Ensaio de ponto vazio em tempo real

O método descrito neste relato pode ser utilizado para compreender aspectos fisiológicos e neurocomportamentais da micção voluntária em estados de saúde e doença. Essa técnica permite monitorar o comportamento do volume do mouse nas fases clara e escura do dia, além de fornecer informações temporais, espaciais e volumétricas sobre eventos miccionais. Para preparar um ensaio de ponto vazio em tempo real ou uma câmara de gravação RT-VSA, coloque um papel de filtro fino ou grosso, dependendo da hora do dia, na parte inferior da gaiola de gravação RT-VSA.

Por cima do papel de filtro, colocar um iglu de plástico para dormir;um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml para fins de enriquecimento;e um prato de plástico de 60 mm x 15 mm contendo dois ou três pedaços de ração seca para ratinhos;e 14 a 16 gramas de água sob a forma de uma embalagem de gel. Quando a câmara de gravação estiver pronta, coloque suavemente o mouse sobre o papel de filtro. Certifique-se de que a transferência do mouse da gaiola de alojamento para a gaiola de gravação ocorra com o mínimo de estresse.

Uma vez que o mouse está dentro da gaiola de gravação, coloque a tampa e cubra a parte superior da tampa com uma almofada azul de bancada absorvente para minimizar os reflexos diretos da luz ambiente na superfície da tampa de plexiglass. Acenda as luzes ultravioletas na câmara baixa. Para gravar vídeo RT-VSA a partir das câmeras superior e inferior, use o software de gravação de vigilância por vídeo configurado para gravar simultaneamente de várias webcams ou câmeras em rede.

Inicie a gravação pressionando Cmd R na janela do programa. Execute gravações de vídeo a um quadro por segundo. Imediatamente após iniciar as gravações, saia da sala e feche a porta suavemente.

Certifique-se de que a sala permaneça silenciosa durante todo o experimento. Pare as gravações pressionando Cmd T.Desligue as luzes ultravioletas. Depois de parar a gravação, o software gera automaticamente um arquivo de filme no formato m4v para cada câmera e o salva sob o nome da câmera em uma pasta de destino selecionada anteriormente.

Verifique se dentro da pasta de cada câmera os experimentos estão organizados em pastas por data. Em cada data ou pasta de experimento, verifique se há um arquivo m4v e todos os arquivos jpeg individuais que correspondem a cada quadro de filme. Crie uma pasta na área de trabalho com o nome e a data do experimento e transfira os arquivos m4v para essa pasta.

Copie a pasta do filme em uma unidade flash para análise em um computador externo. Abra um arquivo de filme coletado pela câmera inferior durante a fase clara ou pela câmera superior durante a fase escura para análise. Depois de avaliar a qualidade do filme, analise os experimentos movendo-se para a janela de tempo correta usando o comando de avanço rápido ou o controle deslizante da barra de tempo.

A atividade miccional durante a fase clara é registrada entre 11:00 e 17:00, e durante a fase escura, entre meia-noite e 6:00 horas. Reproduza o filme no modo de avanço rápido clicando no ícone de avanço rápido ou role manualmente pelo filme, procurando evidências de que o mouse está anulando. Procure o aparecimento repentino de manchas brilhantes de urina no papel de filtro ou as mudanças comportamentais, incluindo movimento para os cantos da gaiola e um breve período de inatividade quando o rato está miccionando. Registre o horário em que cada vazio ocorre.

Como convenção, o tempo da micção é registrado no primeiro sinal de que a urina é detectada. Para fazer medições do vazio, primeiro use a barra de rolagem para avançar ou retroceder no tempo, procurando o ponto em que ocorreu a difusão máxima do ponto de urina. Pause o filme neste ponto e coloque a seta do mouse do computador no local sob análise para marcar o ponto de interesse na captura de tela.

Nomeie o arquivo de captura de tela usando números correlativos para explicar a ordem de aparição no filme. Depois que todos os pontos vazios tiverem sido analisados, meça a área total do papel de filtro capturando uma captura de tela e delineando a borda do papel de filtro. Calcule a área percentual de cada uma das manchas de urina.

Transforme os valores da área percentual em volume de urina para cada ponto miccional usando as curvas de calibração e a função de interpolação no software gráfico. O comportamento miccional de fêmeas e machos de camundongos Piezo1, 2, knockout e controle foi registrado durante a fase escura e clara do dia. Durante a fase de luz inativa, não foram observadas diferenças significativas em nenhum parâmetro analisado para camundongos knockout fêmeas ou machos em comparação com o controle.

Entretanto, na fase escura ativa, camundongos knockout fêmeas e machos apresentaram fenótipo miccional alterado, caracterizado por aumento significativo no número e volume total de pequenas manchas vazias. Não houve diferenças significativas nas manchas primárias ou no número de PVS, volume médio por PVS ou volume total de PVS em camundongos knockout fêmeas ou machos em comparação com os camundongos controle. O comportamento miccional de camundongos fêmeas foi testado em condições basais e após tratamento com ciclofosfamida.

Em comparação com as condições basais, a quantidade de liberação de urina por micção é menor após o tratamento com ciclofosfamida e os eventos miccionais são muito mais frequentes. Um aspecto fundamental para a reprodutibilidade do ensaio é manipular os animais da forma mais suave possível e mantê-los sob o mínimo de estresse durante todo o período de teste. Como este é um ensaio não invasivo, procedimentos adicionais podem ser realizados posteriormente, incluindo citometria e eletromiografia para avaliar as funções da bexiga e do esfíncter externo da uretra, respectivamente.

A implementação desta técnica permitirá aos pesquisadores definir a contribuição de vias específicas para o comportamento miccional em estados de saúde e doença.