Modelo de queimadura de rato para estudar queimadura térmica cutânea de espessura total e infecção

Esse modelo de queimadura é capaz de recapitular as situações clínicas observadas em pacientes queimados hospitalizados após queimaduras, como desregulação imunológica e infecções bacterianas. Este método de indução de queimadura em ratos é de fácil aprendizado e pode ser utilizado para o desenvolvimento e avaliação de novas drogas tropicais para queimaduras e infecções. Esse modelo pode ser utilizado para avaliar a cicatrização de feridas, bem como a progressão da infecção bacteriana no local da queimadura.

Este método de indução de queimaduras também pode ser usado em ratos e outros modelos animais para indução de queimaduras e para estudar a infecção bacteriana de feridas de queimaduras. Comece a preparar o rato anestesiado para a lesão por queimadura, movendo-o sobre uma almofada de aquecimento em uma posição prona. Usando um aplicador com ponta de algodão, aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar a secagem da córnea.

Raspe a área dorsal do rato com um cortador elétrico em um grande retângulo das omoplatas até a base da cauda. Limpe os pelos soltos da área raspada usando o tecido embebido em solução salina. Aplique a loção de depilação na área raspada usando um aplicador com ponta de algodão.

Após três minutos, limpe a área com uma esponja de gaze molhada duas vezes para remover a loção e evitar a irritação da pele. Desligue o isoflurano e remova o cone do nariz antes de colocar o rato na gaiola de recuperação. No dia do experimento de lesão por queimadura, defina a temperatura do banho-maria para 97 graus Celsius e, uma hora antes do experimento, coloque 420 gramas de quatro hastes de cobre no banho-maria.

Uma vez que o rato não responda à pinça dos dedos dos pés em todos os membros, coloque-o na almofada de aquecimento em posição prona e injete 20 miligramas por quilograma de peso corporal de morfina através da raiz intraperitoneal, ou IP, para o controle da dor. Em seguida, verifique a temperatura do banho-maria. Ajuste o temporizador e coloque as luvas resistentes ao calor.

Pegue uma haste de cobre aquecida do banho-maria e toque-a na área do dorso por sete segundos. Aplique imediatamente as próximas três queimaduras, uma após a outra, usando uma haste por local de queimadura e produza uma queimadura de contato total de aproximadamente 20% da área total da superfície corporal. Após a queimadura, ressuscitar o animal injetando 0,1 mililitro por grama de peso corporal de solução de Ringer com lactato pela via IP.

Uma vez feito, desligue o isoflurano. Retire o cone do nariz e coloque o rato no tapete de calor. No dia da queimadura e infecção, centrifugar a cultura de Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus separadamente a 4.000 vezes g por 5 minutos.

Lave o pellet com solução salina normal antes de diluir o pellet usando solução salina a 0,1 densidade óptica a 600 nanômetros. Dilua 200 microlitros da suspensão bacteriana com 800 microlitros de solução salina e obtenha o inóculo bacteriano desejado de 2 por 10 para a 7ª unidade formadora de colônias ou UFC por mililitro. 15 minutos após a queimadura, injete por via subcutânea 50 microlitros de inóculo diluído das bactérias perto da área de queimadura usando uma agulha de calibre 29.

Coloque o rato na almofada de aquecimento para recuperação. Após 15 a 20 minutos, transfira o animal recuperado para uma gaiola limpa. Imediatamente após a queimadura, avaliar morfologicamente a lesão cutânea em termos de cor e margem.

Após a eutanásia, analise hemogramas completos para determinar o efeito da indução de queimaduras no sistema imunológico do hospedeiro. Coletar o tecido do rato eutanasiado em um tubo de coleta de 10 mililitros. Homogeneizar as amostras com homogeneizador de tecido e diluir em série os homogeneizados de tecido em soro fisiológico.

Placa 100 microlitros de homogeneizado não diluído e todas as diluições de cada amostra de tecido colhida de ratos infectados por P.Aeruginosa em placas de ágar cedrimida. Depois de incubar as placas por 16 a 18 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora, conte as colônias bacterianas nas placas. Multiplique-os pela razão de diluição para obter a contagem de UFC por mililitro e normalize-a com o peso do tecido para calcular o tecido do programa UFC.

Este protocolo altamente reprodutível resultou em uma lesão por queimadura de espessura total de terceiro grau em ratos. A cor da lesão por queimadura mudou de branco para marrom em 24 horas a 72 horas após a queimadura. Na análise histológica, as amostras de pele de animais queimados apresentaram lesão em todas as camadas às 24, 48 e 72 horas após a queimadura, enquanto a pele não queimada apresentou uma clara distinção das camadas de tecido epiderme, derme e subcutâneo.

Destruição da camada epidérmica e danos à espessura total da derme com gordura subcutânea e músculo esquelético foram observados em amostras de pele queimada. Em 24 horas pós-queima, uma queimadura de espessura total foi de mais de 2,61 milímetros de profundidade. Na avaliação da depuração bacteriana, a recuperação bacteriana foi observada em todos os ratos com lesão por queimadura.

Durante a infecção por P.aeruginosa PAO1, o número de bactérias recuperadas 24 horas após a infecção da pele do rato queimado foi menor do que o inóculo inicial de 1 por 10 para a 6ª UFC. No entanto, aumentou 48 e 72 horas após a infecção. Na infecção por S.aureus, ATC25923, observou-se aumento de 2 log 10 em todos os momentos da pele em comparação com o inóculo inicial, sugerindo que o estabelecimento da infecção por S.aureus resultou da replicação ativa nos tecidos.

O tecido subcutâneo e os músculos apresentaram maior carga bacteriana que o pulmão e o baço. Os dados mostraram que ratos queimados desenvolveram uma infecção sistêmica 24 horas após a inoculação com P.aeruginosa e 48 horas após a inoculação com S.aureus. Remover completamente os pelos no dorso do rato e manter a temperatura e o tempo de indução da queimadura conforme mencionado no protocolo.

O cabelo restante e a temperatura diferente das hastes de cobre podem afetar a qualidade da queimadura. O modelo de queimadura em ratos pode ser explorado para avaliar novas terapêuticas tópicas para o tratamento de infecções de feridas por queimaduras e para avaliar diferentes curativos.