Name: Coleta de dados crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Aprenda a coletar dados de crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon. Este método reduz o viés de orientação preferencial e melhora a qualidade dos mapas de EM em biologia estrutural.

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Agradecemos a Bill Anderson, Charles Bowman e Jean-Christophe Ducom (TSRI) pela ajuda com microscopia, instalações Leginon e infraestrutura de transferência de dados. Agradecemos também a Gordon Louie (Salk Institute) e Yong Zi Tan (National University of Singapore) pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) por nos fornecer o plasmídeo para expressão de DPS. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (U54AI150472, U54 AI170855 e R01AI136680 para DL), da National Science Foundation (NSF MCB-2048095 para DL), da Hearst Foundations (para DL) e da Arthur and Julie Woodrow Chair (para J. P. N.).

1. Preparação da amostra
<ol><li>Use grades contendo folha de ouro e suporte de grade de ouro16 (ver Tabela de Materiais) porque a coleta de dados inclinada pode acentuar o movimento induzido pelo feixe17. OBS: Para o presente estudo, as amostras em grades foram vitrificadas pela técnica de imersão manual e blotting18 em câmara fria umidificada (maior que 80%) (~4 °C).</li>
	<li>Evitar o uso de grades contendo suporte de cobre e folha de carbono ou uma camada contínua de carbono amorfo, a menos que seja absolutamente necessário, pois essas grades podem levar a um maior movimento induzido pelo feixe16 quando o estágio do corpo de prova é inclinado. NOTA: Camadas de suporte alternativas, como grafeno/óxido de grafeno, parecem reduzir o movimento induzido pelo feixe em comparação com o carbono amorfo19,20.</li>
	<li>Pré-selecione grades e identifique regiões caracterizadas por espessura de gelo aceitável e distribuição de partículas. Grades contendo partículas muito bem compactadas levarão à sobreposição de partículas durante a coleta de dados inclinada, o que pode afetar as etapas de processamento de dados a jusante. NOTA: Essas etapas são subjetivas, uma vez que a identificação de boas áreas de gelo é realizada por meio da inspeção visual de imagens desfocadas em busca de regiões onde o contraste de partículas é nítido. Isso pode não ser viável para todas as amostras, uma vez que algumas amostras não se distribuem eficientemente em áreas de gelo fino, levando a desafios durante a coleta de dados (descrito na seção Discussão).</li>
	<li>Vitrifique as grades contendo sua amostra de proteína. Aqui, para fins de demonstração, usamos a proteína DNA Protection during Starvation (DPS) (ver Tabela de Materiais) em uma faixa de 0,1-0,5 mg/mL com folha de ouro e grades de suporte de ouro. NOTA: A proteína foi purificada como descrito anteriormente, exceto que nenhuma clivagem de protease TEVfoi realizada 21. A faixa de concentração de proteínas para uma amostra de interesse terá que ser otimizada individualmente, uma vez que é difícil avaliar uma faixa ideal que seja universalmente aplicável e quase certamente variará entre diferentes amostras.</li>
</ol>2. Configurando a coleta de dados inclinados
<ol><li>Alinhar o microscópio para garantir a iluminação paralela do espécime e minimizar as aberrações do coma22. NOTA: O microscópio deve estar bem alinhado para a coleta de dados padrão do SPA sem inclinação do estágio. Nenhum alinhamento especial é necessário para a coleta de dados inclinados, mas um bom alinhamento garantirá que a segmentação e a geração de imagens prossigam sem problemas. Um esquema geral comparando a coleta de dados inclinada e não inclinada é fornecido na Figura 2.</li>
	<li>Registre um atlas de grade sem inclinação de estágio para identificar quadrados adequados para coleta de dados ou inspecione manualmente os quadrados na ampliação usada no Nó de Aquisição de Quadrados. Procure quadrados onde o papel alumínio esteja intacto, não pareça desidratado e tenha espessura de gelo ideal. NOTA: O nó de aquisição quadrado é o nó de baixa ampliação usado para imagens em várias escalas no Leginon.<ol><li>Para a coleta de dados automatizada sem inclinação típica, registre um atlas de grade, que fornece uma visão geral da qualidade geral da grade e uma indicação inicial de áreas adequadas para a coleta de dados.</li>
		<li>Posteriormente, selecione os quadrados adequados através do atlas e envie-os para a fila. Em seguida, através da seleção manual de furos ou através do localizador de furos EM automatizado, enfileire e envie os alvos de furos.</li>
		<li>Finalmente, use o localizador de furos EM automatizado para enviar alvos de exposição de alta ampliação. Observação : para coleta de dados inclinados, os quadrados podem precisar ser enfileirados manualmente para obter resultados consistentes, especialmente se o ângulo de inclinação ideal não tiver sido pré-determinado e provavelmente será ajustado durante a coleta de dados. O atlas da grade também poderia ser registrado usando uma inclinação de estágio pré-definida se o ângulo de inclinação usado para a coleta de dados tivesse sido previamente estabelecido.</li>
	</ol></li>
	<li>Mova o estágio do espécime para um quadrado de interesse.</li>
	<li>Determine a altura eucêntrica para a posição do palco usando α-wobbler em ± inclinação de 15° do estágio. Ajuste a altura Z para levar o palco à altura eucêntrica usando o painel do teclado para o microscópio. Certifique-se de que a mudança de imagem seja mínima durante a rotina de oscilação de α. NOTA: Se a altura eucêntrica não for identificada corretamente, um grande deslocamento da imagem será observado ao inclinar o palco na ampliação quadrada. Isso também pode acontecer se houver deformações locais na grade, por exemplo, se a grade estiver quebrada ou severamente dobrada nas proximidades da área fotografada. Embora seja melhor evitar tais regiões para a coleta de dados, é imperativo estimar com precisão a altura eucêntrica se estas representarem uma das poucas regiões promissoras para a coleta de dados. A Figura 3 mostra como a segmentação sem identificar adequadamente a altura eucêntrica pode causar grandes mudanças de imagem na ampliação quadrada.</li>
	<li>Encontre uma altura Z mais precisa, use o nó Focuser e pressione Simular.<ol><li>Normalmente, estime a altura Z no nó Focuser na ampliação usada no Nó de aquisição quadrado. NOTA: A sequência de foco do nó Focuser também pode incluir uma estimativa fina de foco Z na ampliação do nó Hole Acquisition (uma ferramenta no software Leginon) durante a coleta de dados.</li>
		<li>Ajuste as configurações do nó Focuser e ative/desative a opção de foco Z fino durante a fila inicial de quadrados. NOTA: É importante garantir que a altura eucêntrica seja identificada com precisão quando a coleta automatizada de dados começar, o que pode exigir a reativação do foco Z fino (etapa 2.10).</li>
	</ol></li>
	<li>Incline o estágio do espécime para o ângulo de inclinação desejado para a coleta de dados na altura eucêntrica verdadeira e reccentralize o estágio, se necessário. Os ângulos de inclinação de 0°, 30° e 60° foram utilizados para este estudo. Pressione Simular no nó Square Acquisition para começar a enfileirar destinos para exposições de nó de Aquisição de furo . NOTA: Conforme indicado na etapa 2.2.1, o atlas de grade pode ser gravado usando uma inclinação de estágio pré-definida, o que evitaria a necessidade de inclinar o estágio novamente nesta etapa. Isso funciona bem e acelera o processo se o ângulo de inclinação usado para a coleta de dados for predefinido. O protocolo atual é escrito com novos espécimes em mente, onde o usuário pode desejar testar diferentes ângulos de inclinação para a coleta de dados.</li>
	<li>Selecione um alvo de foco Z e regiões com furos adequados para exposições de alta ampliação.</li>
	<li>Pressione Enviar destinos para a fila de geração de imagens. Não pressione Enviar destinos em fila até terminar de enfileirar todos os quadrados.</li>
	<li>Traga o estágio do espécime de volta ao seu estado inclinado. Passe para o próximo quadrado e repita as etapas 2.3-2.8 até que um número adequado de exposições de furos tenha sido enfileirado.</li>
	<li>Vá para o Hole Targeting Node e pressione Submit Queued Targets quando todos os quadrados estiverem na fila. NOTA: Se o foco Z fino foi desativado anteriormente para economizar tempo (etapa 2.5), ele precisará ser reativado antes de enviar a fila.</li>
	<li>Inspecione manualmente os alvos selecionados pelo nó de aquisição de exposição de alta ampliação para testar se o localizador de furos EM automatizado pode identificar com precisão as regiões adequadas para aquisição de imagens quando o estágio da amostra é inclinado.<ol><li>Durante este procedimento, selecione 'Permitir a verificação do usuário de alvos selecionados' nas configurações do nó Aquisição de exposição . Quando o usuário estiver satisfeito com a precisão da segmentação, desmarque essa opção para coleta automatizada de dados. NOTA: Alvos em alta magnificação do nó de aquisição de exposição são tipicamente imageados usando uma estratégia de deslocamento de imagem de inclinação do feixe, que funciona igualmente bem para coleta de dados inclinados e não inclinados23,24,25,26. Para uma estimativa precisa do CTF nas etapas de processamento de dados a jusante, a calibração da aberração do coma da lente deve ser realizada para a estratégia de coleta de dados de deslocamento de imagem de inclinação do feixe.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Processamento de Dados
<ol><li>Iniciar o processamento de dados em tempo real 10,27,28,29 com correção de movimento de filmes gravados, estimativa de CTF, seleção de partículas e geração de reconstruções iniciais durante a coleta de dados. NOTA: Para o presente estudo, o cryoSPARC Live10 (ver Tabela de Materiais) foi utilizado para pré-processamento. O processamento de dados em tempo real fornece uma reconstrução crio-EM inicial e uma aproximação para a distribuição angular, que pode informar o usuário sobre a extensão da anisotropia de resolução. Estes, por sua vez, podem ser usados para orientar o usuário sobre se o ângulo de inclinação usado para a coleta de dados é ou não suficientemente alto.</li>
	<li>Visualize o mapa reconstruído e plote a distribuição do ângulo de Euler para medir a extensão das orientações de partículas preferidas. NOTA: As distribuições do ângulo de Euler podem ser convertidas diretamente em distribuições de amostragem no espaço de Fourier para determinar a extensão potencial da anisotropia de resolução. Uma interface gráfica com o usuário (GUI) foi desenvolvida para auxiliar o usuário na avaliação da qualidade de uma distribuição do ângulo de Euler e na determinação de um ângulo de inclinação ótimo30,31. A ferramenta pode ser obtida no repositório do Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.</li>
	<li>Se necessário, ajuste o ângulo de inclinação do estágio no qual os dados são coletados para superar os efeitos da orientação preferencial. O ângulo pode ser aumentado se a orientação preferencial permanecer um problema, como evidenciado pelo mapa e distribuição de Euler em 3.2. Alternativamente, o usuário pode querer dividir a coleta de dados em grupos e gravar usando vários ângulos de inclinação diferentes, como 20°, 30° e 40°. NOTA: Embora a maioria dos TEMs deva ter a capacidade de inclinar o estágio para 70°, as inclinações comuns do estágio do espécime (que usamos) variam de 20°-40°.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A orientação preferencial das partículas causada pela aderência do espécime à interface ar-água é um dos últimos grandes gargalos para a determinação rotineira de estruturas de alta resolução usando o SPA crio-EM 4,5,6. O esquema de coleta de dados apresentado aqui fornece uma estratégia fácil de implementar para melhorar a distribuição de orientação das partículas dentro de um conjunto de dados. Ressaltamos que o protocolo não ...

O advento dos detectores diretos de elétrons na última década 1,2,3 estimulou um aumento exponencial no número de estruturas de alta resolução de macromoléculas e montagens macromoleculares resolvidas usando crio-EM de partícula única 4,5,6. Espera-se que quase todas as espécies macromoleculares purificadas sejam passíveis de determinação de estrutura usando crio-EM, exceto para as menores proteínas ~10 kDa em tamanho ou abaixo de7. A quantidade de material de partida necessária para a preparação da grade e determinação da estrutura é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que outras técnicas de determinação de estrutura, como espectroscopia de ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios X 4,5,6.
No entanto, um dos principais desafios para a determinação de estruturas por crio-EM envolve a preparação adequada da grade para obtenção de imagens. Um extenso estudo avaliando diversas amostras usando diferentes estratégias e grades de vitrificação sugeriu que a maioria das abordagens para vitrificação de amostras em grades crio-EM leva à aderência preferencial de macromoléculas à interface ar-água8. Essa adesão pode potencialmente causar quatro desfechos subótimos: (1) a amostra macromolecular desnatura completamente, caso em que nenhuma coleta e processamento de dados bem-sucedidos é possível; (2) a amostra desnatura parcialmente, caso em que pode ser possível obter insights estruturais de regiões da macromolécula que não estão danificadas; (3) a amostra mantém a estrutura nativa, mas apenas um conjunto de orientações de partículas relativas à direção do feixe de elétrons é representado nas imagens; (4) a amostra mantém a estrutura nativa, e algumas, mas não todas as possíveis orientações de partículas relativas à direção do feixe de elétrons são representadas nas imagens. Para os casos (3) e (4), a coleta de dados inclinada ajudará a minimizar a anisotropia de resolução direcional que afeta o mapa crio-EM reconstruído e fornecerá uma solução generalizável para uma ampla variedade de amostras9. Tecnicamente, a inclinação também pode beneficiar o caso (2), uma vez que a desnaturação presumivelmente ocorre na interface ar-água e da mesma forma limita o número de orientações distintas representadas nos dados. A extensão do viés de orientação no conjunto de dados pode ser potencialmente alterada pela experimentação de aditivos de solução, mas a falta de ampla aplicabilidade dificulta essas abordagens de tentativa e erro. A inclinação do estágio do espécime em um único ângulo de inclinação otimizado é suficiente para melhorar a distribuição das orientações em virtude da alteração da geometria do experimento de imagem9 (Figura 1). Devido à configuração geométrica da amostra preferencialmente orientada em relação ao feixe de elétrons, para cada aglomerado de orientações preferenciais, a inclinação da grade gera um cone de ângulos de iluminação em relação ao centroide do aglomerado. Assim, isso espalha as vistas e, consequentemente, melhora a amostragem do espaço de Fourier e a isotropia da resolução direcional.
Há, na prática, alguns prejuízos para inclinar o palco. A inclinação do estágio da amostra introduz um gradiente de foco em todo o campo de visão, o que pode afetar a precisão das estimativas da função de transferência de contraste (CTF). A coleta de dados inclinada também pode levar ao aumento do movimento de partículas induzido pelo feixe causado pelo aumento dos efeitos de carga ao obter imagens de amostras inclinadas. A inclinação da grade também leva a um aumento na espessura aparente do gelo, o que, por sua vez, leva a micrografias mais ruidosas e pode, em última instância, afetar a resolução das reconstruções 5,9,10. Talvez seja possível superar essas questões aplicando esquemas computacionais avançados de processamento de dados que são brevemente descritos nas seções de protocolo e discussão. Por fim, a inclinação pode levar ao aumento da sobreposição de partículas, dificultando o pipeline de processamento de imagens subsequente. Embora isso possa ser mitigado até certo ponto otimizando a concentração de partículas na rede, não deixa de ser uma consideração importante. Descreve-se aqui um protocolo de simples implementação para coleta de dados inclinados utilizando a suíte de software Leginon (software de aquisição automatizada de imagens), disponível em acesso aberto e compatível com uma ampla gama de microscópios11,12,13,14. O método requer pelo menos a versão 3.0 ou superior, com as versões 3.3 em diante contendo melhorias dedicadas para permitir a coleta de dados inclinados. Nenhum software ou equipamento adicional é necessário para este protocolo. Instruções extensas sobre infraestrutura computacional e guias de instalação são fornecidas em outro lugar15.

<table><tbody><tr><td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td><td>Purificação</td> da proteína DPS da Structura Biotechnology <td></td><td></td></tr><tr><td>adaptada do protocolo descrito em K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086-1098.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector de elétrons direto K2 Summit</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leginon pacote</td><td></td><td></td> de software <td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td></tr><tr>Dispositivo <td></td><td></td><td>de mergulho manual</td><td>Dispositivo caseiro semelhante a uma guilhotina para vitrificação de grades EM</td></tr><tr><td>Talos Arctica</td><td>FEI / Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltrAufoil R1.2 / 1.3 300 grades de malha</td><td>Quantifoil</td><td>N1-A14nAu30-01</td><td></td></tr></tbody></table>

coleta de dados crio-em de partícula única com inclinação do estágio usando leginon

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

A análise de partículas únicas (SPA) por microscopia crio-eletrônica (cryo-EM) é agora uma técnica convencional para biologia estrutural de alta resolução. A determinação da estrutura por SPA baseia-se na obtenção de múltiplas visões distintas de um objeto macromolecular vitrificado dentro de uma fina camada de gelo. Idealmente, uma coleção de orientações de projeção aleatória uniformemente distribuídas equivaleria a todas as visões possíveis do objeto, dando origem a reconstruções caracterizadas por resolução direcional isotrópica. No entanto, na realidade, muitas amostras sofrem de partículas preferencialmente orientadas aderindo à interface ar-água. Isso leva a distribuições de orientação angular não uniformes no conjunto de dados e amostragem não homogênea no espaço de Fourier na reconstrução, traduzindo-se em mapas caracterizados por resolução anisotrópica. A inclinação do estágio do espécime fornece uma solução generalizável para superar a anisotropia de resolução em virtude de melhorar a uniformidade das distribuições de orientação e, portanto, a isotropia da amostragem espacial de Fourier. O presente protocolo descreve uma estratégia de coleta de dados automatizada em estágio inclinado utilizando o software Leginon, para aquisição automatizada de imagens. O procedimento é simples de implementar, não requer nenhum equipamento ou software adicional e é compatível com a maioria dos microscópios eletrônicos de transmissão (METs) padrão usados para obtenção de imagens de macromoléculas biológicas.

A estimulação diafragmática por pressão diafragmática de 0,3 mg/mL foi usada para demonstrar imagens com inclinações de 0°, 30° e 60°. Dados de diferentes ângulos de inclinação foram coletados na mesma malha em diferentes regiões da grade. A resolução do CTF para inclinações angulares mais altas tende a ser pior, como foi o caso ao comparar os três conjuntos de dados neste estudo. A Figura 4 demonstra as imagens representativas comparativas e as médias de classificação 2D. Embora a concentra...

O presente protocolo descreve um esquema generalizado e de fácil implementação para coleta de dados de partícula única inclinada em experimentos de crio-EM. Tal procedimento é especialmente útil para a obtenção de um mapa EM de alta qualidade para amostras que sofrem de viés de orientação preferencial devido à aderência à interface ar-água.

Coleta de dados crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

A inclinação do estágio do espécime fornece uma maneira simples e generalizável de aumentar a distribuição de orientação das partículas durante a coleta de dados crio-EM de partícula única. A distribuição uniforme das partículas obtidas devido à inclinação do estágio do espécime permite a melhoria da qualidade geral do mapa e da interpretabilidade. Comece alinhando o microscópio para garantir a iluminação paralela do espécime e minimizar as aberrações do coma.Para identificar os quadrados adequados para a coleta de dados, registre um atlas de grade sem inclinação do estágio ou com inclinação do palco, que fornece uma visão geral da qualidade geral da grade e uma indicação inicial de áreas adequadas para a coleta de dados. Inspecione os quadrados manualmente na ampliação usada no nó de aquisição de quadrados. Procure os quadrados onde a folha está intacta, não parece desidratada e tem espessura de gelo ideal, e mova o estágio do espécime para um quadrado de interesse.Determine a altura eucêntrica para a posição do estágio usando um wobbler alfa em torno de 15 graus de inclinação do estágio e ajuste a altura Z para levar o estágio à altura eucêntrica usando o painel do teclado para o microscópio. Certifique-se de que a mudança de imagem seja mínima durante a rotina de oscilação alfa. Para encontrar uma altura Z mais precisa, estime no nó focalizador na ampliação usada no nó de aquisição quadrado.Ajuste as configurações do nó do focalizador e ative ou desabilite a opção de foco Z fino durante a fila inicial de quadrados. Em seguida, pressione Simular. Inclinar o estágio do espécime para o ângulo de inclinação desejado para a coleta de dados na altura eucêntrica verdadeira e recentralizar o estágio, se necessário.Pressione Simular no nó de aquisição quadrado para iniciar a fila de destinos para exposições inteiras do nó de aquisição. Em seguida, selecione um alvo de foco Z e regiões com furos adequados para exposições de alta ampliação e envie os alvos para a fila de geração de imagens. Traga o estágio do espécime de volta ao seu estado não inclinado e, em seguida, mova para o próximo quadrado.Repita essas etapas até que um número adequado de exposições inteiras tenha sido enfileirado. Depois que todos os quadrados estiverem na fila, vá para todo o nó de direcionamento e pressione Enviar destinos em fila. Selecione Permitir a verificação pelo usuário de alvos selecionados nas configurações do nó e inspecione manualmente os alvos selecionados pelo nó de aquisição de alta exposição à ampliação para testar se o localizador de furos EM automatizado pode identificar com precisão as regiões adequadas para aquisição de imagem quando o estágio da amostra é inclinado.Quando o usuário estiver satisfeito com a precisão da segmentação, desmarque a opção Permitir a verificação do usuário de destinos selecionados para coleta automatizada de dados. As imagens representativas da grade em ampliação quadrada com diferentes ângulos de inclinação coletados perto e longe da altura Z eucêntrica são mostradas aqui. O centro do feixe é indicado pelo centro dos anéis concêntricos vermelhos e a seta verde indica o quadrado de interesse.Há um recurso de grade quebrada adjacente ao quadrado de interesse para referência. Aqui são mostradas as exposições representativas de furos e médias de classe 2D coletadas em ângulos de inclinação de 0 graus, 30 graus e 60 graus. Embora a concentração de proteína seja inalterada nos diferentes ângulos de inclinação, um ângulo de inclinação mais alto faz com que a área fotografada pareça mais lotada em termos de concentração de partículas.As médias de classe 2D afetadas pela superlotação são mostradas nesta caixa vermelha. A simplicidade do protocolo permite que qualquer usuário padrão do microscópio adapte facilmente uma estratégia de coleta de dados inclinada.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Que vamos mostrar aqui como usar elétron cryotomography (ECT) para estudar a ultra-estrutura das células bacterianas em quase nativo estados, a "macromolecular" (~ 4 nm) resolução.

Electron Cryotomography de células bacterianas

Nós apresentamos um protocolo sobre como utilizar de alto rendimento tomografia crio-eletrônica para determinar alta resolução em estruturas in situ de máquinas moleculares. O protocolo permite que grandes quantidades de dados a serem processados, evita gargalos comuns e reduz o tempo de inatividade de recursos, permitindo que o usuário se concentrar em questões biológicas importantes.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

O protocolo aqui apresentado descreve o uso do Spotiton, um novo sistema robótico, para entregar duas amostras de interesse em uma grade de nanofios que se misturam por um mínimo de 90 ms antes da vitrificação em criogen líquido.

Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

Este protocolo demonstra como imaginar amostras biológicas conservadas por crio-preservados usando microscopia de iluminação estruturada crioes. Demonstramos a metodologia ao fotografar o citoesqueleto das células U2OS.

Coleta de dados microscópicos de iluminação crioesticamente estruturadas de células criogenicamente preservadas

A crescente demanda por coleta de dados em larga escala na tomografia criogênica de elétrons requer rotinas de aquisição de imagens de alto rendimento. Descrito aqui é um protocolo que implementa os recentes desenvolvimentos de estratégias avançadas de aquisição que visam maximizar o tempo-eficiência e o throughput da coleta de dados tomográficos.

Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

A determinação da estrutura dos complexos macromoleculares utilizando o crioEM tornou-se rotina para certas classes de proteínas e complexos. Aqui, este pipeline é resumido (preparação de amostras, triagem, aquisição e processamento de dados) e os leitores são direcionados para recursos e variáveis mais detalhados que podem ser alterados no caso de espécimes mais desafiadores.

Microscopia crio-elétron de partículas únicas: da amostra à estrutura

A microscopia crio-elétron de partículas únicas exige um pacote de software adequado e um pipeline fácil de usar para aquisição automática de dados de alto rendimento. Aqui, apresentamos a aplicação de um pacote de software de aquisição de imagens totalmente automatizado, o Latitude-S, e um pipeline prático para coleta de dados de biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose.

Software de aquisição de dados totalmente automatizado para microscopia crio-elétron de partículas únicas

Mapas crio-EM de alta resolução de macromoléculas também podem ser alcançados usando microscópios TEM de 200 kV. Este protocolo mostra as melhores práticas para definir alinhamentos ópticos precisos, esquemas de aquisição de dados e seleção de áreas de imagem que são essenciais para a coleta bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução usando um TEM de 200 kV.

Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

O presente protocolo descreve a aquisição remota de dados remotos crio-elétrons de alta resolução usando Tomo5 e processamento de dados subsequente e média de subtomogramas usando a emClarity. A apoferritina é usada como exemplo para ilustrar processos passo a passo detalhados para alcançar uma estrutura crio-ET com resolução de 2,86 Å.

Coleta remota de dados de tomografia crio-elétron e média de subtomograma

A triagem multigrade da microscopia crioeletrônica (cryoEM) é muitas vezes um processo tedioso que demanda horas de atenção. Este protocolo mostra como configurar uma coleção Leginon padrão e Smart Leginon Autoscreen para automatizar esse processo. Este protocolo pode ser aplicado à maioria das grades de folha de holey cryoEM.

Automação de triagem por microscopia crioeletrônica em várias redes usando o Smart Leginon

Esse protocolo padroniza a criotomografia eletrônica (crio-ET) para tecidos espessos, integrando congelamento de alta pressão (HPF) com o método waffle, levantamento por feixe de íons de foco criogênico (crio-FIB) e aquisição paralela e dose-simétrica, resultando em lamelas uniformemente finas e amostras vitrificadas para análise in situ reprodutível no hipocampo do camundongo.

Fluxo de trabalho de criotomografia eletrônica para tecidos espessos demonstrado em hipocampo de camundongos

Aprenda a coletar dados de crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon. Este método reduz o viés de orientação preferencial e melhora a qualidade dos mapas de EM em biologia estrutural.

Coleta de dados crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon

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