Name: Isolamento de microRNAs de Tick Ex Vivo Culturas de Glândulas Salivares e Vesículos Extracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a isolar microRNAs de glândulas salivares de carrapatos e vesículas extracelulares usando apenas 20 indivíduos. Este método reduz custos e preocupações éticas, sendo aplicável a múltiplas espécies e estágios de vida.

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Agradecemos muito a ajuda do Laboratório de Carrapatos da Febre do Gado em Edinburg, Texas. Gostaríamos de agradecer a Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado e Homer Vasquez. Também gostaríamos de reconhecer a ajuda de Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario e Stephanie Guzman Valencia durante todo o projeto. Gostaríamos de agradecer ao Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group por sua ajuda e conselhos durante a escrita deste manuscrito. Os seguintes reagentes foram fornecidos pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças para distribuição pela BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Carrapatos femininos I. scapularis também foram recebidos do Tick Rearing Facility na Oklahoma State University. Este projeto foi financiado pela Texas A&M University T3: tríades para subvenção de transformação e o acordo de cooperação #58-3094-1-003 pelo USDA-ARS para a AOC.

Os autores não declaram conflito de interesses.

O protocolo atual fornece uma metodologia detalhada para extrair miRNA de glândulas salivares e EVs. No entanto, há considerações importantes, todas detalhadas nas notas de cada seção deste protocolo. A cápsula e a rede de malha devem ser fixadas durante a alimentação do carrapato para evitar que os carrapatos escapem. A preparação e colocação da cápsula estão descritas em Koga et al.40. Várias réplicas das dissecções de carrapato precisam ser feitas se uma amostra inadequada for descartada. Além ...

Carrapatos são ectoparasitas que vetores muitos patógenos para a vida selvagem, pecuária, humanos e seus animaisde estimação 1,2. A alimentação por carrapatos resulta em perda econômica significativa, causando danos à pele, reduzindo a produção de peso e leite devido à anemia grave, e a transmissão de patógenos potencialmente mortais causadores de doenças 1,3,4,5. As práticas atuais de controle para o manejo das populações de carrapatos estão focadas no uso de acaricídios. No entanto, o surgimento contínuo da resistência ao acaricídio em carrapatos que parasitam a pecuária 5,6, o aumento da incidência de picadas de carrapato7 e a transmissão de patógenos em áreas residenciais 8,9, levaram à necessidade de alternativas únicas de controle de carrapatos.
As glândulas salivares do carrapato são órgãos essenciais que garantem o sucesso biológico de um carrapato. São formadas por diferentes tipos de acinus (I, II, III e IV) com várias funções fisiológicas. As glândulas salivares são responsáveis pela osmoregulação, tanto fora quanto no hospedeiro, devolvendo o excesso de água e o conteúdo de ferro ao hospedeiro via salivação 2,10. Tipo I acini também estão envolvidos na captação de água da atmosfera pela secreção da saliva higroscópica10,11. Proteínas efeitos salivares, como cimento e cistatinas, são produzidas dentro de células secretary nos tipos II e III acini10,12. O acini tipo I não afeta a alimentação do carrapato, indicando que a ingestão de farinha de sangue não desencadeia alterações morfológicas e fisiológicas nestes acini tipo13,14. Por outro lado, acini tipo II e III são ativados durante a alimentação e apresentam muito pouca atividade pré-apego. Assim, a alimentação é necessária para desencadear o alargamento das células secretas dentro do acini tipo II e a produção de compostos bioativos. O acini tipo III é reduzido em tamanho durante a alimentação devido à secreção dentro dos grânulos secretos12.
As glândulas salivares também são o local da infecção por patógenos no carrapato e na rota de transmissão. Durante a alimentação, os carrapatos secretam vários compostos com efeitos farmacêuticos que são necessários para a conclusão bem sucedida da farinha de sangue 10,15,16. Esses compostos possuem propriedades anti-inflamatórias, imunossupressores e vasodilatações 10,15,17. Estudos recentes têm demonstrado que vesículas extracelulares (EVs) derivadas das glândulas salivares de carrapato abrigam vários desses compostos, induzindo efeitos anti-inflamatórios e imuno-modulatórios 18,19,20. "Vesículas extracelulares" é um termo de guarda-chuva usado para descrever vesículas classificadas como exosóis e microvesculas com base em seu tamanho e biogênese. No geral, os EVs são blebs lipídes com membranas bicamadas que são ~40 nm-1 μm no tamanho21; geralmente, exossomos são descritos como sendo de 40-150 nm de tamanho, enquanto microvesículos estão entre 150 nm-1 μm no tamanho 21,22,23. No entanto, o tamanho não é indicativo da via biogênese dos EVs22.
A biogênese dos exosóis começa com a invaginação sequencial da membrana plasmática. Essa invaginação leva à formação de corpos multivesiculares e, finalmente, resulta na deformação da membrana vesicular pela ação de complexos ESCRT ou sphingomyelinases (sMases)24,25. Os exossomos podem ser lisosomes dentro dos lisosóis para manter a homeostase celular ou sair via fusão vesicular à membrana plasmática para entregar constituintes celulares às células receptoras21,24. Por outro lado, os microvesículos são formados pela ação de flopasses e flipasses, alterando a conformação de lipídios na membrana plasmática26. Os EVs são essenciais para a comunicação célula-celular, servindo como um sistema de transporte para carga intracelular, como lipídios, proteínas, ácidos nucleicos e microRNAs (miRNAs)21,27,28. Uma vez transportadas, essas vesículas entregam sua carga para o citoplasma das células receptoras, gerando alterações fenotípicas na célula receptora22,29. Devido à importância das vesículas extracelulares na alimentação do carrapato e à manipulação das respostas imunes e cicatrizanteshospedeiras 18,20, a carga dentro de vesículas extracelulares apresenta potenciais alvos para o desenvolvimento de terapêutica anti-carrapato e um mecanismo único para interromper a alimentação de carrapatos. Isso inclui miRNAs dentro das glândulas salivares de carrapato e vesículas extracelulares derivadas da glândula salivar.
miRNAs são sequências curtas de não codificação, ~18-22 nucleotídeos (nt) de comprimento, que podem regular, degradar ou silenciar sequências mRNA30,31. Durante a transcrição, os pri-miRNAs são cortados por Dicer (RNA polymerase III) para formar uma estrutura distinta semelhante ao grampo de cabelo, tornando-se um pré-miRNA. O pré-miRNA é cortado mais uma vez por Drosha (RNA polymerase III) para formar um duplex miRNA maduro. A sequência madura torna-se integrada ao complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC) complementar à sequência mRNA, causando repressão de tradução ou degradação de mRNA 28,30,32. Durante a alimentação hospedeira, miRNAs dentro da saliva de carrapato podem modular a expressão genética hospedeira para suprimir respostas imunes e melhorar a transmissão de patógenos 33,34,35,36,37. Embora existam estudos extensivos sobre EVs e miRNAs, seus papéis durante a alimentação na interface tick-host ainda são mal compreendidos. Otimizar protocolos que podem facilmente resultar no isolamento e purificação de miRNAs de alta qualidade é crucial para o avanço de nossos conhecimentos sobre esses tópicos.
Várias opções podem ser utilizadas para isolar EVs, como ultracentrifugação, precipitação exósmida, precipitação de polímeros, cromatografia imunoaffinity e técnicas de exclusão baseadas em tamanho38. No entanto, essas técnicas não podem distinguir entre exosósmos ou microvesculas. Assim, como mencionado anteriormente, o EV é usado como um termo guarda-chuva ao isolar EVs de diferentes amostras. As vesículas isoladas nos experimentos aqui descritos representam uma mistura de vesículas derivadas de diferentes vias de biogênese. A purificação de uma população específica de vesículas extracelulares pode ser alcançada por imunoprecipitação usando contas revestidas com anticorpos contra marcadores (ou seja, marcadores exosômicos, marcadores tumorais) exclusivos da população vesícula de interesse39,40. miRNAs também podem ser extraídos através de diferentes kits de isolamento disponíveis comercialmente 7,41,42.
O objetivo deste projeto foi desenvolver um protocolo que combina métodos comumente aplicados para isolar EVs e extrair miRNA de ambos os EVs e glândulas salivares fed-tick. Como a secreção de compostos bioativos é ativada pela alimentação12, os carrapatos devem ser autorizados a se alimentar para identificar miRNAs que podem ser importantes para manipular as respostas imunes do hospedeiro e curar feridas. O presente protocolo requer um pequeno número de carrapatos (20 carrapatos) para isolar EVs e seus respectivos miRNAs, em comparação com outros estudos descritos anteriormente que exigiram 2000 carrapatos43. Além disso, evita a contaminação de secreções salivares com pilocarpina44, o que poderia influenciar experimentos que estudam o efeito de EVs e seus miRNAs em células hospedeiras.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; filtro de seringa m</td><td>GenClone</td><td>25-240</td><td></td></tr><tr><td>1 &micro; m filtro de seringa de nylon</td><td>Tisch Scientific</td><td>283129028</td><td></td></tr><tr><td>Cápsula</td><td>de B00FQ937NM</td><td>Amazon</td> de<td>1 polegada com adesivo preto</td></tr> de <tr><td>10 mL Seringa sem agulha</td><td>Exelint</td><td>26265</td><td></td></tr><tr><td>3' e 5' Adaptadores</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td></tr><tr><td>4 mm vannas tesouras</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.1523</td><td></td></tr><tr><td>rotor 70Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Beads</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Kit Bioanalyzer Agilent</td><td></td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5425</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td></td><td></td> Macron UN1888 <td></td></tr><tr><td>Cyverse Discovery Meio Ambiente</td><td>https://cyverse.org/discovery-environment</td>Microscópio de dissecação Nikon SMZ745 Fita de carpete dupla face amazon&lrm;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> </td><td></td>286373</tr><tr><td>Falcon Tubes, 50 mL</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Gibco</td><td>FBS-02-0050</td><td></td></tr><tr><td>pinça fina</td><td>Excelta</td><td>5-S-SE</td><td></td></tr><tr><td>Foamies, cápsula</td><td>de B004M5QGBQ</td><td></td><td>Amazon</td> de 2 mm</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Phoenix Pharmaceuticals fabricado</td><td>193.33165.3</td><td></td></tr><tr><td>Ixodes scaplaris</td><td>CDC, Universidade Estadual</td><td></td><td></td>de Oklahoma</tr><tr><td>L15C300 meio</td><td></td> concentrado de lipoproteína-colesterol em laboratório <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MPI</td><td>02191476-CF</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>VWR</td><td>10118-596</td><td></td></tr><tr><td>miRDeep2</td><td></td><td></td><td>https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2</td></tr><tr><td>M-MuLV Transcriptase reversa</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td></tr> etanol <tr><td>de grau molecular</td><td>Fischer Bioreagents</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>multi-poços 24 poços placa tratada com cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de análise de rastreamento de nanopaticle</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosep com filtro ômega 300K</td><td>Pall Corporation</td><td>OD3003C33</td><td></td></tr><tr><td>NEXTFLEX Small Kit RNA-Seq v3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 Kit de Alto Rendimento (75 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN 90 Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>ICN19453780</td><td></td></tr><tr><td>Pippettes</td><td>Ependorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>frasco de centrífuga de policarbonato</td><td>Beckman Kit Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen miRNeasy</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de lise QIAzol</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermofisher</td><td>Q32880</td><td></td></tr><tr><td>Kit Qubit</td><td>Thermofisher</td><td>Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Coelhos</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reverse Universal Primer Illumina</td><td></td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit</td></tr><tr><td>Rhipicephalus microplus</td><td>Febre do Gado Pesquisa de Carrapatos Labratoty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Fischer Biorreagentes</td><td>215544</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Invitrogen</td><td>833280</td><td></td></tr><tr><td>Tubos livres de RNAse</td><td>VWR</td><td>87003294</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de RNAse</td><td>Thermo Fischer</td><td>11111729</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de RNAse/DNAse</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Minelute coluna de rotação</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Qiagen miRNeasy kit</td></tr><tr><td>RPE Buffer</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Qiagen miRNeasy kit</td></tr><tr><td>RT Buffer</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td></tr><tr><td>RT Forward Primer</td><td>Illumina</td><td>20024906</td><td>NEXTFLEX Small RNA-seq kit</td></tr><tr><td>RTE Buffer</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Qiagen miRNeasy kit</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST16</td><td>Thermo Fischer</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gaze esterilizadas</td><td>Covidien</td><td>2187</td><td></td></tr><tr><td>PBS esterilizado Sigma</td><td></td><td>RNBK0694</td><td></td></tr><tr><td>estreptomicina</td><td>thermofischer Scientific</td><td></td><td></td>15240062</tr><tr><td>TapeStation</td><td>Aligent</td><td>G2991BA</td><td></td></tr><tr><td>Tear Mender Adesivo Instantâneo para Tecido e Couro</td><td>Amazon</td><td>7.42836E+11</td><td>Adesivo</td></tr><tr><td>de Tecido de</td> Cápsula <td>3M VetBond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triple Antibiotics</td><td>dechra</td><td>17033-122-75</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de fosfato de triptose</td><td>BD</td><td>BD 260300</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de micrornas de tick ex vivo culturas de glândulas salivares e vesículos extracelulares

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Carrapatos são ectoparasitas importantes que podem vetor múltiplos patógenos. As glândulas salivares dos carrapatos são essenciais para a alimentação, pois sua saliva contém muitos efeitos com propriedades farmacêuticas que podem diminuir as respostas imunológicas hospedeiras e melhorar a transmissão de patógenos. Um grupo desses efeitos são microRNAs (miRNAs). miRNAs são sequências curtas de não codificação que regulam a expressão genética do hospedeiro na interface tick-host e dentro dos órgãos do carrapato. Estes pequenos RNAs são transportados na saliva de carrapato através de vesículas extracelulares (EVs), que servem comunicação inter e intracelular. Vesículas contendo miRNAs foram identificadas na saliva de carrapatos. No entanto, pouco se sabe sobre os papéis e perfis dos miRNAs em vesículas salivares de carrapato e glândulas. Além disso, o estudo de vesículas e miRNAs na saliva de carrapato requer procedimentos tediosos para coletar saliva de carrapato. Este protocolo visa desenvolver e validar um método de isolação de miRNAs a partir de vesículas extracelulares purificadas produzidas por culturas de órgãos ex vivo . Os materiais e a metodologia necessários para extrair miRNAs de vesículas extracelulares e glândulas salivares de carrapato são descritos aqui.

O presente protocolo fornece uma metodologia detalhada para extrair miRNAs de glândulas salivares e EVs. De acordo com os resultados, este protocolo é eficaz para o isolamento do miRNA de adultos de duas espécies diferentes de carrapatos, I. scapularis e R. microplus, e pode potencialmente ser usado em outras espécies de carrapatos também. A concentração de EVs (partículas/mL) foi medida via NTA. Para R. microplus, cada fase de gênero e vida continha três réplicas biológicas medidas em...

O presente protocolo descreve o isolamento de microRNAs de glândulas salivares de carrapatos e vesículas extracelulares purificadas. Este é um procedimento universal que combina reagentes e suprimentos comumente usados. O método também permite o uso de um pequeno número de carrapatos, resultando em microRNAs de qualidade que podem ser facilmente sequenciadas.

Isolamento de microRNAs de Tick Ex Vivo Culturas de Glândulas Salivares e Vesículos Extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Este protocolo nos permite usar um número reduzido de carrapatos que reduz o custo de manutenção da colônia e diminui o número de animais vertebrados necessários para a alimentação de carrapatos. Este protocolo requer aproximadamente 20 carrapatos. No entanto, a principal vantagem além de usar um pequeno tamanho amostral é que este protocolo pode ser aplicado a múltiplas espécies de carrapatos e diferentes estágios de vida.Além das dissecções de carrapatos ou da aplicação para interações hospedeira-parasita, o efeito da infecção por patógenos na secreção de microRNA e o efeito das alterações fisiológicas no microRNA secretados por carrapatos. Para começar, prepare a mídia sem vesícula adicionando soro bovino fetal, broto de fosfato de tryptose, concentrado de colesterol de lipoproteína de 10%, 5% de bicarbonato de sódio, HEPES e meio L15C300 em uma garrafa de centrífuga de policarbonato de 26,3 mililitros e ajuste o volume conforme necessário. Agora ultracentrize o meio a 100.000 vezes G a quatro graus Celsius por 18 horas.Remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota e transfira o supernatante para um tubo de centrífuga fresco. Ultracentrizar o tubo mais uma vez. Pegue o supernascer e passe por um filtro de 0,22 micrômetro para remover contaminantes.Pipeta o supernante em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e armazene-o a menos 20 graus Celsius até que seja necessário ou até três anos. Adicione uma quantidade apropriada de antibióticos a 500 microliters do meio livre de vesículas em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços. Agora, adicione PBS com rifampicina aos poços que não contêm meio livre de vesículas para evitar o crescimento bacteriano.Coloque os carrapatos em um slide de vidro com fita adesiva de dois lados sob um microscópio dissecando. Antes da dissecção, adicione PBS contendo rifampicina ao carrapato e usando uma tesoura vannas de quatro milímetros, faça uma incisão de aproximadamente um milímetro ao lado de cada fêmea. Agora, remova o lado dorsal do carrapato e as glândulas salivares, em seguida, coloque 20 a 40 glândulas salivares de carrapato em 500 microliters de meio livre de vesícula adicionado a um único poço em uma placa tratada de cultura tecidual de 24 poços.Incubar as amostras da glândula salivar a 32 graus Celsius durante 24 horas para permitir a secreção das vesículas extracelulares. No final da incubação, pipeta todo o meio contendo as glândulas salivares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrífuga a 300 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Resuspenha a pelota contendo as glândulas salivares no RNA mais tarde e armazene a menos 80 graus Celsius até ser usada ou indefinidamente. Agora, remova os detritos celulares centrifugando o supernadante a 2.000 vezes G a 4 graus Celsius por 10 minutos e pipeta o supernascido em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, centrífuga a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius para remover corpos apoptóticos e vesículas extracelulares maiores e transferir o supernatante para um tubo fresco de microcentrífugo de 1,5 mililitro.Em seguida, monte um filtro de seringa de nylon de um micrômetro em uma seringa de 10 mililitros e mantenha-a em um tubo ultracentrífuga. Em seguida, adicione a amostra e encha a seringa com 10 mililitros de PBS. Passe o sobrenatante através do filtro para dentro do tubo.Depois de filtrar e equilibrar os tubos, coloque-os em um rotor de 70 Ti e ultracentrize os tubos a 100.000 vezes G durante 18 horas a quatro graus Celsius. As vesículas extracelulares concentradas formam uma pelota após a ultracentrifugação. Remova o supernatante sem perturbar a pelota e resuspense a pelota na PBS.Pipeta 500 microliters da vesícula extracelular em um filtro centrífugo de 300 K e centrífuga a 8.000 vezes G por 10 minutos a temperatura ambiente e repita este procedimento até que todas as vesículas extracelulares sejam filtradas. Por fim, adicione 400 microliters de PBS esterilizados à coluna e misture bem para remover vesículas extracelulares ligadas à membrana. Em seguida, coloque a amostra em um tubo livre DNAase RNAse de 1,5 mililitro.A concentração e o tamanho das vesículas extracelulares variaram dependendo do sexo e da fase de vida dos carrapatos entre as réplicas biológicas para fêmeas, machos e ninfas. Para todas as réplicas biológicas combinadas, foram observados resultados semelhantes. A análise de pequenas RNAs isoladas da glândula salivar mostrou bandas correspondentes ao RNA ribossômico e microRNAs.No entanto, os RNAs ribossômicos estavam ausentes nas vesículas isoladas das glândulas salivares, e amostras de microRNA purificadas de vesículas extracelulares mostraram mais degradação. Após o enriquecimento, as amostras de microRNA purificadas dos EVs mostraram degradação mínima e concentração de microRNA suficiente para síntese da biblioteca cDNA. O tamanho esperado da banda de aproximadamente 150 pares de base após a preparação da biblioteca cDNA significa pequenas bibliotecas cDNA RNA.Durante a preparação sem vesículas, certifique-se de seguir os passos para evitar a contaminação externa da vesícula. Durante a preparação da placa, certifique-se de adicionar antibióticos para evitar a contaminação bacteriana do microbioma do carrapato. As microRNAs extraídas usando este protocolo podem ser usadas para perfis e experimentos funcionais para validar funções de microRNA, como prever alvos de via microRNA, inibição e experimentos de imitação.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo demonstra métodos para o isolamento, purificação e detecção de exossomos, bem como técnicas para análise de seu conteúdo molecular. Estes métodos são adaptáveis ​​para o isolamento exossomo de ambos os meios de cultura celular e fluidos biológicos, e podem além da análise de conteúdo molecular também ser útil em estudos funcionais.

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

A presença de microRNAs (miRNAs estáveis) em exossomos gerou enorme interesse como um novo modo de comunicação intercelular, pela sua utilidade potencial como biomarcadores e como uma rota para a intervenção terapêutica. Aqui demonstramos purificação exosome de mídia e cultura de sangue, seguido por PCR quantitativo para identificar os miRNAs sendo transportados.

Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

O líquido biliar é uma fonte valiosa de vesículas/exossomos extracelulares que contêm biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa um método robusto para isolar exossomos da bile humana para análises adicionais, incluindo perfis de miRNA.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Vesículas extracelulares presentes no sangue têm sido sugeridas como novos biomarcadores para várias doenças. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes microvesículas derivadas da membrana plasmática de amostras de sangue periférico e sua posterior análise por citometria de fluxo convencional e Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

Apresentamos um protocolo para avaliar os níveis de expressão de microRNA (miRNAs) em circulação em amostras de plasma de pacientes com câncer. Em particular, usamos um kit comercialmente disponível para circulação miRNA extração e transcrição reversa. Finalmente, analisamos um painel de 24 miRNAs selecionados usando placas personalizadas em tempo real sonda pre-manchado.

Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

Este protocolo demonstra como purificar microRNAs extracelular de meios de cultura celular para construção de biblioteca pequena do RNA e a próxima geração de sequenciamento. Vários pontos de verificação de controle de qualidade são descritos para permitir que os leitores a entender o que esperar quando se trabalha com amostras de entrada baixas como exRNAs.

Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas

Este protocolo isola RNA total de alta qualidade de amostras fecais de animais e seres humanos. Um kit comercial de isolamento de miRNA é usado com adaptação significativa para isolar o RNA puro com quantidade e qualidade otimizadas. Os isolados de RNA são bons para a maioria dos ensaios de RNA a jusante, como sequenciamento, micro-array e RT-PCR.

Isolamento de RNA fecal (micro)

O protocolo proposto inclui diretrizes sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente.

Isolamento de Vesículas Extracelulares de Baixo Conteúdo de Endotoxinas Derivadas de Linhagens Celulares Cancerígenas

Aqui, descrevemos um protocolo simples que permite a avaliação in vitro da abundância de microRNAs marcados fluorescentemente para estudar a dinâmica do empacotamento de microRNA e exportação para vesículas extracelulares (EVs).

Rastreando a liberação de miRNA em vesículas extracelulares usando citometria de fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo para coletar saliva, hemolinfa, glândulas salivares e intestino médio, após a dissecção de um carrapato alimentado individualmente, para estudar a localização específica do tecido de patógenos transmitidos por carrapatos para avançar na compreensão da competência do vetor e das interações patógeno-microbioma.

Extração de saliva, hemolinfa, glândulas salivares e intestino médio de carrapatos individuais (Acari: Ixodidae)

Aprenda a isolar microRNAs de glândulas salivares de carrapatos e vesículas extracelulares usando apenas 20 indivíduos. Este método reduz custos e preocupações éticas, sendo aplicável a múltiplas espécies e estágios de vida.

Isolamento de microRNAs de Tick Ex Vivo Culturas de Glândulas Salivares e Vesículos Extracelulares

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