sódio 1M, pH 8,5</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico para biologia molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico para biologia molecular</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV transcriptase reversa</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090050</td><td>Transcriptase reversa</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10.000x concentrado em DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11494</td><td>Um corante intercalador para DNA</td></tr><tr><td>T4 Tampão de reação de DNA ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x T4 Tampão de reação de DNA ligase</td></tr><tr><td>Pacote de tampão de reação ThermoPol</td><td>New England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x tampão TPM-T (Tris-HCl/cloreto de potássio/sulfato de magnésio/Triton X-100)</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol LS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td>Extração de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio</td></tr><tr><td>Kit de preparação para biblioteca de DNA TruSeq Nano</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>Um kit de preparação de biblioteca de DNA (consulte também as instruções do fabricante)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA</td> Technologies <td>N/A, consulte a Tabela 3</td><td>Uma sonda de DNA modificada com amina para anticorpos</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, consulte a Tabela 3</td><td>Uma sonda de DNA modificada com amina para anticorpos</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Integrated DNA</td> Technologies <td>N/A, consulte a Tabela 3</td><td>Uma sonda de DNA modificada com amina para anticorpo</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/A, consulte a Tabela 3</td><td>Uma sonda de DNA modificada com amina para anticorpo</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, consulte a Tabela 3</td><td>Uma sonda de DNA modificada por amina para anticorpos</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Controle IgG_Ab#001</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, consulte a Tabela 3</td><td>Uma sonda de DNA modificada com amina para controle IgG</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>0,5M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Água Destilada</td><td>Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>Água ultrapura</td></tr><tr><td>Zeba Splin Colunas de dessalinização, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>89882</td><td>Coluna de dessalinização</td></tr></tbody></table>

célula única reutilizável para análises epigenômicas iterativas

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

As análises atuais do epigenoma de célula única são projetadas para uso único. A célula é descartada após um único uso, impedindo a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma única célula e exigindo dados de outras células para distinguir o sinal do ruído de fundo experimental em uma única célula. Este artigo descreve um método para reutilizar a mesma célula única para análises epigenômicas iterativas. 
Neste método experimental, as proteínas celulares são primeiramente ancoradas a um polímero de poliacrilamida em vez de reticulá-las à proteína e ao DNA, aliviando o viés estrutural. Esta etapa crítica permite experimentos repetidos com a mesma célula única. Em seguida, um primer aleatório com uma sequência de andaime para ligadura de proximidade é recozido ao DNA genômico, e a sequência genômica é adicionada ao primer por extensão usando uma DNA polimerase. Posteriormente, um anticorpo contra um marcador epigenético e IgG de controle, cada um marcado com diferentes sondas de DNA, são ligados aos respectivos alvos na mesma célula. 
A ligadura de proximidade é induzida entre o primer randômico e o anticorpo pela adição de um conector de DNA com sequências complementares à sequência de scaffold do primer randômico e à sonda anticorpo-DNA. Esta abordagem integra informações de anticorpos e sequências de genoma próximas em um único produto de DNA de ligadura de proximidade. Ao permitir experimentos repetidos com a mesma célula única, este método permite um aumento na densidade de dados de uma célula rara e análise estatística usando apenas dados de IgG e anticorpos da mesma célula. As células individuais reutilizáveis preparadas por este método podem ser armazenadas por pelo menos alguns meses e reutilizadas posteriormente para ampliar a caracterização epigenética e aumentar a densidade dos dados. Esse método proporciona flexibilidade aos pesquisadores e seus projetos.

K562 células únicas foram geradas usando o protocolo descrito na etapa 8 (ver Figura 5). Células isoladas foram incluídas na camada externa do cordão de poliacrilamida. O DNA celular foi corado e visualizado usando um corante intercalador para coloração de DNA.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> Figura 5: Células únicas reutilizáveis geradas.</s...

O presente protocolo descreve um método de célula única para análises epigenômicas iterativas usando uma única célula reutilizável. A célula única reutilizável permite a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula e a validação estatística dos resultados.

Célula única reutilizável para análises epigenômicas iterativas

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Este método experimental permite o armazenamento a longo prazo das células individuais reutilizáveis para testes epigenômicos. Também permite a análise de muitas marcas epigenéticas e fatores de transcrição em uma mesma célula. Nos métodos atuais de análise do epigenoma de uma única célula, as mesmas células individuais não podem ser reanalisadas.No entanto, com células únicas reutilizáveis, as mesmas células individuais podem ser reanalisadas muitas vezes. Esta técnica é útil para o diagnóstico e planejamento da terapia epigenética, particularmente quando as células do paciente são limitadas em número. Este método é mais adequado para o estudo do epigenoma, a regulação da expressão gênica e outros sistemas, desde que anticorpos específicos para marcas epigenéticas estejam disponíveis.Quando você tentar essa técnica pela primeira vez, recomendamos que você pratique em amostras que não são muito preciosas e valide o experimento usando sequenciamento superficial, como MiSeq ou iSeq 100. Para começar, em uma capela de fluxo laminar limpa, misture um mililitro de suspensão celular e 199 mililitros de um milimolar EDTA PBS contendo um corante intercalador para DNA. Após a mistura, transfira 200 microlitros da suspensão celular para cada poço da placa de fundo plano de 96 poços.Coloque a tampa na placa de 96 poços e digitalize a placa usando um microscópio de varredura. Em seguida, incline a placa e aguarde alguns minutos até que a única célula tenha afundado na borda inferior do poço. Em seguida, coloque a ponta da pipeta no canto inferior e transfira a célula única e o buffer para um tubo de PCR.Verifique o poço usando um microscópio de fluorescência para confirmar a transferência. Se uma única célula ainda estiver no poço, adicione 200 microlitros por poço de um PBS de EDTA milimolar contendo um corante intercalador para DNA e repita a transferência. Após a transferência, coloque uma tampa na placa de PCR de 96 poços e centrifugue a placa usando um rotor oscilante sem quebra.Após a centrifugação, coloque a placa no convés de um robô automático de manuseio de líquidos. Em seguida, arraste e solte o código suplementar um para a janela de software do robô de manuseio de líquidos e execute o programa para remover 195 microlitros do sobrenadante com uma velocidade de pipetagem muito lenta. Adicione 50 microlitros de 4%TEMED ou óleo mineral e incube a placa durante a noite à temperatura ambiente.No dia seguinte, remova o óleo mineral por pipetagem e lave as células cinco vezes com 200 microlitros de tampão TP magnésio negativo. Após a última lavagem, retire o sobrenadante, adicione 15 microlitros de tampão de recozimento e incube no gelo por uma hora. Após a incubação, coloque os tubos de PCR em um termociclador e aqueça a 94 graus Celsius por três minutos.Em seguida, transfira os tubos para um bloco de metal resfriado por gelo e incube por dois minutos. Em seguida, adicione quatro microlitros de sulfato de magnésio e cloreto de sódio, mistura DNTP e misture por vórtice em velocidade máxima. Em seguida, adicione um microlitro de fragmento grande de polimerase BST, misture por vórtice e incube por quatro horas em um agitador.Após a incubação, coloque o tubo de PCR em um termociclador e execute um programa de quatro horas ou durante a noite, conforme descrito no texto. Para ligação de anticorpos, adicione 1,625 microlitros de solução de cloreto de sódio EDTA BSA ao tubo. Misture por vórtice em baixa velocidade e incube o tubo no gelo por uma hora.Em seguida, adicione 0,1 microgramas por mililitro de anticorpo e controle a IgG conjugada com a sonda de anticorpos. Depois de adicionar os anticorpos, incube os tubos no gelo com agitação suave. No dia seguinte, lave as células duas vezes com 200 microlitros de tampão TPM-T no gelo.Em seguida, remova o sobrenadante e lave uma vez com tampão T4 DNA ligase. Em seguida, adicione 19 microlitros de solução adaptadora de ligadura e incube por uma hora a 25 graus Celsius. Em seguida, adicione uma ligase de DNA T4 de microlitro e misture o tubo por vórtice em velocidade média.Coloque o tubo em um termociclador e execute o programa de ligadura de proximidade. Após a corrida, lave as células duas vezes com 200 microlitros de tampão positivo para EDTA BST magnésio negativo e armazene as células durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lavar as células duas vezes com 200 microlitros de tampão BST magnésio negativo para EDTA negativo e adicionar 20 microlitros de uma mistura contendo BST, DNTPs e sulfato de magnésio.Em seguida, misture com um misturador de vórtices e incube o tubo por quatro horas em um agitador orbital. Após a incubação, coloque o tubo em um termociclador e execute o programa de extensão completo conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, para amplificação de deslocamento múltiplo, adicionar 0,4 microlitros de 100 micromolares segundo primer aleatório e misturar por vórtice.Em seguida, incube o tubo por duas horas em um agitador orbital antes de colocá-lo em um termociclador para aquecimento a 94 graus Celsius. Após três minutos, coloque os tubos em um bloco metálico resfriado por gelo e adicione um microlitro de BST DNA polimerase. Vórtice os tubos em velocidade lenta.Em seguida, coloque os tubos em um termociclador para executar o programa de amplificação de deslocamento múltiplo. Após o programa, transfira aproximadamente 20 microlitros de sobrenadante para um tubo de PCR e armazene-o a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, adicione 20 microlitros de tampão TWEEN 20 0,05% e 0,1X TE a um tubo de PCR contendo a célula única reutilizável e incube o tubo durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, recolher o sobrenadante e combiná-lo com o sobrenadante coletado anteriormente. Em seguida, mergulhe o tampão reutilizável de célula única e TBS contendo 50% de glicerol, cinco milimolares de EDTA, 0,5% de BSA e 0,05% de TWEEN 20 e, em seguida, incube-o por 30 minutos em um agitador orbital. Após a incubação, armazene a célula única reutilizável a menos 20 graus Celsius até nova utilização.Finalmente, adicione 40 microlitros de mistura mestre negativa Exo e coloque o tubo em um termociclador para executar o programa conforme descrito no manuscrito do texto. Células individuais reutilizáveis K562 foram geradas usando este protocolo. Células isoladas foram incluídas na camada externa do cordão de poliacrilamida e visualizadas usando um corante intercalador para coloração de DNA.Produtos de DNA antes e depois da digestão BciVI são mostrados aqui. A digestão da enzima de restrição gerou os esperados 19 a 20, 31 a 32, 49 e mais de 49 fragmentos de pares de bases. Além disso, a biblioteca de DNA construída foi analisada por eletroforese capilar para os produtos desejados.Os resultados do sequenciamento indicaram que as leituras mapeadas únicas do anti-histona H3 lisina acetilada 27 e anti-histona H3 trimetilado lisina 27 foram significativamente mais numerosas do que da IgG controle. Os sinais de sequenciamento REpi foram avaliados comparando-se os dados de sequenciamento REpi com os dados de sequenciamento ChIP em massa. Em média, aproximadamente 91% dos sinais de lisina acetilada 27 da histona H3 do sequenciamento REpi se sobrepuseram aos picos de lisina acetilada 27 da histona H-3 no sequenciamento de ChIP em massa.A precisão do sequenciamento de REpi para a marca de histona inativa, histona H3 lisina trimetilada 27 foi de 52%A sensibilidade do sequenciamento de REpi foi analisada para medir quantos picos de sequenciamento de ChIP em massa foram detectados por leituras reproduzidas de sequenciamento de REpi. A sensibilidade do sequenciamento REpi foi de 55,30% na histona H3 lisina acetilada 27 e de 50,94% na histona H3 lisina trimetilada 27. Certifique-se de usar reagentes sem DNS.Além disso, todas as operações que envolvam os cabos de abertura do tubo ou os condutores de reagente devem ser realizadas em uma coifa limpa. Os produtos de DNA desse procedimento são sequenciados e, em seguida, mapeados ao genoma para revelar quais modificações de histonas estão presentes, em quais regiões do genoma em células únicas. Essa tecnologia possibilitou a análise de múltiplas marcas epigenéticas em uma mesma célula e abriu caminho para a análise multiômica em uma única célula.

reusable-single-cell-for-iterative-epigenomic-analyses

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Neste artigo descrevemos um método simples para a colheita de células isoladas de ratos culturas primárias neuronais e análise de transcriptoma subsequentes usando a amplificação ARNA. Esta abordagem é generalizável a qualquer tipo de célula.

Análise do transcriptoma de uma única célula

Métodos para mapear interações proteína-DNA in vivo estão se tornando cruciais para todos os aspectos da pesquisa genômica, mas são trabalhosos, caros e demorados. Aqui, é apresentado um sistema robótico de manuseio de líquidos disponível comercialmente que automatiza a imunoprecipitação da cromatina para mapear interações proteína-DNA in vivo com quantidades limitadas de células.

Automatizando Experiments chip-seq para gerar perfis epigenéticos em 10.000 células HeLa

Sequenciamento de célula única revela a heterogeneidade genotípica em sistemas biológicos, mas as tecnologias atuais não têm a produtividade necessária para a criação de perfil profundo de função e composição da Comunidade. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho microfluidic para sequenciamento &gt; 50.000 monocelulares genomas de diversas populações de células.

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Este protocolo descreve os processos gerais e controle de qualidade verifica necessário para a preparação de células simples mamíferos adultas saudáveis para preparações de RNA-Seq de célula única baseada em gotículas, alta taxa de transferência. Parâmetros de sequenciamento, alinhamento de leitura e análise de bioinformatic a jusante de célula única também são fornecidos.

Transcriptomics de célula única baseada em código de barras da gota de tecidos de mamíferos adultos

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

CUT&amp;RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&amp;RUN unicelular.

Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

Neste protocolo, o método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram otimizados para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando o modelo de camundongo NuTRAP cruzado com uma linhagem de camundongo Cyp17a1-Cre.

Interrogação pareada célula-específica do epigenoma e transcriptoma ovariano de camundongos

O protocolo combina a tecnologia organoide intestinal humana com análise transcriptômica de célula única para fornecer informações significativas sobre a biologia intestinal anteriormente inexplorada.

Usando organoides intestinais humanos para entender o epitélio do intestino delgado no nível transcricional de uma única célula

Este estudo apresenta um protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificação de barras espacial direta de uma seção de tecido com análise multioma de célula única. Essa abordagem permite o perfilamento espacialmente resolvido de uma única célula da expressão gênica e a modificação da histona H3K27ac simultaneamente, oferecendo insights mecanicistas sobre a regulação gênica no contexto da microanatomia tecidual.

Perfilamento Multiômico Integrado de Célula Única Espacialmente Resolvido do Transcriptoma e Alvos Epigenômicos em Seções de Tecido Congelado

Aprenda análises epigenômicas iterativas usando células únicas reutilizáveis para estudar múltiplas marcas epigenéticas na mesma célula. Este método avança a pesquisa em epigenômica e regulação da expressão gênica.

Célula única reutilizável para análises epigenômicas iterativas

Explorar mais vídeos