Name: Ex Vivo Análise de Transientes de Ca2+ Ativados Mecanicamente em Células Uroteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Aprenda a analisar transientes de Ca²⁺ ativados mecanicamente em células uroteliais ex vivo usando o sensor fluorescente GCaMP5G. Este protocolo acessível permite estudar mecanotransdução em tecidos nativos.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do NIH R01DK119183 (para G.A. e MDC) e S10OD028596 (para G.A.) e pelo Cell Physiology and Model Organism Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

O cuidado e o manuseio dos animais foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Camundongos C57Bl/6J fêmeas de 2-4 meses de idade foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais).
1. Montagem e configuração do equipamento
<ol><li>Realize imagens Ca2+ com um microscópio vertical equipado com uma câmera de alta resolução e uma fonte de luz estável (consulte Tabela de materiais).<ol><li>Adquira as imagens com um software compatível com microscópio que permita o controle direto da câmera, da fonte de luz e do atuador piezo por meio de um dispositivo de E/S digital USB (consulte Tabela de materiais). Observação : Figura 1 representa um esquema da instalação. GCaMP5G tem um comprimento de onda de excitação de pico de 470 nm e um comprimento de onda de emissão de pico de 497 nm28. Use um cubo de filtro adequado para imagens GCaMP5G.</li>
	</ol></li>
	<li>Para a estimulação de células uroteliais individuais na preparação da mucosa da bexiga (ver passo 2), utilize um atuador piezoelétrico controlado por um controlador piezo de circuito aberto de canal único (ver Tabela de Materiais). Monte o atuador piezoelétrico em um micromanipulador.<ol><li>Monte as micropipetas de vidro em um suporte de pipeta afixado ao atuador piezoelétrico (Figura 1). Operar remotamente o controlador piezo por um conversor analógico/digital controlado por um programa de aquisição e análise de dados eletrofisiológicos (consulte Tabela de Materiais). NOTA: Um gatilho externo, na forma de um sinal de lógica transistor-transistor (TTL) iniciado pelo software de imagem, é utilizado para acionar o protocolo de estimulação no software de aquisição e análise de dados eletrofisiológicos que movimenta o atuador piezoelétrico (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique se o software de geração de imagens (consulte Tabela de materiais) faz interface com o dispositivo de E/S digital. Configure um canal de saída digital no dispositivo de E/S digital USB para entregar o sinal TTL ao conversor analógico/digital, que iniciará o protocolo no software de eletrofisiologia que move o atuador piezoelétrico.<ol><li>Use um cabo para conectar a porta Start BNC no conversor analógico/digital ao aterramento (GND) e um terminal de parafuso no dispositivo de E/S digital USB.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure o protocolo de gravação no software de imagem. Observação : as etapas a seguir descrevem como gerar um protocolo que enviará um sinal TTL e iniciar a coleta de imagens em intervalos de tempo especificados.<ol><li>Configure o protocolo de aquisição no software de imagem clicando no Gerenciador de Experimentos e selecionando Novo Experimento. Uma nova janela será aberta.</li>
		<li>Selecione o ícone Time Lapse Loop e arraste-o para a janela recém-aberta; defina o número de ciclos como 2 e o intervalo como a configuração mais rápida permitida na configuração.</li>
		<li>No ícone Obturador transmitido/obturador manual, selecione o ícone NI USB-6501 e arraste-o para a janela Time Lapse Loop e, em seguida, defina o NI USB-6501 como fechado. Arraste um NI USB-6501 adicional do obturador transmitido/obturador manual para a janela Time Lapse Loop e defina-o como aberto. Para conectar os dois ícones NI USB-6501, arraste a ponta de seta na lateral do ícone fechado NI USB-6501 e puxe até que ele toque no ícone aberto NI USB-6501. Uma linha que conecta os dois ícones será exibida.</li>
		<li>Arraste outro Time Lapse Loop para a janela do Gerenciador de Experimentos e conecte-o ao primeiro puxando a ponta da seta. Defina os parâmetros para gravação. Defina o número de ciclos do novo Time Lapse Loop como 2400.</li>
		<li>No ícone Aquisição de imagem , arraste o filtro GFP para o loop de lapso de tempo recém-aberto e defina o tempo de exposição para 100 ms.</li>
		<li>Defina o tipo de imagem da câmera como 8 bits, a resolução como 576 x 576 (Binning 4 x 4), o clock de pixels para 480 MHz e a correção de pixels quentes como padrão. NOTA: Os parâmetros podem ser ajustados dependendo do nível de expressão do sensor fluorescente, da sensibilidade da câmera e da configuração da configuração.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure o Lab Bench no software de eletrofisiologia (consulte Tabela de Materiais). NOTA: Isso definirá o sinal de saída em mV do conversor analógico/digital.<ol><li>Vá para o menu Configurar no software de eletrofisiologia e selecione Lab Bench. Na janela Sinais de Saída resultante, selecione Saída Analógica #1, pressione o sinal Adicionar e nomeie-o (por exemplo, "Piezo"). Defina a Unidade de Sinal como mV e o Fator de Escala (mV/V) como 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Gerar um protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia seguindo os passos abaixo.<ol><li>Para gerar um novo protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia, vá para o item de menu Adquirir e selecione Novo Protocolo.</li>
		<li>Defina Modo/Taxa como Estimulação Episódica, Executar/Julgamento como 1, Varrer/Executar como 1 e Duração (s) da Varredura como 150.</li>
		<li>No menu Saídas , selecione o canal #1 Piezo como Saída analógica.</li>
		<li>No menu Acionador , defina o gatilho como Digitador Iniciar Entrada e Temporizador Interno.</li>
		<li>No menu Forma de onda, selecione o canal #1 e Forma de onda analógica com Épocas. Defina a Etapa A como Etapa, o Primeiro Nível como 0, o Nível Delta como 0, a Primeira duração como 10000 e a Duração Delta como 0.</li>
		<li>Defina a Etapa B como Etapa, o Primeiro nível como 10, o Nível Delta como 0, a Primeira Duração como 1000 e a Duração Delta como 0. Defina a Etapa C como Etapa, o Primeiro Nível como 0, o Nível Delta como 0, a Primeira Duração como 130000 e a Duração Delta como 0.</li>
		<li>Salve o protocolo e nomeie-o Protocolo de estimulação.</li>
	</ol></li>
	<li>Use um cabo BNC para conectar a Saída Analógica #1 no conversor analógico/digital à ENTRADA EXT na frente do controlador piezo de circuito aberto de canal único (consulte Tabela de Materiais).</li>
	<li>Fabricar micropipetas de vidro para a estimulação mecânica de células guarda-chuva a partir de tubos de vidro capilar seguindo os passos abaixo.<ol><li>Coloque o vidro capilar em um extrator (consulte Tabela de Materiais) e ajuste-o com os botões de retenção capilar.</li>
		<li>Posicione a unidade de aquecimento em toda a sua altura. Ajuste o primeiro controle deslizante de posição de terminação de tração do extrator para 5.</li>
		<li>Ajuste o primeiro botão do aquecedor para 76,7 e o segundo botão para 52,7.</li>
		<li>Puxe o capilar de vidro em duas etapas pressionando o botão Iniciar.</li>
		<li>Feche a ponta da micropipeta com uma microforja (ver Tabela de Materiais) com o botão de ajuste do aquecedor ajustado a 60. NOTA: Para o presente protocolo, o diâmetro final da ponta da micropipeta usada para cutucar células individuais é de ~1-3 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique se a micropipeta estimulante move a distância especificada no protocolo de estimulação. NOTA: Os passos a seguir são para garantir que 12,5 s após o início do protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia, um pulso de tensão com duração de 1 s seja gerado, fazendo com que o atuador piezoelétrico se mova 20 μm.<ol><li>Monte uma micropipeta no suporte e prenda-a ao atuador piezoelétrico.</li>
		<li>Coloque o atuador piezoelétrico e a micropipeta anexada paralelamente ao centro do estágio do microscópio e dentro da área de visão.</li>
		<li>Concentre-se na ponta da pipeta e imobilize a haste de montagem piezoelétrica (consulte Tabela de materiais) com fita adesiva. Sob iluminação de campo brilhante, ajuste os parâmetros da câmera para obter uma imagem clara da ponta da pipeta.</li>
		<li>Abra o protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia e configure-o para jogar. NOTA: O protocolo de eletrofisiologia não será iniciado até que o sinal TTL enviado pelo software de imagem seja recebido.</li>
		<li>No Gerenciador de experimentos no software de geração de imagens, pressione Iniciar para iniciar a aquisição de dados. NOTA: Isso acionará o protocolo no software de eletrofisiologia, que acionará o atuador piezoelétrico. O protocolo no software de imagem irá gerar um arquivo com as imagens do experimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Verifique a distância percorrida pela pipeta seguindo os passos abaixo.<ol><li>Para medir a distância percorrida pela pipeta durante o protocolo de estimulação, selecione o item Contar e Medir no software de imagem.</li>
		<li>No menu Medida , selecione a opção Medição e ROI e uma nova janela aparecerá abaixo da janela do filme.</li>
		<li>No menu Medida , escolha a Linha Arbitrária.</li>
		<li>Na janela do filme, desenhe uma linha arbitrária começando na ponta da pipeta. Observe que o final da linha arbitrária será ajustado posteriormente.</li>
		<li>Clique com o botão direito do mouse na linha arbitrária para converter a linha em uma região de interesse (ROI), que será visível em todos os quadros de filmes.</li>
		<li>Inspecione o filme e ajuste o final da linha arbitrária (ROI) para a posição final percorrida pela pipeta em resposta ao estímulo. NOTA: A distância percorrida pela pipeta em μm aparecerá na janela Medição e ROI . O protocolo de estimulação pode ser modificado de acordo com as necessidades do usuário.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transdução in situ e isolamento da mucosa vesical
<ol><li>Transduzir bexigas de camundongos fêmeas in situ com um adenovírus que codifica o cDNA do CGaMP5G de acordo com o procedimento descrito no protocolo de transdução do vírus31.<ol><li>Ao transduzir células uroteliais para experimentos de imagem Ca2+ , instilar as bexigas com 50 μL da solução contendo 2 x 107 partículas virais infecciosas (PIV). NOTA: Esta técnica tende a restringir a expressão de CGaMP5G para a camada de célula guarda-chuva. Alternativamente, experimentos poderiam ser conduzidos com bexigas urinárias colhidas de camundongos transgênicos expressando CGaMP5G em células uroteliais (ou seja, expressão de GCaMP5G impulsionada por um promotor de uroplacina-2) ou qualquer outro tipo de célula de interesse.</li>
	</ol></li>
	<li>24-72 h após a transdução, eutanasiar os ratos por asfixia por CO2 e realizar uma toracotomia, abrindo a cavidade torácica com tesoura para causar o colapso dos pulmões.</li>
	<li>Canular a uretra com cateter 24 G. Exponha a bexiga por uma incisão abdominal de ~1,5 cm através da pele e do músculo e use uma sutura de 6,0 (ver Tabela de Materiais) para fixar o cateter à uretra.</li>
	<li>Colhe-se a bexiga e a uretra32 e afixe uma almofada de suporte de borracha de silicone (ver Tabela de Materiais) banhada em solução de gravação contendo (em mM): 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl 2,2,5 CaCl2, 10 glicose, 10 HEPES, pH 7,4 e borbulhada com 100% O2 (Figura 2A).</li>
	<li>Separe a mucosa vesical da camada muscular subjacente com pinça fina, seguindo relatos publicados anteriormente32 (Figura 2B).</li>
	<li>Abrir a mucosa da bexiga e fixá-la com o urotélio voltado para uma inserção de elastômero de silicone no fundo de um prato cultivado com tecido de 35 mm de diâmetro (Figura 2C).</li>
</ol>3. Estimulação mecânica de células uroteliais individuais e imagens de Ca2+
<ol><li>Monte o prato cultivado com a mucosa vesical fixada no estágio microscópico equipado com uma incubadora de prato de cultura com elementos de aquecimento resistivo (Figura 2E). Perfundir (seguindo as instruções do fabricante, ver Tabela de Materiais) a placa de cultura celular continuamente a uma taxa de 1,7 mL/min com solução de gravação aquecida a ~37 °C com um aquecedor em linha.</li>
	<li>Manter a temperatura da incubadora e das soluções de placas de tecido a ~37 °C com um modelo de controlador de temperatura bipolar de canal duplo (ver Tabela de Materiais). Equilibrar o tecido na câmara com perfusão contínua por pelo menos 15 minutos antes de realizar procedimentos experimentais adicionais.</li>
	<li>Para registrar os transientes de Ca2+ induzidos mecanicamente, submerja a micropipeta na solução banhando a mucosa da bexiga fixada no prato de tecido. Mova a micropipeta para o centro do campo com a ajuda de uma objetiva de varredura de baixa ampliação (4x) usando iluminação de campo brilhante.<ol><li>Mova a micropipeta para perto da superfície do tecido urotelial movendo coordenadamente o micromanipulador no plano vertical e ajustando o foco.</li>
		<li>Mude a objetiva para uma com maior ampliação (20x) adequada para imunofluorescência com alta abertura numérica (NA).</li>
		<li>Defina o micromanipulador como Fino e mova a micropipeta para perto da parte superior da célula alvo.</li>
		<li>Altere o campo de visão para câmera e pressione Live no software de imagem. NOTA: Isso deve ligar o obturador refletido e permitir a observação do sinal fluorescente emitido pelo tecido no computador.</li>
		<li>Ajuste o foco para visualizar a parte superior da célula e ajuste a posição da pipeta, se necessário.</li>
		<li>Abra o protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia e configure-o para jogar. NOTA: O protocolo no software de eletrofisiologia não será iniciado até que o sinal TTL enviado pelo software de imagem seja recebido.</li>
		<li>No Gerenciador de experimentos no software de geração de imagens, pressione Iniciar para iniciar a aquisição de dados. Isso acionará o protocolo no software de eletrofisiologia, que acionará o atuador piezoelétrico e gerará um arquivo com as imagens do experimento. O protocolo de estimulação pode ser modificado de acordo com as necessidades do usuário.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise dos dados
<ol><li>Quantifique a intensidade de fluorescência ao longo do tempo seguindo as etapas abaixo.<ol><li>Abra o arquivo de imagem no software de imagem e selecione a janela Contagem e Medida . Selecione a ferramenta de polígono e desenhe um ROI nos limites da célula que foi cutucada.</li>
		<li>Vá para a janela Medida, selecione Perfil de Intensidade, defina a medição como Ao longo do tempo, Resultados como Média, Subtração em segundo plano como nenhuma e pressione Executar. A intensidade média de fluorescência será calculada ao longo do tempo (Figura 3).</li>
		<li>Para exportar os dados do perfil de intensidade, clique no ícone do Excel na janela Resultados do Perfil de Intensidade. Isso permitirá que o usuário escolha a pasta de destino e o nome do arquivo e salve os dados em um formato .xlsx.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar análise de dados utilizando gráficos científicos e software de análise de dados (ver Tabela de Materiais). NOTA: A amplitude do pico de Ca2+ evocado por cutucada é expressa como a mudança na intensidade de fluorescência (ΔF/F), onde F é a intensidade de fluorescência de GCaMP5G no tempo 0, e ΔF é a diferença entre os máximos de intensidade de fluorescência e o basal no tempo 0. O decaimento da resposta Ca2+ também pode ser calculado (não mostrado).</li>
</ol>

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<li>Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+bacterial+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The evolution of bacterial mechanosensitive channels.</a> Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Todos os organismos, e aparentemente a maioria dos tipos celulares, expressam canais iônicos que respondem a estímulos mecânicos 20,33,34,35,36,37. A função desses canais ativados mecanicamente tem sido predominantemente avaliada com a técnica patch-praçad. No entanto, devido a problemas de acessibilidade, os estudos patch-cl...

As células epiteliais do trato urinário são submetidas a forças mecânicas à medida que o filtrado urinário viaja através dos néfrons, e a urina é bombeada para fora da pelve renal e viaja através dos ureteres para ser armazenada na bexiga urinária. Há muito se reconhece que as forças mecânicas (por exemplo, tensão de cisalhamento e estiramento) exercidas por fluidos nas células epiteliais que revestem o trato urinário regulam a reabsorção de proteínas no túbulo proximal e de solutos no néfron distal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, bem como o armazenamento de urina na bexiga urinária e micção14,15,16,17.
A conversão de estímulos mecânicos em sinais elétricos e bioquímicos, processo denominado mecanotransdução, é mediada por proteínas que respondem à deformação das estruturas celulares ou da matriz extracelular associada 18,19,20,21. Os canais iônicos ativados mecanicamente são únicos no sentido de que fazem a transição de um estado fechado para um estado permeável aberto em resposta a mudanças na tensão, pressão ou tensão de cisalhamento da membrana 18,19,20,21,22. Além disso, os transientes de Ca 2+ podem ser iniciados por mecanotransdução mediada por integrina ou por ativação de sistemas de adesão mecanorresponsivos em junções célula-célula23,24,25,26. A função do canal iônico é geralmente avaliada com a técnica patch-clamp, que envolve a formação de uma vedação gigaohm entre a membrana celular e a pipetapatch-27. No entanto, células localizadas em camadas profundas de tecido com uma matriz extracelular densa (por exemplo, túbulos renais) ou cercadas por uma barreira física (por exemplo, glicocálice) são de difícil acesso com uma micropipeta de vidro. Da mesma forma, células embutidas ou que são partes integrantes de tecidos com baixa estabilidade mecânica (por exemplo, o urotélio) não podem ser prontamente estudadas com a técnica patch-clamp. Como muitos canais iônicos ativados mecanicamente são permeáveis ao Ca 2+, uma abordagem alternativa é avaliar sua atividade por microscopia fluorescente usando um corante sensível ao Ca2+ ou indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como o GCaMP. Esforços recentes em engenharia de proteínas aumentaram significativamente a faixa dinâmica, a sensibilidade e a resposta dos GECIs28,29,30, e os avanços na genética permitiram sua expressão em populações celulares específicas, tornando-as ideais para estudar a mecanotransdução.
O urotélio, epitélio estratificado que recobre o interior da bexiga urinária, funciona como uma barreira, impedindo a difusão de solutos urinários no interstício vesical, mas também funciona como transdutor, sentindo a plenitude vesical e comunicando esses eventos aos nervos e musculatura subjacentes16. Estudos prévios mostraram que a comunicação entre o urotélio e os tecidos subjacentes requer os canais iônicos ativados mecanicamente Piezo1 e Piezo231. Para avaliar transientes de Ca 2+ induzidos mecanicamente em células uroteliais, uma nova técnica descrita que usa transferência de genes adenovirais para expressar o sensor de Ca2+ GCaMP5G em células uroteliais foi desenvolvida. Esta técnica emprega uma preparação de folha mucosa que fornece fácil acesso à camada celular guarda-chuva mais externa e um sistema assistido por computador para a estimulação mecânica simultânea de células individuais com uma micropipeta de vidro fechada e registro de mudanças na fluorescência ao longo do tempo.

<table><tbody><tr><td>20x Objetiva</td><td>Olympus</td><td>UMPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>24 G &frac34; &rdquo; cateter</td><td>Medline&nbsp;</td><td>Lâmina Suresite IV</td><td></td></tr><tr><td>4x Objetiva</td><td>Olympus</td><td>UPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>Conversor analógico/digital</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP anticorpo</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab6556</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de feixe</td><td>Chroma</td><td>T495lpxr</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura bipolar&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21114-1L</td><td>1 M</td></tr><tr><td>solução cellSens software</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>CMOS câmera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA fusão</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro&nbsp;</td><td>Croma&nbsp;</td><td>ET470/40X</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro Corning 8250 vidro</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>G85150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Aquecedor</td> em linha Sigma <td>H4034</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda XL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação da bomba do coletor</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-510</td><td>ID 1.52 mm</td></tr><tr><td>Tubulação da bomba do coletor</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-533</td><td>ID 2.79 mm</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Mouses&nbsp;</td><td>Jackson Lab</td><td>664</td><td>2-4 meses de idade fêmea C57BL/6J</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige&nbsp;</td><td>Micromanipulador MF-830</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX51W</td><td></td></tr><tr><td>Montagem de mídia com DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36964&nbsp;</td><td>Slowfade Diamond Antifade com DAPI</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Software Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>pClamp</td><td>Molecular Devices</td><td>Versão 10.4</td><td>Software de aquisição e análise de dados de eletrofisiologia Patch-clamp</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Atuador piezoelétrico</td><td>Thorlabs</td><td>PAS005</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de pipeta</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Narishige</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Base aquecida de troca rápida com perfusão e kit de anel adaptador</td><td>Plataforma de troca rápida Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td>se encaixa em prato de 35 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Rodamina-faloidina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Plot</td><td>Systat Software Inc</td><td>Versão 14.0</td><td>Software de análise de dados e gráficos científicos&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Elastômero de silicone</td><td>Dow</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Controlador piezo de circuito aberto de canal único</td><td>Thorlabs</td><td>MDT694B</td><td></td></tr><tr><td>Almofada quadrada de suporte de grade</td><td>Ted Pella</td><td>10520</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>AD Surgical</td><td>S-S618R13</td><td>6-0 Haste de</td></tr><tr><td>montagem de Teflon</td> Sylk <td>Feito sob medida</td><td></td><td>Use para montar o atuador piezoelétrico no micromanipulador</td></tr><tr><td>Tubulação</td><td>Fisher Scientific</td><td>14171129</td><td>Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN</td></tr><tr><td>Dispositivo de E/S Digital USB&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo análise de transientes de ca2+ ativados mecanicamente em células uroteliais

Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

Canais iônicos ativados mecanicamente são transdutores biológicos que convertem estímulos mecânicos, como forças de estiramento ou cisalhamento, em sinais elétricos e bioquímicos. Em mamíferos, os canais ativados mecanicamente são essenciais para a detecção de estímulos externos e internos em processos tão diversos quanto a sensação de toque, audição, regulação do volume dos glóbulos vermelhos, regulação da pressão arterial basal e sensação de plenitude da bexiga urinária. Embora a função dos canais iônicos ativados mecanicamente tenha sido extensivamente estudada no cenário in vitro usando a técnica patch-pamp, avaliar sua função em seu ambiente nativo continua sendo uma tarefa difícil, muitas vezes devido ao acesso limitado aos locais de expressão desses canais (por exemplo, terminais aferentes, células de Merkel, barorreceptores e túbulos renais) ou dificuldades na aplicação da técnica patch-clamp (por exemplo, as superfícies apicais das células guarda-chuva uroteliais). Este protocolo descreve um procedimento para avaliar transientes de Ca 2+ evocados mecanicamente usando o sensor fluorescente GCaMP5G em uma preparação urotelial ex vivo, uma técnica que poderia ser prontamente adaptada para o estudo de eventos de Ca2+ evocados mecanicamente em outras preparações de tecidos nativos.

O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar transientes de Ca 2+ evocados mecanicamente em células guarda-chuva usando o sensor fluorescente de Ca2+ GCaMP5G. A transdução adenoviral foi empregada para expressar GCaMP5G em células uroteliais devido à sua alta eficiência e por produzir um nível elevado de expressão. Imagens fluorescentes de criosecções coradas de uma bexiga transduzida são mostradas na Figura 2D. Para esses experimentos, a expressão de GCaMP5G ...

Este protocolo descreve uma metodologia para avaliar a função de canais iônicos ativados mecanicamente em células uroteliais nativas usando o sensor fluorescente Ca2+ GCaMP5G.

Ex Vivo Análise de Transientes de Ca2+ Ativados Mecanicamente em Células Uroteliais

Mechanically activated ion channels are biological transducers that convert mechanical stimuli such as stretch or shear forces into electrical and ...

Este protocolo descreve uma técnica para estudar o evento de cálcio evocado mecanicamente em uma preparação urotelial ex vivo. A técnica é relativamente fácil de executar e pode ser adaptada para estudar o evento de cálcio evocado mecanicamente em outras preparações de tecidos nativos. Fabrice as micropipetas colocando o vidro capilar no extrator e ajustando-o com os botões de retenção capilar.Puxe o capilar de vidro em duas etapas, de acordo com as instruções do fabricante. Feche a ponta das micropipetas usando uma microforja com o botão de ajuste do aquecedor ajustado em 60. Depois de expor a bexiga e o osso pélvico do rato eutanasiado, quebre o osso pélvico para expor a uretra e canule a uretra com um cateter de calibre 24.Use uma sutura 6-0 para prender o cateter à uretra. Colha a bexiga e a uretra e fixe-as em uma almofada de suporte de borracha de silicone banhada na solução de gravação. Separe a mucosa da bexiga da camada muscular subjacente com pinça fina.Abra a mucosa da bexiga e fixe-a com o urotélio voltado para uma inserção de elastômero de silicone no fundo de um prato de cultura de tecido de 35 milímetros de diâmetro. Monte a placa de cultura de tecidos com a mucosa da bexiga fixada no estágio de microscópio equipada com uma incubadora de pratos de cultura com elementos de aquecimento resistivo. Perfundir o prato de cultura celular continuamente a uma taxa de 1,7 mililitro por minuto com uma solução de gravação aquecida a 37 graus Celsius com um aquecedor em linha.Mantenha a temperatura da incubadora e das soluções de prato de tecido a aproximadamente 37 graus Celsius com um controlador de temperatura bipolar de canal duplo. Para registar os transientes de iões de cálcio induzidos mecanicamente, submerja a micropipeta na solução de registo. Sob iluminação de campo brilhante, usando uma objetiva de varredura de baixa ampliação, mova a micropipeta para o centro do campo.Mova o micromanipulador no plano vertical e ajuste o foco para mover a pipeta perto da superfície do tecido urotelial. Mude para a objetiva com maior ampliação e abertura numérica adequada para imunofluorescência. Ajuste o micromanipulador para fino e mova a pipeta perto do topo da célula alvo.Se necessário, ajuste o foco e a posição da pipeta. Abra o protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia e configure-o para jogar. Ajuste o foco e pressione start no gerenciador de experimentos para iniciar a aquisição de dados.Isso aciona o atuador piezoelétrico e gera um arquivo com as imagens do experimento. Quando a célula é estimulada, observa-se um aumento na fluorescência. Para quantificar a intensidade fluorescente, abra o arquivo de imagem no software de imagem e selecione a janela de contagem e medida.Reproduza o filme para identificar a célula estimulada. Selecione a ferramenta de polígono e desenhe um ROI nos limites da célula que foi cutucada. Vá para a janela de medição, selecione perfil de intensidade, defina a medição como horas extras, os resultados como média, a subtração em segundo plano como nenhuma e pressione executar.A intensidade média de fluorescência será calculada ao longo do tempo. Para exportar os dados do perfil de intensidade, clique no ícone do Excel na janela de resultados do perfil de intensidade e realize a análise de dados usando gráficos científicos e software de análise de dados. Neste estudo, a célula guarda-chuva foi cutucada para avaliar os transientes de cálcio evocados mecanicamente.A imagem capturada em 10 segundos mostra uma visão fluorescente da pipeta estimulante posicionada no topo de uma célula guarda-chuva expressando um sensor de cálcio fluorescente GCaMP5G. A estimulação mecânica da célula guarda-chuva que expressa o sensor de cálcio causa uma deformação seguida por um rápido aumento na emissão de fluorescência. O gráfico demonstra uma mudança na intensidade de fluorescência plotada em função do tempo para várias células.A cutucada evoca uma resposta de cálcio na maioria das células guarda-chuva transduzidas com um sensor de cálcio fluorescente. O passo mais importante é colher a bexiga e a uretra, seguido de afixá-los a uma almofada de suporte de borracha de silicone. Evite danos nos tecidos ao separar a mucosa da bexiga da camada muscular subjacente.Métodos de imagem como o descrito aqui podem fornecer uma visão única de como os canais ativados por mecano enviam mudanças em seu ambiente nativo e geram respostas fisiológicas.

ex-vivo-analysis-mechanically-activated-ca2-transients-urothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso

Este vídeo demonstra a caracterização das correntes catiônicas dos canais iônicos de melastatina tipo 4 (TRPM4) com potencial receptor transitório em células musculares lisas detrusoras usando a técnica de patch-clamp perfurado mediado por anfotericina B. A técnica ajuda a avaliar as propriedades biofísicas e farmacológicas dos canais iônicos.

Análise de Patch-Clamp Perfurado Mediada por Anfotericina B: Uma Técnica Eletrofisiológica para Estudar Correntes Iônicas em Células da Bexiga Urinária

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Ca2 + indicadores geneticamente codificados (GECIs) mudaram radicalmente como in situ Ca2 + imagem é executada. Para maximizar a recuperação de dados de tais gravações, a análise adequada dos sinais de Ca2 + é necessária. Os protocolos neste papel facilitam a quantificação de Ca2 + sinais gravados em situ usando spatiotemporal mapeamento e análise baseada em partículas.

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ

Descrevemos um método de preparação das únicas células musculares lisas dedestruição recém-isoladas de espécimes da bexiga urinária humana que empregam um procedimento enzimático de duas etapas. As células DSM viáveis obtidas podem ser estudadas por várias técnicas de células únicas, incluindo a biosfisiologia de grampo-patch-grampo dentre-aniciana-B descrita para revelar propriedades fisiológicas e farmacológicas.

Preparação e Utilização de células musculares lisas recém-isoladas para caracterização de correntes de cisão sensíveis ao 9 fenantropo

O modelo de bexiga livre de detrusor permite o acesso direto ao suburotelio para estudar os mecanismos locais de regulação da disponibilidade de mediadores biologicamente ativos na propria suburotelio/laminado durante o armazenamento e a anulação da urina. A preparação assemelha-se pròxima ao enchimento de uma bexiga intata e permite que os estudos do pressão-volume sejam executados sem influências sistemáticas.

Modelo de bexiga de urina de urina descentralizada (Ex Vivo) com o músculo destrusor removido para acesso direto ao suburotelio durante o enchimento da bexiga

Um modelo de camundongos de uropatogenic E. coli (UPEC) inoculação transuretral para estabelecer reservatórios de bexiga intracelular latente e subsequente exposição à bexiga a G. vaginalis para induzir a UTI UPEC recorrente é demonstrado. Também são demonstradas a enumeração de bactérias, citologia urinária, e fixação e processamento in situ bexiga para a varredura de microscopia eletrônica.

Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

Este protocolo descreve o procedimento para medir as concentrações de ATP no lúmen da bexiga em um roedor anestesiado.

In vivo Medição Luminal da Liberação de ATP Urotelial Evocado por Distensão em Roedores

São descritos métodos para a geração de grandes quantidades de adenovírus recombinantes, que podem então ser usados para transduzir o urotélio nativo de roedores, permitindo a expressão de transgenes ou downregulation de produtos gênicos endógenos.

Expressão de Transgenes no Urotélio da Bexiga Nativa utilizando Transdução Mediada por Adenovírus

Este protocolo apresenta um método otimizado para isolar o revestimento epitelial da uretra da fêmea adulta do camundongo para análises posteriores, incluindo citometria de fluxo, imunocoloração e cultura organoide. Os métodos forneceram células epiteliais uretrais enriquecidas e viáveis, como evidenciado pela análise de citometria de fluxo, imagem de montagem total e formação eficiente de organoides.

Um método otimizado para isolar epitélio uretral feminino de camundongos para análise de células únicas e imunofluorescência

Aprenda a analisar transientes de Ca²⁺ ativados mecanicamente em células uroteliais ex vivo usando o sensor fluorescente GCaMP5G. Este protocolo acessível permite estudar mecanotransdução em tecidos nativos.

Ex Vivo Análise de Transientes de Ca²⁺ Ativados Mecanicamente em Células Uroteliais

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