Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos

Esse protocolo replica um sistema de cateter intraventricular usado em ensaios clínicos em andamento para testar a liberação local regional de terapia com células T CAR direcionada contra tumores do sistema nervoso central. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de fornecer múltiplas doses repetidas de terapia local regional com células T CAR sem a realização de múltiplos procedimentos cirúrgicos invasivos. Esse sistema poderia ser usado para investigar diferentes terapêuticas em diferentes locais de entrega e, portanto, pode fornecer informações sobre uma miríade de áreas de pesquisa em neurociência.

Para começar, coloque o rato anestesiado com a cabeça raspada na mesa de operação e abra suavemente a parte inferior do braço estereotáxico usando uma espátula. Insira a cânula com pinça e prenda-a apertando o parafuso no braço até que metade a dois terços da porção plástica branca e cinco milímetros da cânula se projetem da parte inferior da abertura. Insira e prenda os dentes superiores do mouse na barra de mordida do aparelho estereotáxico.

Puxe o cone do nariz para a frente e aperte-o, garantindo que o rato inale isoflurano. Em seguida, monte o mouse sobre o aparelho estereotáxico aquecido usando manguitos auriculares ou barras auriculares, evitando pressão excessiva. Desinfetar o sítio cirúrgico e fazer um corte paralelo ao crânio conforme descrito no manuscrito.

Use cotonetes para afastar a fáscia. Identificar os pontos de referência, bregma e lambda no crânio correspondentes às marcas anteriores e posteriores onde as placas cranianas se encontram. Para criar uma superfície para fixar o acrílico, faça suavemente várias fendas em todo o crânio usando um bisturi.

Usando o braço estereotáxico, localize a cânula para o ponto de interesse. Levante a ponta da cânula de um a dois milímetros acima da superfície do crânio e mova-se para as coordenadas desejadas. Usando uma agulha de calibre 18 ou broca cirúrgica, faça dois furos de parafuso no crânio exposto longe de onde a cânula entra, garantindo espaço suficiente para a cânula.

Torça a broca através do orifício do parafuso até que ela se fixe ao crânio. Com uma chave de fenda de ponta plana, insira e prenda dois parafusos nos orifícios. Em seguida, puxe suavemente o parafuso para cima para garantir que ele esteja fixado.

Para inserir uma cânula, crie um orifício no crânio nas coordenadas identificadas usando uma agulha de calibre 18 ou broca cirúrgica. Usando o braço estereotáxico, abaixe a cânula para a coordenada DV desejada. Com aproximadamente 0,3 gramas de pó de resina acrílica e 10 a 15 gotas de líquido em uma placa de porcelana de 12 poços, carregue o material viscoso de cor branca preparado em uma seringa de um mililitro.

Revestir o crânio e preencher os espaços ao redor da cânula e parafuso. Solte o parafuso no braço estereotáxico enquanto o cimento estiver flexível. Use suavemente uma espátula para liberar a cânula do suporte na abertura inferior e retrair o braço estereotáxico para longe do mouse.

Depois de seco o cimento, insira a cânula simulada na cânula guia e gire no sentido horário para prendê-la firmemente. Quando o procedimento estiver concluído, devolva o rato à sua gaiola doméstica aquecida para recuperação. Para preparar a cânula de tratamento, insira sua parte superior na tubulação de PKG.

Em seguida, encha a seringa de tratamento com suspensão de células T CAR e insira-a pela outra extremidade do tubo de PKG, cobrindo a parte superior da cânula de tratamento. Após anestesiar o mouse, fixar a cânula guia na base com pinças. Desparafuse e retire a cânula simulada, permitindo o acesso à cânula guia.

Infundir as células T CAR por um minuto e manter a cânula de tratamento no lugar por mais um minuto. Depois de remover a cânula de tratamento, rosqueie uma cânula simulada com força. Em seguida, administrar meloxicam por via subcutânea para controle da dor.

A terapia com células T CAR direcionada por GPC2 induziu regressão tumoral significativa no meduloblastoma e sobrevida significativamente prolongada no modelo de glioma talâmico difuso na linha média. Ao inserir a cânula guia em um local intratumoral, é importante entender que as coordenadas dorso-ventrais podem ser mais superficiais do que a injeção do tumor, a fim de explicar os comprimentos de projeção da cânula de tratamento e dummy.