Name: Avaliação in vitro e in vivo de compostos biologicamente ativos fotocontrolados - potenciais candidatos a fármacos para a fotofarmacologia do câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Aprenda a avaliar peptídeos anticâncer fotocontroláveis em culturas 2D e 3D, medindo citotoxicidade e eficiência de fotoisomerização. Este método auxilia pesquisadores no desenvolvimento de fármacos mais seguros para fotofarmacologia.

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Os autores agradecem o financiamento da UE pelo programa H2020-MSCA-RISE através dos projetos PELICO (#690973) e ALISE (#101007256). Este trabalho foi apoiado pelo DFG-GRK 2039 (SA, TS e ASU), pelo programa NACIP da Sociedade Helmholtz (SA e ASU) e pelo VIP+ do BMBF (OB e ASU). Agradecemos ao Dr. Serhii Koniev, Instituto de Tecnologia de Karlsruhe, que sintetizou o composto LMB002, purificou-o e gentilmente forneceu o composto para o estudo. Os autores também agradecem a Chupryna Maksym, que filmou e compilou o vídeo na Ucrânia, e a todos os corajosos defensores da Ucrânia que tornaram possível o trabalho experimental, a escrita e a filmagem desta publicação.

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IVK, OB, SA e ASU são inventores da família de patentes emitidas: "Peptidomiméticos que possuem atividade biológica fotocontrolada" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) licenciados para Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS e SA são fundadores e acionistas da Lumobiotics GmbH. IVK é um consultor científico, HK, TM, IP e PB são funcionários da Enamine LLC. Os autores não têm outras afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos na publicação além daqueles divulgados.

Compostos fotocontrolados são inéditos no desenvolvimento de fármacos; entretanto, nenhum método foi estabelecido para sua avaliação pré-clínica e clínica. O análogo mais próximo da monoterapia, a terapia fotodinâmica (TFD), é a modalidade de tratamento para uso clínico adotada por muitos países contra o câncer e está em desenvolvimento para outras indicações19,20. Assim como a fotofarmacologia, a TFD também se baseia no uso da luz para ativar a substância bioativa (oxigênio singlete). Portanto, alguns métodos experimentais utilizados para estudos pré-clínicos e clínicos na TFD podem ser adotados para a fotofarmacologia. Por exemplo, fontes de luz, abordagens de fornecimento de luz e dispositivos médicos são bem desenvolvidos e aprovados para TFD; Eles podem ser usados diretamente para a avaliação de drogas fotocontroladas. Entretanto, a TFD e a fotofarmacologia têm muitas distinções entre si4, o que justifica a necessidade de estabelecer métodos específicos para esta última.
Primeiro, a substância não ativada na TFD (oxigênio) está sempre presente nos tecidos vivos em concentrações não tóxicas. Por outro lado, compostos biologicamente ativos fotocontrolados não ativados podem ter atividade residual e toxicidade indesejada. Portanto, os fármacos fotofarmacológicos ideais devem ter atividade biológica minimizada em sua forma administrada e devem ser altamente ativos em sua forma gerada pela luz, a "janela fototerapêutica"21 deve ser a maior possível. Encontrar o acerto e realizar a otimização hit-to-lead requer a identificação de compostos adequados e a triagem de bibliotecas relativamente grandes, já em estágios iniciais de desenvolvimento de medicamentos. Aqui, nós propusemos uma microscopia fluorescente confocal automatizada de alto rendimento para identificar compostos de fotocomutação eficientes.
O método escolhido de avaliação da citotoxicidade permite fácil implementação do requisito mais crítico - manutenção do PSS ou estabilidade do fotoisômero visível-sensível à luz. Isso porque, ao ser implementada, a exposição à luz é minimizada. Assim, ao selecionar métodos alternativos, os automatizados devem ser preferidos. Essa abordagem é confiável e informativa. O uso de culturas de células 3D (esferoides) nesta fase fornece uma compreensão holística da resposta da célula ao tratamento em um microambiente tecidual mais realista. Além disso, informações valiosas sobre o mecanismo de ação dos compostos podem ser obtidas usando a microscopia como método direto. A microscopia confocal fluorescente com protocolo de coloração adequado permite a avaliação visual da morfologia das células e esferoides; Detalhes importantes sobre a morte celular e alterações no interior das células também podem ser detectados.
Em segundo lugar, a aplicação de luz requer uma escolha cuidadosa da dosagem de luz. Na TFD, a superdosagem de luz é extremamente prejudicial aos tecidos22. A terapia fotofarmacológica pode ser vantajosa sob irradiação excessiva de luz. O limite superior da substância ativada é definido pela dose administrada da substância não ativada e sua farmacocinética. No entanto, a dosagem de luz ainda é um problema na fotofarmacologia. Deve-se tomar cuidado para garantir que a densidade de potência irradiante e o tempo de exposição não sejam inferiores ao necessário para a terapia. Em princípio, a geração da substância ativada pode ser monitorada in vivo. No entanto, por razões bioéticas, propusemos um experimento com um tecido modelo (carne picada fresca) misturado com o composto não ativado15. Este experimento é simples e pode ser modificado para usar diferentes fontes de luz. Também pode ser adaptado para a estimativa fotofísica da dosagem de luz e a medição de influências térmicas. Aqui, novamente, usando tecidos modelo, a exposição à luz é possível minimizar, comparada, por exemplo, com a determinação mais precisa da eficiência de fotocomutação nas condições in vivo , uma alternativa que pode sempre ser interessante de considerar.
Finalmente, os compostos que demonstram características superiores nas telas de toxicidade in vitro e são eficientemente fototrocados a pelo menos 1-1,5 cm de profundidade no tecido modelo podem ser selecionados para estudos in vivo caros, trabalhosos e demorados. Neste protocolo, utilizamos a mesma linhagem celular (LLC) da avaliação in vitro para gerar o modelo de câncer aloenxerto. A dinâmica de crescimento tumoral, a mortalidade e a contagem de metástases são os parâmetros mais adequados para avaliar a eficácia antineoplásica. Em comparação com a quimioterapia convencional, um fator adicional é aplicado no tratamento fotofarmacológico - a luz. Para tanto, são necessários dois grupos de animais controle: um que recebe apenas o veículo e outro que recebe o veículo e a irradiação. Esta configuração permite a avaliação do impacto da luz sobre os parâmetros medidos. Em nosso experimento, os animais dos dois grupos experimentais receberam o composto não ativado, e os tumores dos camundongos de um grupo foram irradiados. O regime de irradiação foi idêntico para os grupos controle e tratamento. A comparação com a quimioterapia de referência não é necessária nesta fase, pois o principal objetivo do experimento é demonstrar o efeito combinado da aplicação de luz e composto. Os compostos de melhor desempenho que exibem esse efeito podem então ser selecionados para um estudo mais aprofundado sobre sua toxicidade in vivo e comparação com benchmarks para a tomada de decisões importantes sobre seu desenvolvimento. Tecnicamente, o experimento in vivo que descrevemos pode ser facilmente adaptado a estudos farmacocinéticos ou farmacodinâmicos, por exemplo, de um composto que já está selecionado como líder do medicamento.

Compostos biologicamente ativos fotocontrolados têm emergido nas últimas décadas como um componente promissor de quimioterapias seguras para doenças humanas e especificamente para erradicar tumores sólidosmalignos1. Estes compostos contêm fragmentos reversivelmente fotoisorizáveis (fotointerruptores moleculares) e podem alternar entre fotoisômeros inativos e ativos após irradiação com luz de diferentes comprimentos de onda.
Em comparação com seus análogos não fotocontroláveis, os medicamentos fotocontrolados podem ser mais seguros porque podem ser introduzidos sistemicamente no corpo do paciente em formas menos ativas e essencialmente não tóxicas, e são ativados pela luz apenas quando necessário, como em tumores, úlceras e feridas. Embora múltiplas demonstrações empolgantes desses protótipos de fármacos moleculares possam ser encontradas em trabalhos acadêmicos recentes2,3,4,5,6,7, o campo da fotofarmacologia clínica - uma aplicação de combinações aprovadas, fármaco/dispositivo médico/doença - não existe. A fotofarmacologia ainda está em fase de descoberta de fármacos, e estudos pré-clínicos sistemáticos são desconhecidos.
Apenas muito recentemente demonstramos a vantagem de segurança in vivo para alguns peptídeos anticâncer fotocontrolados, a saber, os análogos do antibiótico peptídeo gramicidina S8. Esses derivados fotocontrolados contêm um fotointerruptor de diarileteno (DAE), que sofre transformações fotoinduzidas reversíveis entre as chamadas fotoformas "anel-aberto" gerado pela luz vermelha e "anel-fechado" gerado pelos raios UV (ilustrado na Figura 1 para um dos derivados, o composto LMB002).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig01.jpg"> Figura 1: Peptídeo citotóxico fotocontrolado LMB002 e sua fotoisomerização. O fragmento de diarileteno é mostrado em vermelho. Abreviação: DAE = diarylethene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A busca de acertos e a otimização hit-to-lead geralmente requerem a triagem in vitro e in vivo de bibliotecas de compostos apropriadas 9,10. Aqui, demonstramos uma metodologia adequada para a triagem sistemática de alta produtividade da citotoxicidade de compostos fotocontrolados. Também determinamos a eficiência da fotoisomerização, estimamos a dose de luz nos tecidos modelo e avaliamos a eficácia in vivo dos candidatos com melhor desempenho. A abordagem está de acordo com as considerações de bioética e cuidados com os animais.
Neste trabalho, métodos pré-clínicos tradicionais são modificados para evitar a fotoisomerização não controlada dos compostos testados. O objetivo geral da aplicação desses métodos modificados aqui é desenvolver uma estratégia geral que seja direta e rápida e produza dados estatisticamente significativos para comparar de forma confiável as atividades in vitro e racionalizar os testes de eficácia in vivo de compostos fotocomutáveis para identificação e desenvolvimento de chumbo.
A estratégia consiste em três etapas consecutivas. A primeira etapa envolve a determinação de CI 50 (viabilidade celular aparente de50 %) em diluições seriadas para fotoformas ativas e inativas de compostos biologicamente ativos fotocontrolados selecionados usando culturas de células bidimensionais (2D, monocamada) e tridimensionais (3D, esferoide) e microscopia de fluorescência automatizada confocal de alto rendimento. Janelas fototerapêuticas são comparadas em relação à diferença de CI50 entre as duas fotoformas, e os candidatos com melhor desempenho são selecionados. Não há vantagem específica na avaliação da toxicidade por microscopia automatizada e outras plataformas de triagem de citotoxicidade (ensaios)11; Modelos tumorais celulares maiscomplexos12 poderiam ser facilmente implementados nessa fase.
Para os compostos selecionados na etapa 1, o segundo passo é estimar realisticamente sua eficiência de fotocomutação dentro dos tecidos em função da profundidade da superfície do tecido irradiado, quantificando a eficiência de fotocomutação das fotoformas menos ativas em um substituto de tecido usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) detectada por UV de extratos de amostras irradiadas. In vivo , a eficiência da fototroca poderia ser estudada, mas propomos usar um substituto de tecido simples - carne de porco picada. Testamos a validade dessa abordagem. Medimos a conversão de nossos compostos fotocomutáveis in vivo em um modelo de câncer de camundongos e observamos aproximadamente a mesma fotoconversão em uma profundidade medida em experimentos anteriores com camundongos8. Qualquer tecido artificial alternativo adequado13, tecido/órgão bioimpresso 3D14, materiais de biópsia ou outro material animal isento poderia ser usado. No entanto, essa configuração é um bom compromisso, pois é econômica, rápida e ética.
O terceiro passo é a determinação da eficácia anticâncer in vivo em um modelo de câncer murino. Os compostos que demonstram características superiores nos experimentos in vitro e fotocomutação eficiente a uma profundidade de pelo menos 1-1,5 cm nos tecidos modelo são selecionados para este experimento.
Este protocolo pode ser aplicado a compostos que possuam diferentes tipos de fotointerruptores, desde que suas fotoformas (ou seus estados fotoestacionários, PSS) sejam estáveis por um tempo razoável (alguns dias ou mais). Para ilustração, um LMB002 derivado do DAE descrito anteriormente é usado15. Os fotofórmios LMB002 são termicamente estáveis e podem ser armazenados a -20 °C por pelo menos um ano sem degradação substancial. As células do carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) são escolhidas para esta demonstração in vitro e in vivo, mas nenhuma restrição é imposta ao tipo celular. As células LLC são aderentes, prontamente cultiváveis em 3D e usadas para gerar tumoróides (como descrito na referência16). In vivo As células LLC são usadas para modelar processos metastáticos e podem facilmente gerar tumores sólidos em camundongos imunocompetentes após injeção subcutânea. Essa metodologia in vivo pode ser aplicada universalmente a outros modelos de câncer17,18. A implementação detalhada desta estratégia é descrita a seguir.

<table><tbody><tr><td>Sistema LC capilar Agilent série 1100</td><td>ALSI-Chrom (distribuidor Agilent)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Linha celular de carcinoma pulmonar de Lewis</td><td>ECACC</td><td>90020104</td><td></td></tr><tr><td>camundongos C57BL/6NCrl, fêmeas, endogâmicos</td><td>Charles River</td><td>Código da cepa: 027</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture, incubadora de CO2</td><td>Esco Micro</td><td>CCL-170B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matriz de membrana basal</td><td>Merck</td><td>CLS354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning, microplacas esferóides de 384 poços</td><td>Merck</td><td>CLS3830</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Merck</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600044</td><td></td></tr><tr><td>Gramicidina S</td><td>Lumobióticos</td><td></td><td>Síntese personalizada</td></tr><tr><td>HyClone, DMEM/glicose alta</td><td>Cytiva</td><td>SH30003.04</td><td></td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 6500HS, sistema de imagem</td><td>Cytiva</td><td>29240358</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia com isoflurano</td><td>ASA</td><td>S/N ASA 1305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, solução 200 mM</td><td>Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LIKA-cirurgião, laser</td> <td>para cirurgia de diodoFotonika</td><td></td> plus-LMB002 <td></td></tr><tr><td></td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>Síntese personalizada</td></tr><tr><td>Penicilina&ndash; Estreptomicina, solução estabilizada</td><td>Merck</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate, placas de 96 poços</td> Fotômetro <td>6055302</td><td></td><td>PerkinElmer</td></tr><tr><td>PCE-LED 20</td><td>PCE Instruments</td><td>PCE-LED 20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, iodeto de propídio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66764-MC</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano, solução a 0,4%</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina&ndash; EDTA, 10 x solução</td><td>Merck</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz Frascos de cultura de células com tampas ventiladas, 75 cm2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200263</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz, filtros de topo de garrafa, PES, 0,22 &mu; m</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360882</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP, coluna C18 HPLC (4,6 mm &vezes; 250 mm, 5 &micro; m)</td><td>Altmann Analytik (distribuidor da Avantor)</td><td>GR5103827</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação in vitro e in vivo de compostos biologicamente ativos fotocontrolados - potenciais candidatos a fármacos para a fotofarmacologia do câncer

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

Compostos biologicamente ativos fotocontrolados são uma classe emergente de candidatos a drogas "inteligentes". Eles fornecem segurança adicional na quimioterapia sistêmica devido à sua ativação espaço-temporal precisa, direcionando uma luz benigna não ionizável para um local específico dentro do corpo do paciente. Este trabalho apresenta um conjunto de métodos para avaliar a potência in vitro e a eficiência ex vivo da fotoativação de compostos biologicamente ativos fotocontrolados, bem como a eficácia in vivo nos estágios iniciais do desenvolvimento de fármacos. A metodologia é aplicada a peptídeos citotóxicos anticâncer, ou seja, os análogos contendo diarileteno de um antibiótico conhecido, a gramicidina S. Os experimentos são realizados usando culturas de células 2D (células aderentes) e 3D (esferoides) de uma linhagem de células cancerosas (Lewis lung carcinoma, LLC), substitutos de tecidos vivos (carne de porco picada) e um modelo de câncer aloenxerto (LLC subcutâneo) em camundongos imunocompetentes. A seleção dos compostos mais eficazes e a estimativa de janelas fototerapêuticas realísticas são realizadas através de microscopia de fluorescência automatizada. A eficiência de fotoativação em diferentes regimes de iluminação é determinada em diferentes profundidades em um tecido modelo, e a dose ótima de luz é aplicada no experimento terapêutico final in vivo .

Neste trabalho, experimentos com células 2D e 3D foram conduzidos para determinar o CI50 para as formas "ring-closed" e "ring-open" de LMB002 (ver Figura 1) em diferentes tempos de incubação. Esses valores foram comparados com os obtidos para o peptídeo protótipo, a gramicidina S (utilizada como controle positivo). Um conjunto típico de imagens da incubação em cultura LLC cultivada em 2D após a coloração é mostrado na Figura 5. A cocoloração com Hoechst 33342 (azul) e iodeto de propídio (vermelho), resultando em diferentes tons de roxo em uma fração maior de células no caso de tratamento com a forma "anel-aberta" em comparação com "anel-fechado", indica uma diferença notável na citotoxicidade entre duas formas que pode ser facilmente quantificada. O exemplo demonstrado de um experimento bem-sucedido é baseado nos dados coletados usando o formato de placa de 96 poços, onde as variantes peptídicas em concentrações variáveis foram adicionadas, como mostrado na Figura 2. Dados semelhantes podem ser obtidos com placas de 384 poços e de alta densidade. No entanto, como os volumes por poço são reduzidos, os erros técnicos e sistemáticos e, como resultado, a precisão da determinação do CI50 diminuirão com o aumento da densidade do poço.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig05.jpg"> Figura 5: Imagens representativas do ensaio de citotoxicidade na LLC cultivada em monocamada. As células foram coradas com Hoechst 33342 (azul) e iodeto de propídio (vermelho). Os tempos mostrados: 10 min, 60 min, 24 h e 72 h são tempos de incubação com compostos. Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A fotoconversão do LMB002 por irradiação com luz laser em um tecido modelo - picanha fresca de porco - foi determinada usando uma amostra composta de carne picada misturada com LMB002 forma "ring-fechada" (inativa) dissolvida em PBS e medindo a conversão desta forma inativa para a forma LMB002 "ring-open" (ativado) na direção da propagação da radiação. A amostra foi colocada em uma seringa e irradiada de um lado com um feixe plano de radiação laser pelo tempo de exposição de ~10 min (normalmente usado em experimentos in vivo ), como mostra a Figura 3. Após a exposição, o cilindro da amostra foi dividido em partes, pressionando-se o pistão da seringa e cortando-se com bisturi os cortes de mesma altura. A concentração de LMB002 "ring-open" nos extratos dos cortes foi determinada por CLAE.
A Figura 6 ilustra as curvas dose-efeito, Figura 6A-D, obtidas a partir da análise dos dados. Para identificar a porcentagem de células mortas com cocoloração nuclear dos corantes Hoechst 33342 e PI, usamos uma ferramenta classificadora integrada que define limiares numéricos em parâmetros medidos selecionados para dividir todas as contagens de células em várias categorias. Por exemplo, quando o sinal do canal vermelho (iodeto de propídio) no controle estava no limiar (aproximadamente 110-130 unidades), as células poderiam ser classificadas como PI-positivas, consideradas mortas, ou PI-negativas, consideradas não afetadas pelos compostos. Para LMB002, podem ser observadas dependências sigmoidais da porcentagem de células positivas para iodeto de propídio na concentração do composto. A partir desses dados, é possível determinar os valores de IC50.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig06.jpg"> Figura 6: Análise da citotoxicidade em cultura 2D. Ajustes de sigmoide foram obtidos na cultura LLC por (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h, e (D) 72 h-times tomados para incubação com compostos. O ajuste permite a determinação precisa dos valores de IC50 (não mostrados). Abreviações: LLC = Lewis lung carcinoma; IP = iodeto de propídio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Considerando os valores de CI50 obtidos, podemos concluir que a toxicidade dos três compostos aumentou com o tempo de incubação. Nosso experimento revelou que a forma "anel-aberta" de LMB002 é cerca de uma etapa de diluição menos tóxica do que o peptídeo protótipo, gramicidina S. Enquanto a forma "anel-fechado" demonstra três a quatro etapas de diluição menor toxicidade, que aumenta com o tempo de incubação. A diferença entre as duas etapas de diluição não é afetada pelo aumento do tempo de incubação e pode ser usada numericamente comouma janela fototerapêutica 6 determinada experimentalmente para comparação com outros compostos em uma triagem de biblioteca potencial. O valor de IC50 para gramicidina S foi estabelecido como ponto de referência para corrigir erros experimentais ou saídas diferenciais em réplicas biológicas.
Os experimentos com células 3D produziram o mesmo tipo de dados brutos - as imagens esferoides resolvidas uma por poço em uma única célula. A inclusão da calceína como terceiro corante permite a quantificação da fração de células metabolicamente ativas (observada no canal verde). Usando placas de 384 poços, aumentando o número de réplicas técnicas, excluindo pontos de tempo de co-incubação redundantes e alterando a dobra de diluição, pudemos comparar diretamente vários compostos em um único ensaio (usando placa única), como ilustrado no mapa de placas na Figura 7.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig07.jpg"> Figura 7: Mapa de placas para o experimento de cultura 3D com dois compostos. Códigos de cores para os compostos e controle são indicados. Os números nos poços são concentrações em μM. 10 min, 24 h e 72 h são tempos de incubação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A Figura 8 exibe as imagens de réplicas técnicas selecionadas de esferoides LLC crescidos a uma densidade de 1 esferoide/poço na presença de compostos testados e esferoides de controle capturados após a coloração.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig08.jpg"> Figura 8: Imagens representativas do ensaio de citotoxicidade em cultura 3D. As imagens mostram esferoides LLC de 48 h de idade corados com Hoechst 33342 (azul), calceína AM (verde) e iodeto de propídio (vermelho) após 10 min, 24 h e 72 h de co-incubação com fotoformas LMB002 e barras de escala gramicidina S = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Utilizando o software do instrumento, as curvas dose-efeito, como as do experimento 2D, foram obtidas a partir das pilhas de imagens empilhadas em z (Figura 9A). Além disso, esferoides compactos e não deformados nas culturas 3D puderam ser caracterizados pelo diâmetro esferoide inteiro (Figura 9B). Observou-se também que o diâmetro total do esferoide varia com a concentração do composto.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig09.jpg"> Figura 9: Avaliação da citotoxicidade com culturas 3D. (A) Curvas de ajuste de citotoxicidade concentração-dependente e (B) parcelas de diâmetro de esferoides dependentes da concentração obtidas nas culturas 3D de LLC co-incubadas com gramicidina S por 10 min, 24 h e 72 h e capturadas antes da coloração. As barras de erro são SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O experimento para a Etapa 2 permite a determinação das concentrações de LMB002 em ambas as fotoformas usando cromatografia líquida de alta eficiência detectada por UV. A eficiência da fotoconversão nos tecidos modelo foi facilmente avaliada e quantificada por meio deste setup (Figura 3). Os dados foram obtidos a partir da análise quantitativa dos cromatogramas dos extratos das amostras. Nestes experimentos, cromatogramas LMB002 foram detectados espectroscopicamente a 270 nm e 570 nm. A 270 nm, muitos sinais adicionais foram observados e atribuídos aos compostos co-extraídos do tecido modelo (verificados a partir do extrato controle sem o composto). Ambas as fotoformas foram suficientemente diferentes em tempos de retenção e absorbância. No entanto, o sinal LMB002 "ring-open" foi separado da linha de base desses sinais de fundo (veja um cromatograma representativo na Figura 10A). Portanto, este sinal pode ser integrado sem problemas. Em 570 nm, os cromatogramas continham apenas sinal de forma "fechado em anel" LMB002 (Figura 10B). Aqui, realizamos a determinação da concentração usando HPLC RP. No entanto, uma precisão ainda maior e limites de detecção mais baixos poderiam ser obtidos usando LC/MS como método analítico.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig10.jpg"> Figura 10: Cromatogramas representativos de LMB002 extraídos de tecidos modelo. A) Amostra a 2 mm da superfície irradiada, registada a 270 nm (LMB002 forma "ring-open" é integrada); (B) amostra a 38 mm da superfície irradiada, registrada a 570 nm (o pico do LMB002 "ring-closed" está integrado). Os valores de tempo de retenção (indicados) confirmaram adicionalmente a identidade do composto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os dados obtidos após a integração dos sinais correspondentes de todas as amostras coletadas foram utilizados para a construção dos gráficos concentração-profundidade, como mostra a Figura 11. Com base nesses gráficos, a eficiência da fotoconversão em diferentes profundidades do tecido modelo foi facilmente avaliada. Isso confirma que nossa fonte de luz vermelha induz a fotoconversão LMB002 "fechada em anel" a uma profundidade de até 1 c, na carne picada (aproximadamente 103 mW/cm2).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig11.jpg"> Figura 11: Avaliação da eficiência de fotoconversão. Concentração (A, mg/kg) das formas LMB002 "ring-closed" (non-activated, blue dots) e "ring-open" (activado, orange dots) a diferentes distâncias da superfície irradiada do tecido modelo (L, mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os resultados do experimento in vivo - Etapa 3 de nossa metodologia realizada de acordo com o cronograma apresentado na Figura 4 - foram representados por gráficos mostrando o crescimento tumoral em função do tempo (Figura 12) e curvas de sobrevida de Kaplan-Meier (Figura 13).
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig12.jpg"> Figura 12: Dinâmica do crescimento tumoral em animais. Animais tratados com LMB002 em comparação com os animais tratados com veículo (modelo de aloenxerto LLC subcutâneo em camundongos C57BL/6NCrl, dose composta 7 mg/kg, IV, incubação de 2 h 40 min, depois irradiação a 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig12large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig13.jpg"> Figura 13: Curvas de mortalidade dos animais. Animais tratados com LMB002 em comparação com os animais tratados com veículo (modelo de aloenxerto LLC subcutâneo em camundongos C57BL/6NCrl, dose composta 7 mg/kg, IV, incubação de 2 h 40 min, depois irradiação a 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig13large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo apresenta um conjunto de experimentos adotados para a avaliação de peptídeos anticâncer fotocomutáveis, que podem ser utilizados na triagem pré-clínica destes compostos. Isso inclui a avaliação da citotoxicidade em culturas de células 2D e 3D, a avaliação da eficiência de fotoisomerização ex vivo (tecido modelo) e a eficácia in vivo .

Avaliação in vitro e in vivo de compostos biologicamente ativos fotocontrolados - potenciais candidatos a fármacos para a fotofarmacologia do câncer

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

Compostos fotocontrolados, biologicamente ativos, contêm fragmentos reversivelmente fotoisorizáveis, fotointerruptores em suas moléculas. Os compostos são peptídeos cíclicos modificados por um fragmento de diarileteno que sofre transformações eletrocíclicas reversíveis induzidas pela luz. Eles podem mudar de foto, ou seja, alternar entre uma forma biologicamente inativa gerada por UV e uma forma biologicamente ativa gerada por luz vermelha.Acredita-se que as drogas fotocomutáveis são mais seguras do que as não fotocomutáveis. Isso ocorre porque você pode administrar uma forma não tóxica e desativada ao corpo humano e ativá-la localmente com luz apenas onde você precisa, que é, por exemplo, tumores, trados ou feridas. Não existem métodos ou protocolos padrão para o desenvolvimento pré-clínico ou clínico de tais drogas fotofarmacológicas, por isso, aqui, queremos mostrar-lhe experimentos que podem ser usados para esta pesquisa pré-clínica inicial.Kateryna Horbatok e Tetiana Makhnii demonstrarão os procedimentos. Os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Bioética da Bienta Company. Comece preparando os buffers usando procedimentos padrão.Alternativamente, use soluções disponíveis comercialmente. Preparar soluções estoque de compostos. Para cada composto, pesar dois lotes de 5,12 miligramas do composto no fotofórmio fechado em anel em dois tubos Eppendorf de 1,5 mililitro, um com paredes claras e outro com paredes pretas não transparentes.Como controle positivo, pesar 2,28 miligramas do peptídeo pai, não fotocontrolado, em um tubo extra. Adicione 100 microlitros de DMSO puro a cada amostra e o vórtice por 30 segundos. Fotoisomerizar a solução estoque no tubo de parede transparente irradiando a solução com um laser de 650 nanômetros, densidade de potência de luz de 6 watts por centímetro quadrado, com vórtice para garantir a mistura.Continue até que a cor mude de roxo escuro para marrom claro. Proteja da luz com papel alumínio. Semente 5, 000 a 10, 000 células por poço.Foram utilizadas cerca de 8.000 células de carcinoma pulmonar de Lewis em 200 microlitros de DMEM nos 60 poços centrais de uma placa estéril de 96 poços com fundo claro e paredes pretas e não transparentes. Preencha os 36 poços restantes com DMEM puro. Incube as placas a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de CO2 durante a noite.No dia seguinte, preparar diluições seriadas dos compostos e o controle positivo em placas transparentes autoclavadas de polipropileno. Comece com os estoques em DMSO e dilua com DMEM, mas não exceda 1% de volume de DMSO na concentração final mais alta. Para evitar a fotoisomerização descontrolada dos compostos estudados, apague as luzes do gabinete estéril.Transfira 100 microlitros das diluições para 56 poços com 100 microlitros de DMEM previamente adicionado para atingir a concentração final necessária dos compostos nos poços, tipicamente dentro da faixa de cinco a 150 micromolares. Em seguida, adicione 100 microlitros de DMEM a quatro poços, que servem como controle negativo. Cubra as placas com papel alumínio ou uma tampa plástica não transparente para evitar a troca descontrolada de fotos.Coloque as placas em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius para o tempo de incubação escolhido. Após as incubações, adicionar 50 microlitros de solução corante por poço às placas. Utilizar cinco micromolares Hoechst 33342 e iodeto de propídio de um micromolar como soluções finais de coloração para este experimento.Incubar novamente a 37 graus Celsius por 20 minutos. Realize imagens de fluorescência automatizadas usando uma lente objetiva de aumento de 20X. As operações de laboratório para esta parte do método são idênticas às descritas para o experimento 2D: preparação da cultura celular, incubação com os compostos testados e geração de imagens.No entanto, neste caso, as células são preparadas como esferoides compactos e maduros em uma placa de fundo em U de 384 poços, ultrabaixa adesão, com paredes pretas e não transparentes. O uso de uma placa desse tamanho permite que dois compostos sejam comparados em um experimento. Neste experimento, utilizou-se adicionalmente a calceína AM como terceiro componente da solução corante multicolorida.As imagens obtidas nos experimentos 2D e 3D são analisadas utilizando-se o software automatizado de análise de imagens dos instrumentos. As células que usam os corantes Hoechst e iodeto de propídio são consideradas necroticamente mortas, e sua fração em função da concentração é usada para calcular o valor de IC50. Montar o trem óptico para a irradiação da amostra.Consiste em um cabo óptico da fonte de luz laser, uma lente com uma distância focal variável, uma seringa com uma tampa não transparente e uma extremidade de corte plana. Todas as operações subsequentes devem ser realizadas em uma sala escura com iluminação mínima do local de trabalho. Preparar uma amostra de tecido modelo carregada com os compostos fotoformais inativos.Em uma corrida típica, cinco gramas de carne de porco picada fresca são misturados mecanicamente com a solução PBS do composto para atingir a concentração final de 50 miligramas por quilograma. Encha a seringa com a amostra carregada. Irradiar a amostra no comboio óptico durante a exposição necessária e o tempo de dosagem de luz.Após a exposição, faça cortes de quatro milímetros de espessura da amostra empurrando a massa para fora da seringa com o pistão e cortando-a com um bisturi. Pesar e extrair o composto com acetonitrila, água, mistura de TFA, 70% acetonitrila e 01% ácido trifluoroacético em um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro. Centrifugar a 20XG por 30 minutos duas vezes para remover o material insolúvel e coletar o sobrenadante.Registre cromatogramas detectados por UV na detecção de 570 nanômetros de sua forma fechada e detecção de 270 nanômetros da forma aberta em anel. Utilizar as amostras de controlo não irradiadas e irradiadas preparadas de forma semelhante às soluções-mãe nas experiências celulares para determinar os tempos de retenção específicos e calibrar o método. Repetir o experimento três vezes e plotar a porcentagem normalizada de cada fotoforma na parcela, porcentagem versus distância da superfície do tecido irradiado.No dia zero, inocular as fêmeas adultas de 6 camundongos C57 pretos pesando aproximadamente 20 gramas cada por via subcutânea com uma suspensão de cerca de meio milhão de células de carcinoma pulmonar de Lewis em aproximadamente 100 microlitros de DMEM e mistura de Matrigel na pata traseira direita. Esse procedimento é feito sob sedação com isoflurano a 5%. Os animais estão prontos para o tratamento nos dias cinco a oito, quando os tumores são palpáveis.Todas as operações que envolvam o teste devem ser realizadas em condições semiescuras. Esta condição também se aplica ao tratar os animais após receberem a dose composta por um período de dois dias. Montar aleatoriamente quatro grupos de oito animais, e remover a pele da área do tumor.Os dois grupos de controle recebem uma injeção intravenosa do veículo. 100 microlitros de solução salina por animal de 20 gramas, e os animais dos dois grupos experimentais receberam o composto testado na fotoforma inativa em solução de um miligrama por mililitro de solução salina. Administrar o bolus composto na veia da cauda a cinco mililitros por quilo.Duas horas e 45 minutos após a injeção do composto, irradiar a área tumoral por 20 minutos sob anestesia com isoflurano com laser de 650 nanômetros, utilizando densidade de potência luminosa de 100 miliwatts por centímetro quadrado. Observe cuidadosamente as condições dos animais nos próximos 30 minutos. Observe os animais diariamente, e meça seu peso e as dimensões de seus tumores.Medir os volumes do tumor e observar a progressão da necrose. Determine a taxa de sobrevivência usando o procedimento padrão. Os resultados do nosso protocolo para a primeira etapa no caso de experimentos de cultura de células 2D podem ser apresentados como imagens, como ilustrado aqui em uma imagem representativa para células de carcinoma pulmonar de Lewis incubadas com LMB002 em diferentes concentrações e por diferentes períodos de incubação.Costaining com Hoechst e iodeto de propídio permite a visualização de núcleos celulares no canal azul, dando assim uma contagem total de células. Células com integridade da membrana plasmática comprometida foram observadas no canal vermelho. Supondo que este último esteja necroticamente morto, a citotoxicidade aparente de um composto em estudo pode ser quantificada como uma porcentagem das células positivas para iodeto de propídio.Os resultados da quantificação dos dados obtidos por meio da análise automatizada de imagens são apresentados aqui. Para LMB002, dependências sigmoidais da porcentagem de células positivas para iodeto de propídio na concentração do composto podem ser observadas. A partir desses dados, os valores de IC50 podem ser determinados.Nosso experimento revelou que a forma aberta do LMB002 é cerca de uma etapa de diluição menos tóxica que o peptídeo protótipo, Gramicidin S, enquanto a forma fechada demonstra três a quatro etapas de diluição menor toxicidade, que aumenta com o tempo de incubação. Os experimentos com células 3D produziram o mesmo tipo de dados brutos, as imagens esferoides resolvidas uma por parede. A inclusão da calceína como terceiro corante permite quantificar a fração de células metabolicamente ativas observadas no canal verde.As curvas de efeito de dose, como as do experimento 2D, foram obtidas a partir das pilhas de imagens Z-stack. O Painel A ilustra tais curvas, corroborando os resultados 2D. Como mostrado no painel B, o diâmetro total do esferoide varia com a concentração do composto.O experimento para a segunda etapa permite a determinação das concentrações de LMB002 em ambas as fotoformas usando cromatografia líquida de alta eficiência detectada por UV. Ambas as fotoformas foram suficientemente diferentes nos tempos de retenção e absorbância, mostradas integradas nos painéis A e B da figura. Os dados obtidos estão resumidos na figura, confirmando que nossa fonte de luz vermelha induz a fotoconversão LMB002 fechada em anel a uma profundidade de até um centímetro na carne picada a aproximadamente 103 miliwatts por centímetro quadrado.Os resultados do experimento in vivo, etapa três de nossa metodologia, foram representados por gráficos mostrando o crescimento tumoral em função do tempo nas curvas de sobrevida de Kaplan-Meier. A estratégia aqui representada para avaliar candidatos a fármacos fotocomutáveis é prática e adequada para compostos com fotointerruptores do tipo diarileteno. Na primeira etapa, a quantificação da citotoxicidade pode ser utilizada para a triagem inicial das bibliotecas dos compostos fotocontrolados.Segundo passo, a avaliação da eficiência do fotoswitching é fácil de configurar e ética. Não requer animais vivos. Etapa três, modelos de fotofarmacologia in vivo, a terapia pode ser aplicada em pequenos animais.

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