Transplante de Microglia Pluripotente Pluripotente Induzido Humano em Microglia De camundongos imunocompetentes através da Rota Transnasal Não Invasiva
31 de maio de 2022
O protocolo aqui apresentado permite o transplante de microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) no cérebro através de uma rota transnasal em camundongos imunocompetentes. O método de preparação e transplante transnasal das células e a administração da mistura de citocinas para a manutenção do iPSMG é mostrado.
Este protocolo permite um transplante não invasivo de iPSMG no cérebro de camundongos imunocompetente, combinando on/off farmacológico de um antagonista receptor CSF1 PLX5622 com transplante transnasal. A principal vantagem dessa técnica é que o iPSMG pode ser transplantado sem induzir danos cerebrais mesmo em camundongos imunocompetuntes. O transplante microglial pode servir como uma terapia potencial para trocar microglia disfuncional com as funcionais em várias doenças neurodegenerativas no futuro.
Demonstrando o procedimento estará Bijay Parajuli, pesquisador do meu laboratório. Comece descongelando rapidamente as células de microglia humanas derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas em um banho de água Celsius de 37 graus. Gire as amostras até que todo o gelo visível tenha derretido.
Adicione o iPSMG descongelado aos meios de cultura, aquecido a 37 graus Celsius. Adicione um mililitro de células a 10 mililitros de mídia cultural. Centrifugar as células a 300 vezes g durante cinco minutos para obter uma pelota celular.
Remova o supernatante sem perturbar a pelota celular. Adicione o meio de transplante para obter uma concentração celular de 10 a cinco células por microliter. Coloque o iPSMG no gelo e proceda imediatamente para o transplante.
Para preparar camundongos para transplante transnasal, alimente os camundongos machos com uma dieta contendo PLX por sete dias. No final do sétimo dia, cesse a dieta PLX e alimente os camundongos com uma dieta normal. Uma hora antes do transplante transnasal do iPSMG, administre 2,5 microlitros de hialuronidase na PBS para cada narina duas vezes usando uma ponta de pipeta de 10 microliteres para aumentar a permeabilidade à mucosa nasal.
Coloque os ratos na posição supina após a aplicação de hialuronidase. Administrar 2,5 microlitros de hialuronidase dez minutos antes do transplante transnasal do iPSMG. Aplique 2,5 microliters de suspensão celular em uma narina do mouse usando uma ponta de pipeta de 10 microliteres.
Coloque o mouse na posição supina por cinco minutos antes da administração da suspensão da célula para a outra narina. Administre a suspensão celular quatro vezes, aplicando um volume total de 20 microliters por animal. 48 horas após a cessação da alimentação PLX, repita a administração de hialuronidase e suspensão celular nos mesmos camundongos.
Para a administração de citocinas, aplique 2,5 microlitradores do meio de transplante em uma narina do mouse usando uma ponta de pipeta de 10 microliteres. Após dois meses de transplante transnasal, o número de células transplantadas pode ser determinado contando células positivas tanto para marcadores humanos quanto pan-microgliais. Microglia de rato endógeno são positivas apenas para marcador pan-microglial.
Em camundongos de controle, apenas microglia de camundongos foram detectadas tanto no córtex quanto no hipocampo. No córtex dos camundongos transplantados iPSMG, apenas microglia de camundongos foram detectadas, enquanto no hipocampo iPSMG foram detectados. Ao tentar este protocolo, a remoção completa do supernante é essencial para evitar a diluição de citocinas.
É crucial aplicar citocina a cada 12 horas para a viabilidade das células transplantadas. O esgotamento da microglia do rato endógeno é necessário para o transplante de iPSMG. Este procedimento permite o transplante de iPSMG em um cérebro de camundongo normal ou doente.
Assim, a característica do iPSMG, bem como a resposta à doença podem ser determinadas. Esta técnica é adequada para determinar a característica in vivo do iPSMG no cérebro do camundongo. Assim, o transplante de iPSMG em camundongos modelo de doença nos ajudará a entender a resposta e pode abrir caminho para um novo alvo terapêutico.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método não invasivo para o transplante de microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) no cérebro de camundongos imunocompetentes por via transnasal. O protocolo utiliza a administração de citocinas e a deleção de microglia endógena para permitir a integração eficaz de iPSMG, potencialmente abrindo caminho para abordagens terapêuticas em doenças neurodegenerativas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Pesquisa com Células-Tronco
- Biologia das Micróglias
Contexto
- Células-tronco pluripotentes induzidas podem ser diferenciadas em micróglias funcionais.
- A disfunção microglial está implicada em diversas doenças neurodegenerativas.
- A administração transnasal representa uma abordagem inovadora para o transplante celular.
- A administração de citocinas é crucial para a viabilidade celular após o transplante.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para transplante não invasivo de micróglia.
- Avaliar a viabilidade da administração transnasal na manutenção da função cerebral normal.
- Avaliar o potencial das iPSMG em substituir micróglia disfuncionais.
Métodos Utilizados
- A plataforma principal envolve o transplante transnasal de iPSMG em camundongos imunocompetentes.
- Camundongos machos foram pré-tratados com o antagonista do receptor CSF1, PLX5622, e com uma solução de hialuronidase para aumentar a permeabilidade nasal.
- Suspensões celulares foram administradas em múltiplas doses ao longo de cronogramas especificados para garantir a integração adequada.
- O monitoramento pós-transplante envolveu a avaliação da presença e viabilidade das células transplantadas.
Resultados Principais
- Os iPSMG transplantados foram integrados com sucesso ao hipocampo de camundongo sem danificar as micróglias endógenas.
- A administração de citocinas a cada 12 horas foi fundamental para manter a viabilidade celular após o transplante.
- Este método permite examinar as respostas dos iPSMG em modelos tanto normais quanto doentes.
Conclusões
- Este protocolo facilita o estudo de iPSMG in vivo, o que pode orientar futuras terapias gênicas para doenças neurodegenerativas.
- Compreender o comportamento de micróglias transplantadas pode ajudar a delimitar seu papel na saúde cerebral.
- Essa abordagem pode abrir caminhos para novos alvos terapêuticos no tratamento de patologias relacionadas à micróglia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O transplante não invasivo de micróglias derivadas de iPSCs humanas em cérebros de camundongos imunocompetentes permite o estudo direto in vivo da função e resposta a doenças da micrógia humana. Essa abordagem preenche lacunas translacionais entre micróglias de roedores e humanos, apoiando modelos pré-clínicos mais preditivos para a pesquisa de doenças neurodegenerativas. O protocolo aprimora a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em estágios iniciais de descoberta e pontos de inflexão pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação in vivo da biologia das micróglias humanas dentro de um ambiente cerebral de mamífero.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao distinguir respostas específicas de micróglias humanas de modelos murinos.
- Facilita a validação funcional de alvos em vias de neuroinflamação e neurodegeneração.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema validado para avaliar a integração e viabilidade de micróglia humana in vivo.
- Permite a quantificação reprodutível de micróglia transplantada versus micróglia endógena utilizando marcadores específicos.
- Permite a triagem subsequente de compostos que visam a função da micróglia humana em um contexto fisiológico.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos com a relevância da doença humana ao incorporar micróglia humana em cérebros de camundongos.
- Permite a avaliação da resposta da micróglia humana em camundongos normais e em modelos de doença.
- Melhora a confiança preditiva para a descoberta de biomarcadores translacionais e o teste de hipóteses terapêuticas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo conecta a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica ao permitir estudos funcionais de micróglias humanas in vivo, apoiando a identificação de compostos promissores e a continuidade translacional.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre os papéis dos micróglios humanos na fisiologia e na patologia cerebral.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas da integração celular e da viabilidade após o transplante.
- Análise: Permite a discriminação baseada em marcadores entre micróglios humanos e de camundongo para uma análise de dados robusta.
- Pesquisa Translacional: Facilita a modelagem relevante para doenças mediante o transplante de iPSMG em camundongos modelo de doença.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar a função dos micróglios humanos em múltiplos contextos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade específica da espécie na pesquisa de neuroinflamação.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de entrega e quantificação de células não invasivas para reprodutibilidade entre estudos.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais precisas sobre continuidade ou interrupção de terapêuticas direcionadas à microglia, fornecendo dados relevantes para humanos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas para doenças neurodegenerativas, melhorando a fidelidade do modelo.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de iPSCs, diferenciação de micróglias e técnicas de transplante in vivo.
- Necessita de acesso a agentes farmacológicos para a eliminação de micróglias endógenas e suporte com citocinas.
- Exige protocolos padronizados para preparação celular, transplante e análise pós-transplante.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização dos parâmetros de administração e eliminação.
- A administração contínua de citocinas é essencial para a viabilidade das células transplantadas, conforme apoiado pelo protocolo.
