Name: Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprenda a implantar cânulas intracranianas em camundongos para infusões seriadas de células CAR T no tratamento de tumores do sistema nervoso central. Este método permite múltiplas doses sem cirurgias invasivas repetidas.

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O financiamento para este trabalho foi fornecido pela Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 e 1K08CA263179-01, e pelo Departamento de Defesa W81XWH-21-1-0221.

Todos os procedimentos do protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil da Filadélfia (IAC 19-000907), que é credenciado pela AAALAC. Este estudo utilizou camundongos NOD scid gama (NSG) com 6-12 semanas de idade com tumores de xenoenxerto ortotópicos; no entanto, o protocolo pode ser utilizado em qualquer cepa de camundongo. Camundongos NSG foram alojados em condições de barreira estéril e a cirurgia foi realizada em cabines de biossegurança estéreis. Quando material humano, como células tumorais ou células T, está sendo usado, os procedimentos e o manuseio devem ser concluídos em gabinetes de biossegurança ABSL-2.
1. Preparando o mouse para a cirurgia
<ol><li>Anestesiar o camundongo em uma câmara de indução com isoflurano (2-4%) a uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min até atingir um plano adequado de anestesia (aproximadamente 5 min).</li>
	<li>Pesar o rato utilizando uma balança com uma aproximação de 0,1 g e administrar buprenorfina (1 mg/kg) por via subcutânea de libertação lenta (SR) ou outro analgésico. OBS: A buprenorfina SR proporciona analgesia por 72 horas.</li>
	<li>Faça a barba no topo da cabeça do rato usando cortadores elétricos ou agentes depilatórios.</li>
	<li>Use uma espátula para abrir suavemente a parte inferior do braço estereotáxico e insira a cânula guia usando pinças. Aperte o parafuso no braço para fixar a cânula de modo que aproximadamente 1/2 a 2/3 da porção plástica branca da cânula fique saliente do fundo da abertura, juntamente com todo o comprimento metálico de 5 mm da cânula.</li>
	<li>Insira e prenda os dentes superiores do mouse na barra de mordida do aparelho estereotáxico. Puxe o cone do nariz para frente e aperte-o, garantindo que o rato está a inalar isoflurano.</li>
	<li>Monte o mouse sobre o aparelho estereotáxico aquecido usando manguitos auriculares ou barras auriculares, evitando pressão excessiva. NOTA: A bandeja aquecida deve ter um termômetro retal inserido, e a bandeja de aquecimento deve se ajustar para manter uma temperatura corporal normal do mouse durante o procedimento.</li>
	<li>Aplique pomada oftálmica estéril em ambos os olhos usando um aplicador com ponta de algodão.</li>
	<li>Limpe o local cirúrgico com iodopovidona em uma almofada ou aplicador, seguido de uma compressa de álcool. Execute esta etapa três vezes no total.</li>
	<li>Antes de iniciar o procedimento, realizar uma pinça dos dedos dos pés com pinça para avaliar se há sedação adequada.</li>
</ol>2. Procedimento cirúrgico
OBS: Todos os aspectos do procedimento cirúrgico utilizam instrumental esterilizado e técnicas assépticas. Os camundongos continuam sob anestesia com isoflurano (2-4%) durante todo o procedimento, aproximadamente 10-20 min.
<ol><li>Pegue suavemente o couro cabeludo entre as orelhas com pinças. Com tesoura estéril, corte o couro cabeludo levantado paralelo ao crânio e remova um retalho oval de pele (0,75-1 cm de comprimento) para expor o crânio. NOTA: A tesoura é preferida em relação a um bisturi para proporcionar uma abertura limpa e oval e evitar danos desnecessários à pele e aos tecidos circundantes.</li>
	<li>Afaste a fáscia usando um bisturi ou cotonetes com ponta de algodão e uma pelota de algodão hemostático para ajudar a retardar o sangramento excessivo, conforme necessário. NOTA: Usar o lado de madeira de uma ponta de algodão estéril também pode afastar a fáscia e ajudar a evitar sangramento excessivo.</li>
	<li>Identificar os pontos de referência bregma e lambda, as respectivas marcas anteriores e posteriores no crânio onde as placas cranianas seencontram13. NOTA: A identificação pode ser aumentada limpando a parte superior do crânio exposto com peróxido de hidrogênio.</li>
	<li>Marque suavemente o crânio usando um bisturi para criar uma superfície para o acrílico fixar. A pontuação deve incluir várias linhas lineares de aproximadamente 0,5-1 cm de comprimento em ângulos de 90° entre si.</li>
	<li>Usando o braço estereotáxico, localize a cânula para o ponto de interesse (bregma ou lambda). Uma vez localizada, eleve a ponta da cânula de 1 a 2 mm acima da superfície do crânio e mova-se para as coordenadas desejadas. Para injeções intratumorais, este utiliza as mesmas coordenadas A/P e M/L que a colocação do tumor.</li>
	<li>No crânio exposto, longe da área onde a cânula entrará, faça dois orifícios de parafuso com uma agulha 18G ou uma broca cirúrgica. Certifique-se de que os orifícios estejam espaçados para incluir espaço suficiente para a cânula. Usando uma broca, torça através dos orifícios do parafuso até que eles peguem no crânio. Insira e prenda dois parafusos nos orifícios usando uma chave de fenda de ponta plana. Em seguida, puxe suavemente os parafusos para cima para garantir que eles estejam presos. NOTA: Não insira os parafusos até que eles estejam nivelados com o crânio, ou eles podem danificar o cérebro do rato por baixo. Deixe pelo menos um espaço de 1-2 mm entre o parafuso e o crânio.</li>
	<li>Usando uma agulha 18 G ou broca cirúrgica, perfure o crânio nas coordenadas identificadas para criar um orifício para a cânula a ser inserida.</li>
	<li>Usando o braço estereotáxico, abaixe a cânula até a coordenada D/V desejada. OBS: A coordenada D/V do implante da cânula precisa levar em conta o comprimento de projeção do manequim e das cânulas de tratamento, podendo ser mais superficial que a injeção ortotópica de células tumorais (Figura 1).</li>
	<li>Em uma placa de porcelana de 12 poços, preencha um poço com pó de resina acrílica (aproximadamente 0,3 g) e 10-15 gotas (aproximadamente 0,5-0,75 mL) de líquido de resina acrílica. Isso produz um material viscoso de cor branca. Retirar a mistura para uma seringa de 1 mL e usá-la para revestir e cobrir o crânio, preenchendo os espaços ao redor da cânula e parafusos. NOTA: O material viscoso endurece em cimento com o tempo, por isso esta etapa deve ser concluída imediatamente após a mistura.</li>
	<li>Enquanto o cimento ainda estiver maleável, solte o parafuso no braço estereotáxico e use uma espátula na abertura na parte inferior para liberar suavemente a cânula do suporte e retrair lentamente o braço estereotáxico para cima para longe do mouse.</li>
	<li>Quando o cimento estiver completamente seco, insira a cânula simulada na cânula guia e fixe-a firmemente girando no sentido horário.</li>
	<li>Uma vez concluído o procedimento, coloque o camundongo de volta em sua gaiola doméstica aquecida para monitorar cuidadosamente, garantindo a recuperação adequada e registrando quaisquer observações pós-procedimento, incluindo que o camundongo recuperou totalmente a consciência, antes de retornar à colônia. NOTA: Geralmente recomenda-se colocar apenas metade da gaiola em uma almofada de aquecimento para permitir que o animal se mova para o lado mais frio para evitar o superaquecimento.</li>
	<li>Administrar analgésicos adicionais conforme necessário se os ratos apresentarem comportamentos indicativos de dor no pós-operatório, como meloxicam 5 mg/kg administrado por via subcutânea uma vez ao dia por até 3 dias.</li>
</ol>3. Preparação das células T CAR
<ol><li>Medir a concentração de células T CAR pré-transfectadas usando um contador de células.</li>
	<li>Centrifugar células T pré-transfectadas a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente (TR).</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante usando uma pipeta de Pasteur estéril em um sistema de aspiração a vácuo e ressuspender o pellet em solução salina tamponada com fosfatae (PBS) até a concentração desejada. Os volumes de entrega típicos são de 2-5 μL. As doses celulares típicas são de 0,5-5 x 106 células.</li>
</ol>4. Infusões de células T CAR
<ol><li>Prepare a cânula de tratamento alimentando a parte superior através de um pequeno pedaço de tubo de PKG.</li>
	<li>Encha a seringa de tratamento com a suspensão de células T CAR e insira-a através da outra extremidade do tubo de PKG, o suficiente para cobrir a parte superior da cânula de tratamento.</li>
	<li>Anestesiar o camundongo com isoflurano (2-4%) a uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min.</li>
	<li>Estabilize a cânula guia usando pinça na base e, em seguida, desaparafuse cuidadosamente e remova a cânula simulada, permitindo o acesso à cânula guia. NOTA: Uma configuração estereotáxica não é necessária, mas pode ser usada para estabilizar a cabeça para tratamento.</li>
	<li>Infundir as células T CAR durante 1 min e manter a cânula de tratamento no lugar durante mais 1 minuto após a cessação da perfusão.</li>
	<li>Remova a cânula de tratamento e rosqueie a cânula manequim firmemente de volta no lugar.</li>
	<li>Administrar meloxicam subcutâneo (5 mg/kg) para controle opcional da dor.</li>
</ol>

<ol><li>Curtin, S. C., Minino, A. M., Anderson, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declines+in+cancer+death+rates+among+children+and+adolescents+in+the+United+States%2C+1999-2014%5BTitle%5D)+AND+%22NCHS+Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Declines in cancer death rates among children and adolescents in the United States, 1999-2014.</a> NCHS Data Brief. 257, 1-8 (2016).</li>
<li>Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cellular+therapies%3A+the+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Adoptive cellular therapies: the current landscape.</a> Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).</li>
<li>Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discovery. 3 (4), 388-398 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Wagner, J., Wickman, E., DeRenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumors%3A+Bright+future+or+dark+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality.</a> Molecular Therapy. 28 (11), 2320-2339 (2020).</li>
<li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+infusion+of+HER2-specific+CAR+T+cells+in+children+and+young+adults+with+recurrent+or+refractory+CNS+tumors%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Locoregional infusion of HER2-specific CAR T cells in children and young adults with recurrent or refractory CNS tumors: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 27 (9), 1544-1552 (2021).</li>
<li>Majzner, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD2-CAR+T+cell+therapy+for+H3K27M-mutated+diffuse+midline+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas.</a> Nature. 603 (7903), 934-941 (2022).</li>
<li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+B7-H3+CAR+T+cells+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%3A+preliminary+first-in-human+bioactivity+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Intraventricular B7-H3 CAR T cells for diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary first-in-human bioactivity and safety.</a> Cancer Discovery. 13 (1), 114-131 (2023).</li>
<li>Theruvath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregionally+administered+B7-H3-targeted+CAR+T+cells+for+treatment+of+atypical+teratoid%2Frhabdoid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 712-719 (2020).</li>
<li>Donovan, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+delivery+of+CAR+T+cells+to+the+cerebrospinal+fluid+for+treatment+of+metastatic+medulloblastoma+and+ependymoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Locoregional delivery of CAR T cells to the cerebrospinal fluid for treatment of metastatic medulloblastoma and ependymoma.</a> Nature Medicine. 26 (5), 720-731 (2020).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+glioblastoma+after+chimeric+antigen+receptor+T-Cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-Cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li>
<li>Bourne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+microdialysis%3A+30+years+as+a+tool+for+the+neuroscientist%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (1-2), 16-24 (2003).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatically+detecting+bregma+and+lambda+points+in+rodent+skull+anatomy+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automatically detecting bregma and lambda points in rodent skull anatomy images.</a> PLoS One. 15 (12), 0244378(2020).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+GPC2-directed+chimeric+antigen+receptors+using+mRNA+for+pediatric+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of GPC2-directed chimeric antigen receptors using mRNA for pediatric brain tumors.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (9), 004450(2022).</li>
<li>Akhavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+for+brain+tumors%3A+Lessons+learned+and+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">T cells for brain tumors: Lessons learned and road ahead.</a> Immunological Reviews. 290 (1), 60-84 (2019).</li>
</ol>

A JBF detém uma patente relacionada a imunoterapias dirigidas ao glipican 2 (GPC2). Todos os outros autores não têm nada a revelar.

A terapia com células T CAR revolucionou o tratamento de cânceres hematológicos e apresenta valor promissor no tratamento de tumores sólidos cerebrais6,7,8. Este protocolo foi desenhado para permitir a avaliação pré-clínica da liberação loco-regional de células T CAR para o tratamento de tumores pediátricos do SNC. O sistema de cânula replica um reservatório de Ommaya ou Rickham, um sistema de cateter intraventricular atualmente em uso em ensaios clínicos em andamento de terapia com células CAR T em tumores pediátricos do SNC6,7,8, ressaltando a relevância e o potencial translacional desses métodos. Este sistema permite a entrega repetida de células CAR T que ultrapassam a barreira hematoencefálica, novamente semelhante aos métodos que estão sendo empregados em ensaios clínicos em andamento. O parto loco-regional pode proporcionar máxima eficácia no SNC9 e também pode reduzir o risco de toxicidades sistêmicas associadas ao tráfico de circulação15. Enquanto a administração estereotáxica pode fornecer uma única dose no SNC, a vantagem desse sistema é a oportunidade de fornecer várias doses repetidas em um local especificado no SNC sem a necessidade de múltiplas cirurgias. As limitações deste procedimento incluem um local de entrega fixo sem a capacidade de mudar de local ou fazer ajustes uma vez que a cânula está no lugar, e o potencial de deslocamento da cânula.
Uma etapa crítica desse protocolo é o implante da cânula guia fixa em uma coordenada D/V que leva em consideração a projeção das cânulas de tratamento. A cânula de tratamento irá se projetar além da ponta da cânula guia e, portanto, deve-se tomar cuidado para garantir que a colocação resulte na entrega de células CAR T para a região de interesse. Os comprimentos de projeção da cânula de tratamento podem ser personalizados e, na experiência do autor, 0,5 mm é um comprimento de projeção útil. Esse comprimento garante que o terapêutico não permaneça na cânula guia no momento da dispensação, mas também não requer ajuste significativo das coordenadas D/V da cânula guia para a região de interesse. Um passo adicional importante neste protocolo é o tempo em que a cânula de tratamento é deixada no local após a infusão de células T CAR. A cânula de tratamento deve ser mantida no local por pelo menos 1 min após o término da infusão, para evitar vazamentos e a perda da liberação loco-regional da terapia com células CAR T.
A solução de problemas desse método é simples, com a maioria das complicações envolvendo dificuldade em remover a cânula simulada ou inserir a cânula de tratamento na cânula guia fixa, provavelmente devido ao sangue seco no interior da cânula guia. Isso pode ser facilmente resolvido passando suavemente a cânula simulada através da cânula guia até que haja menos resistência e os detritos tenham sido removidos. A resina acrílica pode ocasionalmente se deslocar do crânio, resultando na perda do sistema de cânula. Em nossa experiência, isso geralmente é limitado pela pontuação do crânio com um bisturi e a colocação de dois parafusos. Além disso, todos os itens da gaiola que possam acidentalmente aplicar força à cânula enquanto o mouse está se movendo são removidos, como cabanas de enriquecimento de mouse específicas com pequenas aberturas.
Em conclusão, descreve-se aqui um protocolo para a inserção de um sistema de cânula em modelos murinos de tumores do SNC para a entrega repetida de células CAR T. A colocação da cânula pode ser ajustada para vários locais de parto loco-regionais, testando a eficácia de diferentes locais de parto. Além disso, esse sistema pode ser usado para terapêuticas adicionais além das células CAR T para avaliar a eficácia ao ultrapassar a barreira hematoencefálica, e também pode ser útil para a avaliação da terapêutica em modelos murinos de distúrbios não oncológicos.

Apesar das melhorias na quimioterapia, radioterapia e cirurgia, os tumores do sistema nervoso central (SNC) são a neoplasia maligna mais letal empediatria1, ressaltando a necessidade importante de novas abordagens com resultados mais bem-sucedidos. Com avanços significativos no campo da imunoterapia, abordagens de terapia celular adotiva (TCA) têm mostrado resultados promissores em vários tipos de câncer, especialmente neoplasiashematológicas2. A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR), um tipo específico de ACT, aproveita a capacidade natural do sistema imunológico de reconhecer e matar células nocivas, redirecionando a especificidade das células T para gerar células T direcionadas ao tumor3. A terapia com células CAR T tem demonstrado sucesso substancial no tratamento de leucemias e linfomas4, tornando-se uma abordagem imunoterapêutica promissora e encorajando sua investigação em tumores sólidos. No entanto, até o momento, a terapia com células CAR T em tumores sólidos tem alcançado pouco sucesso clínico e enfrenta muitos desafios, como penetração tumoral ineficiente, antígenos alvo limitados e omicroambiente tumoral supressor5.
Ensaios clínicos recentes começaram a avaliar a terapia com células T CAR para tumores pediátricos do SNC, fornecendo provas de conceito e evidências precoces da atividade de células T em relatos preliminares 6,7,8. Enquanto a maioria dos dados pré-clínicos iniciais se concentrava na liberação intravenosa das células T CAR, evidências pré-clínicas recentes sugeriram a superioridade do parto loco-regional no SNC9,10, que também tem sido utilizado com sucesso em vários ensaios clínicos 6,7,8,11 . Estudos pré-clínicos até o momento que incorporaram a liberação locorregional de células CAR T no SNC se basearam em uma única dose intracraniana de células CAR T liberadas estereotaticamente9,10. Entretanto, ensaios clínicos em humanos têm exigido infusões repetidas de células CAR T no SNC 6,7,8,11, ressaltando a necessidade de avaliar múltiplas infusões repetidas no desenvolvimento pré-clínico. O objetivo deste procedimento é testar com sucesso infusões seriadas de células T CAR usando um cateter em modelos murinos ortotópicos de tumores cerebrais pediátricos. A vantagem dessa técnica é evitar múltiplos procedimentos cirúrgicos para proporcionar tratamentos intra-SNC repetidos. As cânulas têm sido usadas principalmente para amostragem de microdiálise de neurotransmissores e liberação de substâncias neuroativas em neurociência e pesquisa comportamental em roedores12, com relatos limitados de seu uso para a administração de terapêuticas anticâncer. Com base nos relatos anteriores, este protocolo usa um sistema de cânula de habitação estereotaticamente colocado para entregar células CAR T em modelos murinos de xenoenxerto de tumores do SNC. O protocolo pode ser utilizado para testar terapêuticas adicionais em modelos murinos de distúrbios neurológicos ou neuro-oncológicos, e pode ser útil para testar novas terapêuticas em que ultrapassar a barreira hematoencefálica é crítico para a eficácia.

<table><tbody><tr><td>Agulhas BD de 18 G</td><td></td><td>511097 cubo</td><td>de metal de 1 1/2 polegada</td></tr><tr><td>Resina acrílica líquida</td><td>Lang Dental&nbsp;</td><td>B1323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pó de resina acrílica</td><td>Lang Dental&nbsp;</td><td>B1323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes com álcool</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5240</td><td>Eppendorf</td><td>5420000040</td><td>Centrifuge&nbsp;</td></tr><tr><td>Cotonetes com ponta de algodão</td><td>Puritan</td><td>826-WC</td><td>Largura do cabo = 2,11 mm (0,083), Largura da cabeça = 1,27 mm (0,050), Comprimento do cabo = 147,62 mm (5,812), Comprimento total = 152,4 mm (6), Comprimento da cabeça = 12,7 mm (0,500)</td></tr><tr><td>Suporte de broca&nbsp;</td><td>P1 Technologies&nbsp;</td><td>DH-1&nbsp;</td><td>Suporte de broca para D56-D70&nbsp;</td></tr><tr><td>Broca&nbsp;</td><td>P1 Technologies&nbsp;</td><td>D58&nbsp;</td><td>1,07 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Cânula fictícia&nbsp;</td><td>P1 Technologies&nbsp;</td><td>C315DCS-5/SPC&nbsp;</td><td>Configuração: Pequena capitalização; &nbsp; Comprimento: Corte 5,00 mm abaixo do pedestal; Projeção: 0,50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Chave de fenda de ponta chata&nbsp;</td><td>P1 Technologies&nbsp;</td><td>SD-80&nbsp;</td><td>Chave de fenda&nbsp;</td></tr><tr><td>Fórceps Graefe</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11051-10</td><td>Guia de Fórceps</td></tr><tr><td>Cânula&nbsp;</td><td>P1 Technologies&nbsp;</td><td>C315GS-5/SPC&nbsp;</td><td>Configuração: altura do pedestal de 5,00 mm; Comprimento: Corte 5,00 mm abaixo do pedestal&nbsp;</td></tr><tr><td>Pellets de algodão hemostáticos com epinefrina racêmica</td><td>Pascal&nbsp;</td><td>1151602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de contador de células automatizado MOXI Z Mini&nbsp;</td><td>Contador de células</td> <td>Moxi</td><td>MXZ001</td></tr><tr><td>NOD&nbsp; scid&nbsp; camundongos gama (NSG)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>machos e fêmeas de 6 a 12 semanas de idade</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação PKG&nbsp;</td><td>P1 Technologies&nbsp;</td><td>C313CT&nbsp;</td><td>Diâmetro: 0,58 mm x 1,27 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Prato de porcelana de 12 poços</td><td>Flinn Scientific</td><td>AP6064&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi de iodopovidona</td><td></td><td>Medline MDS093943</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento</td><td>de Precisão Mundial</td><td>50-822-457</td><td>Bisturi Descartável, no.10, estéril, 10/caixa, Cabo de Plástico com Parafusos de Régua de 6</td></tr><tr><td>"&nbsp;</td><td>P1 Technologies&nbsp;</td><td>0-80 X 3/32&nbsp;</td><td>2,4 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Quadro Estereotáxico&nbsp;</td><td>David Kopf Instruments&nbsp;</td><td>940&nbsp;</td><td>Instrumento Estereotáxico Modelo 940 para Pequenos Animais com Console de Display Digital&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura fina para estudantes</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cânula de tratamento&nbsp;</td><td>P1 Technologies&nbsp;</td><td>C315IS-5/SPC&nbsp;</td><td>33GA; &nbsp; Configuração: Padrão interno; Comprimento: Corte 5,00 mm abaixo do pedestal; Projeção: 0,50 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Seringas de tratamento&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87908</td><td>5 & micro; L, Seringa Especial de Agulha Cimentada Modelo 75 (SN), 75SN/22/0.5"/PT3&nbsp;</td></tr><tr><td>Vactrap XL&nbsp;</td><td>Sistema de Vácuo</td> <td>Foxx Life Sciences</td><td>305-4401-FLS</td></tr></tbody></table>

implante de cânula intracraniana para infusões seriadas de células t com receptor de antígeno quimérico quimérico (car) em camundongos

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Os tumores pediátricos do SNC são responsáveis pela maioria das mortes relacionadas ao câncer em crianças e têm prognóstico ruim, apesar dos avanços na quimioterapia e radioterapia. Como muitos tumores carecem de tratamentos eficazes, há uma necessidade crucial de desenvolver opções terapêuticas mais promissoras, como imunoterapias; o uso de terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) direcionada contra tumores do SNC é de particular interesse. Alvos de superfície celular como B7-H3, IL13RA2 e o disialogangliosídeo GD2 são altamente expressos na superfície de vários tumores pediátricos e adultos do SNC, aumentando a oportunidade de usar a terapia com células T CAR contra esses e outros alvos de superfície. Para avaliar a liberação locorregional repetida de células CAR T em modelos murinos pré-clínicos, foi estabelecido um sistema de cateteres de demora que recapitula cateteres de demora atualmente em uso em ensaios clínicos em humanos. Ao contrário da entrega estereotáxica, o sistema de cateter de demora permite a dosagem repetida sem o uso de múltiplas cirurgias. Este protocolo descreve a colocação intratumoral de uma cânula guia fixa que tem sido usada para testar com sucesso infusões seriadas de células T CAR em modelos murinos ortotópicos de tumores cerebrais pediátricos. Após injeção ortotópica e enxerto das células tumorais em camundongos, a colocação intratumoral de uma cânula guia fixa é completada em um aparelho estereotáxico e fixada com parafusos e resina acrílica. As cânulas de tratamento são então inseridas através da cânula guia fixa para entrega repetida de células T CAR. A colocação estereotáxica da cânula guia pode ser ajustada para entregar células CAR T diretamente no ventrículo lateral ou em outros locais do cérebro. Esta plataforma oferece um mecanismo confiável para o teste pré-clínico de infusões intracranianas repetidas de células T CAR e outras novas terapêuticas para esses tumores pediátricos devastadores.

Implante bem-sucedido de cânula no SNC de camundongos Camundongos com canulação bem-sucedida possuem uma cânula guia segura, que não interfere nas atividades de vida diária (Figura 2A) e que pode facilmente passar por uma cânula de tratamento e fornecer líquido sem resistência (Figura 2B). Em nossa experiência, a maioria das cânulas permanece no local por mais de 4 semanas, embora 0-25% possa ser deslocada ao longo do tempo. A verificação do posicionamento correto pode ser confirmada com o corante azul de Evans injetado na cânula. Por exemplo, uma cânula inserida no ventrículo lateral mostra o corante azul de Evans por todo o sistema ventricular enquanto percorre o líquido cefalorraquidiano, confirmando o correto posicionamento (Figura 2C). Cânulas inseridas no tumor mostram corante azul de Evans no local da implantação do tumor.
Entrega efetiva de células CAR T no SNC para o tratamento de tumores de xenoenxerto. A eficácia do sistema de cânula intracraniana e a eficácia terapêutica das células CAR T em modelos murinos podem ser medidas através de uma variedade de mecanismos, incluindo imagens bioluminescentes e sobrevida global. Células T CAR direcionadas à GPC2 foram testadas contra meduloblastoma murino e glioma difuso da linha média, modelos 7316-4509 e 7316-3058, respectivamente, usando dosagem repetida de células CAR T através do sistema de cânula intracraniana indicado14. A colocação e enxertia do tumor ortotópico foram confirmadas por imagem bioluminescente, e as cânulas foram colocadas no leito tumoral usando as mesmas coordenadas que o posicionamento do tumor ortotópico. Os tratamentos consistiram de infusões de células T GPC2 CAR uma a duas vezes por semana durante 2-4 semanas, totalizando quatro a seis doses. Após o tratamento, a terapia com células T CAR direcionada por GPC2 induziu regressão tumoral significativa no modelo de meduloblastoma 7316-4509 (p &lt; 0,01) (Figura 3A) e sobrevida significativamente prolongada no glioma talâmico difuso da linha média 7316-3058 (p &lt; 0,05) (Figura 3B)14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig01.jpg"> Figura 1: Cânula guia com manequim de projeção e cânulas de tratamento. (A) Cânula guia com cânula de projeção de 0,5 mm e manequim de projeção de 2 mm no lugar. (B) Cânula guia com cânula de projeção de 0,5 mm e cânula de tratamento de projeção de 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig02.jpg"> Figura 2: Sistema de liberação da cânula de tratamento para doses repetidas de células CAR T . (A) Cânula implantada em crânio de camundongo com tampa no lugar quando não estiver em uso. (B) Infusão de células CAR T em um tumor pontino através da cânula de tratamento enquanto o camundongo está sob anestesia. (C) Verificação da colocação da cânula no ventrículo lateral com corante azul de Evans. O corante foi inserido através da cânula, seguido de eutanásia e excisão cerebral, com corante presente em todos os ventrículos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig03.jpg"> Figura 3: As células T CAR direcionadas por GPC2 medeiam respostas antitumorais e prolongam a sobrevida em tumores cerebrais pediátricos in vivo. (A) Quantificação da bioluminescência do xenoenxerto de meduloblastoma ortotópico do grupo 4 7316-4509 tratado com células T de RNAm direcionadas para GPC2 ou CD19. As doses são indicadas pelas setas no gráfico. Dados apresentados como média com DP, n = 9-11 camundongos por braço. (B) Sobrevida global de camundongos implantados com xenoenxerto talâmico DMG 7316-3058 tratados com seis doses repetidas de 2 x 106 células T CAR. As doses são indicadas pelas setas no gráfico. n = 7 camundongos por braço. **p &lt; 0,01; *p &lt; 0,05; ns = não significante. Esse valor foi reproduzido com permissão de Foster et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Os tumores do sistema nervoso central (SNC) são a principal causa de morte relacionada ao câncer em crianças, e as terapias loco-regionais baseadas em imunidade estão sendo cada vez mais testadas para pacientes em ensaios clínicos. Este protocolo descreve métodos de implante de cânula locorregional em camundongos para avaliação pré-clínica de infusões imunoterápicas direcionadas a tumores do SNC.

Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...

Esse protocolo replica um sistema de cateter intraventricular usado em ensaios clínicos em andamento para testar a liberação local regional de terapia com células T CAR direcionada contra tumores do sistema nervoso central. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de fornecer múltiplas doses repetidas de terapia local regional com células T CAR sem a realização de múltiplos procedimentos cirúrgicos invasivos. Esse sistema poderia ser usado para investigar diferentes terapêuticas em diferentes locais de entrega e, portanto, pode fornecer informações sobre uma miríade de áreas de pesquisa em neurociência.Para começar, coloque o rato anestesiado com a cabeça raspada na mesa de operação e abra suavemente a parte inferior do braço estereotáxico usando uma espátula. Insira a cânula com pinça e prenda-a apertando o parafuso no braço até que metade a dois terços da porção plástica branca e cinco milímetros da cânula se projetem da parte inferior da abertura. Insira e prenda os dentes superiores do mouse na barra de mordida do aparelho estereotáxico.Puxe o cone do nariz para a frente e aperte-o, garantindo que o rato inale isoflurano. Em seguida, monte o mouse sobre o aparelho estereotáxico aquecido usando manguitos auriculares ou barras auriculares, evitando pressão excessiva. Desinfetar o sítio cirúrgico e fazer um corte paralelo ao crânio conforme descrito no manuscrito.Use cotonetes para afastar a fáscia. Identificar os pontos de referência, bregma e lambda no crânio correspondentes às marcas anteriores e posteriores onde as placas cranianas se encontram. Para criar uma superfície para fixar o acrílico, faça suavemente várias fendas em todo o crânio usando um bisturi.Usando o braço estereotáxico, localize a cânula para o ponto de interesse. Levante a ponta da cânula de um a dois milímetros acima da superfície do crânio e mova-se para as coordenadas desejadas. Usando uma agulha de calibre 18 ou broca cirúrgica, faça dois furos de parafuso no crânio exposto longe de onde a cânula entra, garantindo espaço suficiente para a cânula.Torça a broca através do orifício do parafuso até que ela se fixe ao crânio. Com uma chave de fenda de ponta plana, insira e prenda dois parafusos nos orifícios. Em seguida, puxe suavemente o parafuso para cima para garantir que ele esteja fixado.Para inserir uma cânula, crie um orifício no crânio nas coordenadas identificadas usando uma agulha de calibre 18 ou broca cirúrgica. Usando o braço estereotáxico, abaixe a cânula para a coordenada DV desejada. Com aproximadamente 0,3 gramas de pó de resina acrílica e 10 a 15 gotas de líquido em uma placa de porcelana de 12 poços, carregue o material viscoso de cor branca preparado em uma seringa de um mililitro.Revestir o crânio e preencher os espaços ao redor da cânula e parafuso. Solte o parafuso no braço estereotáxico enquanto o cimento estiver flexível. Use suavemente uma espátula para liberar a cânula do suporte na abertura inferior e retrair o braço estereotáxico para longe do mouse.Depois de seco o cimento, insira a cânula simulada na cânula guia e gire no sentido horário para prendê-la firmemente. Quando o procedimento estiver concluído, devolva o rato à sua gaiola doméstica aquecida para recuperação. Para preparar a cânula de tratamento, insira sua parte superior na tubulação de PKG.Em seguida, encha a seringa de tratamento com suspensão de células T CAR e insira-a pela outra extremidade do tubo de PKG, cobrindo a parte superior da cânula de tratamento. Após anestesiar o mouse, fixar a cânula guia na base com pinças. Desparafuse e retire a cânula simulada, permitindo o acesso à cânula guia.Infundir as células T CAR por um minuto e manter a cânula de tratamento no lugar por mais um minuto. Depois de remover a cânula de tratamento, rosqueie uma cânula simulada com força. Em seguida, administrar meloxicam por via subcutânea para controle da dor.A terapia com células T CAR direcionada por GPC2 induziu regressão tumoral significativa no meduloblastoma e sobrevida significativamente prolongada no modelo de glioma talâmico difuso na linha média. Ao inserir a cânula guia em um local intratumoral, é importante entender que as coordenadas dorso-ventrais podem ser mais superficiais do que a injeção do tumor, a fim de explicar os comprimentos de projeção da cânula de tratamento e dummy.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo descreve o isolamento e dissociação do mouse tecido meduloblastoma, e subsequente allografting das células tumorais em camundongos imunocomprometidos destinatário a fim de iniciar meduloblastoma secundário.

Allografting ortotópico intracraniana de Células Meduloblastoma em camundongos imunocomprometidos

Este vídeo apresenta um procedimento para implante de cânula intracraniana em um modelo de camundongo com tumor cerebral, para facilitar a administração de um agente imunoterapêutico. A entrega de células T receptoras de antígeno quimérico específicas do glipicano-2 no microambiente tumoral desencadeia a ativação das células T, resultando em lise tumoral e regressão tumoral.

Implante de cânula intracraniana em camundongo para administrar agentes terapêuticos a tumores cerebrais

Fonte: Lim, M., et al. Modelagem de metástases cerebrais por injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2022)Neste vídeo, um camundongo anestesiado é submetido a um procedimento cirúrgico no qual células cancerígenas são injetadas na artéria carótida comum (CCA) para facilitar a entrega direcionada ao cérebro. O procedimento envolve sutura e manipulação precisas das artérias carótidas para direcionar as células injetadas para a artéria carótida interna (ACI),...

Modelagem de metástase de tumor cerebral por meio de injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

Os efeitos linfodepletivos e imunomoduladores do padrão de tratamento da quimioterapia e radiação podem ser aproveitados para aumentar a eficácia antitumoral da imunoterapia com células T. Descrevemos um método para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas do EGFRvIII e administrá-las no contexto do tratamento padrão de glioblastoma.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

Metástases cerebrais tornou-se uma necessidade médica não atendida urgente como a sua incidência tem aumentado enquanto as opções terapêuticas têm permanecido paliativos. Criando modelos animais experimentais de metástase cerebral através de injecção arterial intracarotídeo de células cancerosas facilita estudos sobre os mecanismos da biologia da doença e avaliação de novos regimes de intervenção.

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

O reparo da artéria intracarótida em um modelo de camundongo após a injeção retorna o fluxo sanguíneo para a artéria sem afetar negativamente a distribuição do material injetado. O reparo no local da injeção facilita as injeções subsequentes através da mesma artéria e previne a isquemia cerebral em cepas de camundongos que não possuem um Círculo de Willis completo.

Facilitando injeções intracarotídeas repetidas em modelos de camundongos por uma nova técnica de reparo no local da injeção

O objetivo desse protocolo é fornecer aos pesquisadores uma técnica altamente reprodutível para implantações intracranianas.

Implantação intracraniana estereotáxica de linhagens celulares de xenoenxerto derivadas de Glioblastoma em Pacientes

Aprenda a implantar cânulas intracranianas em camundongos para infusões seriadas de células CAR T no tratamento de tumores do sistema nervoso central. Este método permite múltiplas doses sem cirurgias invasivas repetidas.

Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos (Vídeo) | JoVE Journal

Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos

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