Name: Padronização e Manutenção de Culturas Hepáticas Caninas 3D e Organoides Intestinais para Uso em Pesquisa Biomédica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a padronizar culturas de organoides hepáticos e intestinais caninos em 3D para pesquisa biomédica. Este método permite isolar, manter e biobancar células-tronco com reprodutibilidade.

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Os autores querem expressar gratidão aos funcionários do Laboratório de Diagnóstico Veterinário da Universidade Estadual de Iowa, ou seja, Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green e Jennifer M. Groeltz-Thrush, pelo processamento oportuno das amostras fornecidas. Os autores desejam reconhecer o apoio da Startup da Faculdade, prêmio ISU VPR Miller, isu VPR Miller Award e subprestácito NSF SBIR à ISU # 1912948.

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K. Allenspach é co-fundador da LifEngine Animal Health e da 3D Health Solutions. Atua como consultora na Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probitics e Mars. J. P. Mochel é co-fundador da LifEngine Animal Health e da 3D Health Solutions. Dr. Mochel atua como consultor da Ceva Saúde Animal e da Ethos Saúde Animal. Outros autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Atualmente, há falta de protocolos padronizados disponíveis para o isolamento e manutenção de organoides hepáticos e intestinais caninos. O estabelecimento de procedimentos operacionais padrão para culturas organoides é garantido para que este modelo seja aplicável em diferentes ambientes laboratoriais. Especificamente, fornecer protocolos operacionais padronizados para a cultura desses modelos organoides caninos é fundamental para caracterizar o crescimento normal dos organoides durante a cultura e a passagem para obter pontos de tempo ideais para expansão e manutenção. Organoides intestinais caninos cultivados usando o protocolo foram previamente caracterizados por Chandra et al.12.
Um dos passos mais críticos do protocolo é a passagem de organoides. O tempo ideal para a primeira passagem de esferoides hepáticos foi determinado para ser no dia 7 após o isolamento com base nas medidas hepáticas de esferoide. O volume máximo de esferoides foi alcançado até o dia 7, e ao mesmo tempo, os esferoides começaram a brotar e formaram organoides hepáticos. O aumento do volume total organoide do dia 2-7 após o isolamento foi mais de 365 vezes, sugerindo que o tempo ideal de passagem é maior do que a cultura organoide intestinal canina. Após 7 dias na cultura, não foram observados sinais brutos de apoptose celular no esferoide hepático, mesmo sem limpeza ou passagem (Figura 7). A passagem dos organoides intestinais e hepáticos pode ser desafiadora, pois o procedimento pode levar à perda de células e à viabilidade alterada. Os resultados indicam que a incubação prolongada de organoides hepáticos com protease semelhante à trippsina (até 12 min) não influencia negativamente a subcultura. Incubar os organoides em protease semelhante à trippsina por mais de 24 min pode ser prejudicial à subcultura subsequente dos organoides.
Em caso de quebra subótimal nos aglomerados celulares com a passagem organoide, a dissociação mecânica em vez de incubação prolongada com protease semelhante à trippsina pode ser mais benéfica. Se forem encontrados problemas com a dissociação adequada dos organoides, um breve vórtice das amostras pode ser tentado para aumentar o rendimento da passagem. Por outro lado, o vórtice tem o potencial de arruinar uma cultura e danificar as células, por isso só deve ser usado quando outros procedimentos falharam repetidamente. Quebrar organoides hepáticos em células únicas reduz a taxa de crescimento dos organoides, enquanto que quebrá-los em aglomerados de células pode melhorar muito sua viabilidade. Dez minutos foram escolhidos como o tempo de incubação para o protocolo organoide. Um ponto de tempo de incubação de 12 minutos foi considerado não citotóxico em comparação com uma incubação de 24 minutos no experimento de protease semelhante à trippsina.
O experimento de sobrevivência confirmou que organoides hepáticos caninos poderiam sobreviver por até 19,5 dias em condições desfavoráveis (esgotamento estrutural e nutricional). Organoides que sobreviveram a essas condições por mais tempo foram cultivados com mídia CMGF+. Esta observação pode ter sido causada pelo crescimento mais lento de organoides hepáticos em mídia não suplementada com inibidor de rocha e GSK3β. As culturas organoides com CMGF+ R/G cresceram mais rápido e podem ter esgotado seus recursos mais rapidamente. Este experimento abre possibilidades de miniaturizar a cultura organoide canina para alcançar uma conversão de sistema de alto rendimento. Tal tecnologia mostra o potencial para facilitar a descoberta de medicamentos ou estudos toxicológicos a um custo substancialmente reduzido.
Alguns problemas comuns encontrados durante a manutenção da cultura organoide canina são a solidificação inadequada da amostra ao chapear, contaminação cultural e estabelecer a densidade e o tamanho adequados dos organoides. Se o ECM solubilizado solidificar prematuramente durante o revestimento, coloque-o imediatamente no gelo por 10 minutos. Se o ECM solubilizado não formar estruturas semelhantes a cúpulas, é provável que não tenha sido removida da amostra uma mídia suficiente. Se for esse o caso, dilui a amostra com um ECM mais solubilizado até formar cúpulas.
Quando a contaminação fúngica ou bacteriana é encontrada em uma placa inteira (ver Figura 4), a melhor solução é descartar a placa. O tratamento com antifúngicos ou antibióticos pode ser tentado, mas o sucesso de tal tentativa é extremamente baixo. Se um único poço estiver contaminado em uma placa, poços viáveis e não afetados podem ser limpos (siga os passos 4.1 a 4.5) em uma nova placa e monitorados de perto. Se a amostra já foi Emergencial Congelada, é aconselhável descartar toda a amostra, pois o descongelamento da amostra expõe a incubadora a um risco adicional de contaminação.
A cultura organoide saudável deve ser, pelo menos, na categoria de tamanho médio e médio ou maior. A densidade ideal é crucial para o crescimento da cultura organoide. A menor densidade deve ser corrigida limpando os organoides para a densidade média. Se ocorrer a situação de extrema densidade (superlotação), os organoides devem ser expandidos para mais poços. Sinais brutos de apoptose celular frequentemente acompanham tanto a superlotação quanto a baixa densidade da cultura organoide. Se essas questões não forem corrigidas a tempo, toda a cultura organoide se tornará apoptótica em questão de dias. Se os organoides alcançarem tamanho extra grande ou densidade muito alta, a cultura deve ser usada para um experimento, congelamento ou fixação.
A mídia organoide contém atualmente 17 componentes, e a adição de fatores de crescimento necessários para a manutenção e expansão organoides pode, portanto, ser cara. Esse problema pode ser resolvido pelo crescimento de culturas celulares 2D que sintetizam os fatores de crescimento para produzir CMGF+condicionados. A cultura celular L-WRN produz fatores de crescimento Wnt-3a, R-Spondin-3 e Noggin37. A colônia celular usa 90% de mídia cultural DMEM/F12 e 10% FBS. Quando a cultura atinge 90% de confluência, a mídia é colhida todos os dias por 1 semana. A mídia colhida é então misturada com 2x CMGF+ (sem esses fatores de crescimento). Embora as culturas 2D possam produzir os fatores de crescimento necessários a uma fração do custo, o tempo adicional e a preparação para produzir a mídia devem ser esperados. As concentrações de fatores de crescimento entre lotes de mídia condicionadas também podem diferir37,38.
Culturas organoides derivadas de células-tronco caninas são um modelo biomédico único que pode ajudar a alcançar os objetivos da One Health Initiative39. A tecnologia organoide pode ser usada em muitas áreas de pesquisa básica e biomédica, abrangendo desde biologia do desenvolvimento, fisiopatologia, descoberta e testes de medicamentos, toxicologia até o estudo de doenças infecciosas e medicina regenerativa40. A pesquisa translacional e translacional reversa são áreas onde os organoides caninos são aplicáveis15. Cães têm sido usados por séculos em ambientes experimentais translacionais, e seu status animal companheiro também facilitou sua posição como uma das espécies mais exploradas na medicina veterinária.
Em conclusão, este manuscrito fornece protocolos operacionais padronizados para isolamento, manutenção, colheita e biobanco de organoides hepáticos e intestinais caninos para facilitar a aplicação desse modelo em diversos campos biomédicos. Este modelo é exclusivamente adequado para promover a pesquisa translacional reversa como ferramenta da Iniciativa One Health para promover o compartilhamento inter e intradisciplinar do conhecimento.

Os roedores são o modelo animal mais utilizado para pesquisas biomédicas e translacionais1. São excepcionalmente úteis para investigar a patogênese molecular básica das doenças, embora sua relevância clínica para doenças multifatoriais crônicas tenha sido recentemente questionada2. O modelo canino apresenta diversas vantagens em relação aos roedores3,4. Cães e humanos compartilham semelhanças em metabolômica e microbioma intestinal que se desenvolveram devido ao consumo da dieta humana ao longo de vários períodos de sua domesticação5,6,7. Semelhanças entre anatomia gastrointestinal canina e humana e a fisiologia é outro dos exemplos8.
Além disso, os cães geralmente compartilham ambientes e estilos de vida semelhantes com seus donos9. A vida útil mais longa dos cães em comparação com os roedores permite o desenvolvimento natural de inúmeras condições crônicas10. Doença inflamatória intestinal ou síndrome metabólica são exemplos de doenças crônicas multifatoriais que compartilham semelhanças importantes entre humanos e cães11,12. Ensaios pré-clínicos caninos que envolvem cães com doenças de ocorrência natural podem gerar dados mais confiáveis do que os obtidos com modelos de roedores13. No entanto, para minimizar o uso de pesquisas em animais vivos e cumprir os princípios dos 3Rs (Reduzir, Refinar, Substituir)14, surgiram alternativas aos testes in vivo utilizando organoides caninos in vitro 3D em 3D.
Organoides são estruturas auto-montadas derivadas de células-tronco 3D que recapitulam a fisiologia e a microanato de seus órgãos originais16,17. Esta tecnologia foi descrita pela primeira vez por Sato et al. em 200917 e permitiu estudos in vitro mais traduzíveis em linhas de células epiteliais do que antes eram possíveis usando culturas de células cancerígenas 2D18,19,20. Organoides são modelos in vitro úteis em muitas disciplinas biomédicas, como em toxicológicos pré-clínicos21,22,23, estudos de absorção ou metabolismo24,25,26,27,28, bem como em abordagens médicas personalizadas29,30,31 . A cultura bem sucedida dos organoides intestinais caninos foi descrita pela primeira vez em 201912, enquanto organoides hepáticos derivados de um cão foram relatados pela primeira vez por Nantasanti et al. em 201532. Desde então, os organoides caninos têm sido usados com sucesso em estudos que investigam enteropatias crônicas caninas, tumores estromal gastrointestinais, adenocarcinoma colorretal12 e Doença de Wilson33,34.
Embora as células-tronco adultas possam ser colhidas através de necropsias, a tecnologia organoide nem sempre requer sacrifício dos animais. Biópsias endoscópicas e laparoscópicas, ou mesmo aspiradores de agulha fina de órgãos35, são uma fonte viável de células-tronco adultas para isolamento organoide epitelial12. O uso generalizado dessas técnicas não invasivas na prática veterinária facilita opções de pesquisa translacional reversa (tradução de informações da prática clínica veterinária à prática clínica humana e vice-versa)15. Um avanço adicional da tecnologia organoide pode ser assegurado pela padronização da cultura organoide e métodos de manutenção. O protocolo organoide aqui apresentado é parcialmente baseado em trabalhos publicados anteriormente de Saxena et al. de 201536, e os métodos foram adaptados para se adequarem a especificidades da cultura organoide intestinal canina e hepática. O fluxo de trabalho global dos protocolos organoides caninos é retratado na Figura 1.
O Protocolo de Isolamento Organoide Canino introduz métodos de obtenção de amostras de biópsias endoscópicas, laparoscópicas e cirúrgicas, além de necropsias. Descreve o pré-tratamento inicial de amostras de tecido e metodologias utilizadas para o transporte para o laboratório. Materiais e reagentes necessários para o isolamento organoide são resumidos na seção "Preparação para o Isolamento". O processo de isolamento de células-tronco adultas a partir de amostras de tecido é descrito em detalhes. Finalmente, discute-se o processo de emplacamento de organoides em estruturas semelhantes a cúpulas usando uma matriz de membrana extracelular solubilizada.
O segundo protocolo, Protocolo de Manutenção Organoide Canina, descreve métodos de documentação e cultivo de organoides. Mudanças na mídia e sua frequência são discutidas nesta seção. Além disso, são descritos os procedimentos laboratoriais como a passagem e limpeza das culturas celulares, essenciais para garantir a manutenção bem sucedida dos organoides caninos 3D. A aprovação adequada é uma etapa crítica do protocolo, e possíveis ajustes e solução de problemas desta etapa são discutidos mais adiante no manuscrito.
O último protocolo é o Protocolo de Colheita organoide canina e biobanco contendo métodos para preparar organoides adultos para incorporação de parafina e preservação do RNA. Métodos de biobancos amostras organoides no armazenamento de nitrogênio líquido também são descritos aqui. Finalmente, são discutidas as formas de descongelar amostras congeladas e apoiar seu crescimento.
Em conclusão, este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos consistentes de cultura organoide canina através da padronização de protocolos intersetórios. Ao fazê-lo, o manuscrito visa facilitar a reprodutibilidade de dados derivados de modelos organoides caninos para aumentar sua relevância na pesquisa biomédica translacional.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho de protocolos organoides caninos. O Protocolo de Isolamento Organoide Canino descreve a preparação dos materiais necessários para o isolamento organoide, a colheita de uma amostra de tecido (por meio de necropsias, biópsias endoscópicas, laparoscópicas e cirúrgicas) e orientação sobre dissociação celular e revestimento da população celular. O Protocolo canino de Manutenção Organoide discute a limpeza e a passagem da cultura organoide. O Protocolo de Colheita e Biobanco Organoide discute a elaboração de amostras organoides para incorporação de parafina e caracterização organoide. Métodos para biobancar culturas organoides e revivê-las do armazenamento em nitrogênio líquido também são discutidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>< solução quelante > forte< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>D-Sorbitol</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>S5136-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Caneta Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Organoid media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I humano</td><td>Sigma</td><td>G9145-.5MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>PeproTech</td><td>9094360</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Life Science</td><td>J848-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Humano R-Spondin-1</td><td>PeproTech</td><td>120-38-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38-250UG</td><td></td></tr><tr><td>Murine Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetil-L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>anti-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de ROCK (Y-27632)</td> <td>EMD Millipore Corp.</td><td>SCM 075</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (inibidor de P38)</td> <td>Sigma</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3 e beta;)</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Trimetoprim</td><td>Sigma</td><td>T7883-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfametoxazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7507-10G</td><td></td></tr><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético, Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, pH 8,0, 0,5 M</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído (37%)</td><td>Fisher Chemical</td><td>F79P-4</td><td></td></tr><tr><td>Solução de glutaraldeído</td><td>Matriz Matrigel Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>para cultura organoide</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>Matriz de membrana extracelular</td></tr><tr><td>Paraformaldeído, 97%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X (solução salina tamponada com fosfato)</td> <td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X (solução salina tamponada com fosfato)</td> <td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Soln.</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td>RNA Storage Reagent</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Protease semelhante à tripsina</td></tr><tr><td><forte>Outros</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 Placa de Cultura de Células de Poço</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>ACD Hybez II Sistema de Hibridização</td><td>ACD a biotechne marca</td><td>321710</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga, 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Frascos</td> criogênicos Corning <td>BCS-405MC</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga descartável</td><td></td> Corning 430488 (50 mL)Fisherbrand <td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de nutação GyroMini (Rocker)</td><td>Labnet</td><td>S0500-230V-EU</td><td></td></tr><tr><td>Banho de calor</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Recipiente de Congelamento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>EspectrofotômetroAnálise</td></tr><tr><td>Incubadora Panasonic</td><td></td><td>Panasonic MCO-170ML-PA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Filme de Embalagem</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996 / EMD</td><td>Fita de Filme Flexível de Laboratório</td></tr><tr><td>Descartável Protegido Bisturis</td><td>Bard-Parker</td><td>239844</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.5 HD Assay &ndash; RED</td><td>ACD uma marca biotechne</td><td>322350</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope H2O2 & Reagentes Protease Plus</td><td>ACD uma marca biotechne</td><td>322330</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Reagentes de Recuperação de Alvo</td><td>ACD uma marca biotechne</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td><td>ACD uma marca biotechne</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos</td><td>Dot Scientific</td><td>6676621</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos 24 poços</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr></tbody></table>

padronização e manutenção de culturas hepáticas caninas 3d e organoides intestinais para uso em pesquisa biomédica

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

Os cães desenvolvem doenças multifatoriais complexas análogas aos seres humanos, incluindo doenças inflamatórias, doenças metabólicas e câncer. Portanto, representam modelos animais de grande porte relevantes com potencial translacional para a medicina humana. Organoides são estruturas tridimensionais (3D), auto-montadas derivadas de células-tronco que imitam a micronatomia e a fisiologia de seu órgão de origem. Esses modelos in vitro translacionais podem ser usados para aplicações de permeabilidade e descoberta de medicamentos, avaliação toxicológica e para fornecer uma compreensão mecanicista da fisiopatologia de doenças crônicas multifatoriais. Além disso, os organoides caninos podem melhorar a vida dos cães companheiros, fornecendo insumos em diversas áreas de pesquisa veterinária e facilitando aplicações de tratamento personalizadas na medicina veterinária. Um pequeno grupo de doadores pode criar um biobanco de amostras organoides, reduzindo a necessidade de colheita contínua de tecidos, já que as linhas celulares organoides podem ser subculturadas indefinidamente. Aqui, são apresentados três protocolos que se concentram na cultura de organoides caninos intestinais e hepáticos derivados de células-tronco adultas. O Protocolo de Isolamento Organoide Canino descreve métodos para processar tecido e incorporar o isolado celular em uma matriz de suporte (matriz de membrana extracelular solubilizada). O Protocolo de Manutenção Organoide Canina descreve o crescimento e a manutenção organoides, incluindo limpeza e passagem, juntamente com o tempo adequado para expansão. O Protocolo de Colheita e Biobanco Organoide descreve maneiras de extrair, congelar e preservar organoides para análise posterior.

Métodos experimentais para colher células-tronco adultas de tecidos intestinais e hepáticos caninos para estabelecer culturas organoides 3D são descritos. Além disso, são discutidas as técnicas laboratoriais para garantir um crescimento consistente e fornecer procedimentos operacionais padrão para a colheita, biobanco e reviver culturas organoides caninas e hepáticas.

Padronização e Manutenção de Culturas Hepáticas Caninas 3D e Organoides Intestinais para Uso em Pesquisa Biomédica

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Os protocolos para a cultura dos organoides hepáticos e intestinais caninos são importantes para padronizar essa nova tecnologia. Esta técnica permite o estabelecimento confiável e reprodutível da cultura organoide canina, incluindo o isolamento organoide, manutenção, colheita e biobanco subsequente de amostras. Os organoides caninos podem fornecer um excelente modelo para inúmeras aplicações que abrangem desde biologia, desenvolvimento de doenças infecciosas, testes e descobertas de drogas, e também medicina de transmissão.Para começar, prepare cinco tubos de centrífugas de 15 mililitros com cinco mililitros de solução de quelação completa 1X, um tubo com três mililitros de solução de quelação completa 1X, um tubo vazio e um tubo com cinco mililitros de solução de quelação completa 1X, e dois mililitros de soro bovino fetal. No dia do isolamento, coloque uma placa de Petri estéril, bisturi, balde de gelo e mistura de nutrientes DMEM avançado a frio F12 no armário de biossegurança. Coloque o número necessário de placa de cultura celular de 24 poços na incubadora de dióxido de carbono para pré-aquecer.Coloque a matriz de membrana extracelular solubilizada no gelo para descongelar. Pré-arrefeça a centrífuga a quatro graus Celsius. Mova a mídia completa com fatores de crescimento do congelador para um banho de água de 37 graus Celsius evitando exposição direta à luz.Agite amostras de tecido no tubo de transporte por 30 segundos. Remova o supernanato excessivo sem descartar nenhum tecido por tubulação lenta perto da superfície do fluido até que 0,5 mililitros seja deixado no tubo. Transfira tecido e remanescente de supernante para uma placa de Petri estéril.Usando um bisturi descartável, corte e pique o tecido em pedaços menores, assemelhando-se a uma consistência de purê por aproximadamente cinco minutos. Pipeta o tecido picado com líquido da placa de Petri para o primeiro tubo completo de solução de quelação, em seguida, adicione dois mililitros de mistura avançada de nutrientes DMEM F12 à placa de Petri. Lave o tecido restante e transfira para o primeiro tubo completo de solução de quelação.Vórtice o tubo de solução de quelação completa 1X aproximadamente cinco vezes por cinco segundos. Permita que as biópsias se instalem na parte inferior do tubo por um minuto e remova o sobrenatante até que cinco mililitros fiquem. Transfira a solução de quelação completa 1X do novo tubo para o tubo de amostra.Repita a etapa anterior para os dois tubos seguintes. E nas duas últimas lavagens, remova o supernatante até três mililitros restantes no tubo. Transfira as biópsias e a solução de quelação completa 1X do tubo de amostra para um poço de uma placa de seis poços.Adicione três mililitros de solução completa de quelação 1X ao tubo de amostra. Gire suavemente para coletar qualquer tecido restante e transferir para o mesmo poço da placa. Adicione 150 microliters de 0,5 molar diamina tetraacética em um poço e coloque a placa de seis poços em um roqueiro de 20 graus 24 RPM a quatro graus Celsius.Incubar as amostras de fígado por 10 minutos e as amostras intestinais por uma hora no roqueiro em movimento. Transporte a placa de seis poços de volta para o armário de biossegurança e transfira o tecido picado e o líquido para um tubo contendo solução de quelação completa 1X com soro bovino fetal. Deixe os tecidos se instalarem e transportar o supernasal com 0,2 mililitros da porção superior do tecido para um tubo vazio.Gire o tubo contendo a amostra a 700 XG por cinco minutos a quatro graus Celsius. As células-tronco são agora pelotas junto com o tecido picado. Retire e descarte o supernatante cuidadosamente para não perturbar a pelota.Resuspense a pelota em DMEM F12 avançado. Gire o tubo novamente e aspire o sobrenante sem perturbar a pelota. Adicione o volume calculado da matriz de membrana extracelular solubilizada ao tubo amostral.Tenha cuidado ao remover a mídia para não perder a pelota celular. Ao adicionar uma matriz de membrana extracelular, a pipeta lentamente para não criar bolhas excessivas na suspensão organoide. Mantenha a amostra com a matriz de membrana extracelular solubilizada no gelo e semee a suspensão no meio dos poços para que a matriz de membrana extracelular solubilizada forme uma estrutura semelhante a uma cúpula.Transporte a placa para uma incubadora e deixe que a matriz de membrana extracelular solubilizada se solidifique por 30 minutos. Misture o inibidor ROCK e o beta GSK3 em mídia completa com fatores de crescimento e adicione 500 microliters desta solução a cada poço. Coloque a placa na incubadora.O protocolo organoide canino normalmente gera aproximadamente 50.000 a 150.000 células intestinais ou hepáticas por poço. Após o isolamento das células-tronco, organoides caninos hepáticos iniciam seu ciclo de vida como esferoides em expansão, e após sete dias, eles se transformam em organoides brotantes e diferenciadores. Foram calculados o volume, a área de superfície, a elipse 2D e a circunferência dos esferoides.Área de elipse 2D e circunferência foram utilizadas para avaliar a saúde da cultura organoide. A avaliação da expressão dos marcadores de forma semi-quantitativa mostrou que os esferoides expressaram preferencialmente o marcador de cholangiocito KRT7 variando de um a 26%A expressão LGR5 marcador de célula-tronco variou entre 0,17 e 0,7 8% enquanto os marcadores de hepatócito foram expressos em menor medida em 0,05 a 0,34% para caixa forkhead 1A e 0,03 a 0,28% para citocromo-P450. Uma incubação de 12 minutos com protease semelhante à trippsina não inibiu o crescimento organoide.No entanto, o crescimento dos organoides foi impactado negativamente por meio de uma incubação de 24 minutos. A sobrevivência dos organoides hepáticos caninos em um ambiente desfavorável foi analisada para determinar o volume de mídia organoide e matriz de porão necessária para o crescimento e sobrevivência dos organoides hepáticos. A taxa de sobrevivência dos organoides variou de 12,9 dias a 18 dias.Técnicas básicas de cultura celular e abordagens assépticas são os pré-requisitos essenciais para o isolamento e manutenção organoides adequados.

standardization-maintenance-3d-canine-hepatic-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este protocolo descreve a produção de um sistema de 3-dimensional organoides biliar extra-hepática do mouse. Estes organoids biliares podem ser mantidas em cultura para estudar Biologia cholangiocyte. Organoids biliares expressar marcadores do progenitor e células biliares e são compostos de células epiteliais polarizadas.

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Culturas tridimensionais de amostras de BMPC pacientes e xenoenxertos de câncer de próstata metastático mantêm a heterogeneidade funcional de seus tumores originais resultando em cistos, esferoides e organoides complexos, semelhantes a tumores. Este manuscrito fornece uma estratégia de otimização e protocolo para a cultura 3D de amostras derivadas de pacientes heterogêneos e sua análise utilizando IFC.

Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a cultura dos organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável de câmara dupla. São descritos os suportes permeáveis, a manutenção da monocamada e os experimentos subsequentes de permeabilidade de drogas.

Organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável de câmara dupla

Aqui, descrevemos um método de geração de organoides de glioblastoma (GBM) a partir de amostras de pacientes primários ou culturas celulares derivadas do paciente e mantê-los até a maturidade. Esses organoides GBM contêm populações de células fenotipicamente diversas e recriam microambientes tumorais ex vivo.

Manutenção da Diversidade Celular Glioblastoma Humano Ex vivo usando cultura organoide tridimensional

A integração de organoides intestinais caninos e um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip oferece modelos translacionais relevantes para doenças intestinais humanas. Os protocolos apresentados permitem a morfogênese 3D e a modelagem dinâmica in vitro do intestino, auxiliando no desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças intestinais em cães e humanos com o One Health.

Morfogênese Tridimensional em Intestino Canino Utilizando Organoides Intestinais Derivados de Pacientes com Doença Inflamatória Intestinal

Os enteróides estão emergindo como um novo modelo para o estudo da fisiologia e fisiopatologia tecidual, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa. Aqui, descrevemos um sistema de cultura 2D derivado de enteróides de células primárias bovinas que permite o co-cultivo com tipos de células teciduais relevantes. Este modelo oferece uma vantagem translacional para a modelagem de pesquisa gastrointestinal.

Geração de um Sistema de Cultura Bidimensional Monocamada Derivada de Enteróides Bovinos Primários para Aplicações em Pesquisa Biomédica Translacional

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Nós descrevemos um método minimamente invasivo e indolor para medir a força muscular canina hindlimb e resposta muscular a repetidas contrações excêntricas.

Em função Assay Canine Muscle Vivo

Aprenda a padronizar culturas de organoides hepáticos e intestinais caninos em 3D para pesquisa biomédica. Este método permite isolar, manter e biobancar células-tronco com reprodutibilidade.

Padronização e Manutenção de Culturas Hepáticas Caninas 3D e Organoides Intestinais para Uso em Pesquisa Biomédica

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